P53基因突变检测方法

2、试剂和耗材

QIAamp®DNA Blood Mini Kit（GIAGEN，德国)

Platinum®Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen,11304-102）

Nuclease-Free Water (Promega,P1195)

d NTP Mix (Promega,P151B)

PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成

DNA分子定量标准：DL10000 DNA Marker(TAKARA,大连宝生物)

PCR产物回收纯化试剂盒（BioSpin Gel Extraction kit，日本Bioer技术有限公司）

0.5~10 μl、2~20 μl、20~200 μl、200~1000 μl吸头（美国Axygen，公司）

EP管

3、仪器

Tannon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司）；

Eppendorf 5417R高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）

Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter公司，美国）

MVS-1型涡旋混合器（北京北德科学仪器厂）

移液器2 μl、10 μl、50 μl、200 μl、1000μl（Eppendorf公司，德国）Ⅱ级生物安全柜NU425-400E（NEWAIR公司，美国）

X-15R高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER公司，美国）

Eppendorf Mastercycter PCR仪（Eppendorf 公司德国）

电泳仪：Universal 024BR（Bio-Rad公司，美国）

电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司）

凝胶成像分析系统：Tocan 240全自动凝胶成像系统（中国）

测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP（BECKMAN COULTER公司，美国）20μl、200μl和1000μl加样器（吉尔森公司，法国）

旋涡震荡器（Scientific Industries公司，美国）

二、实验方法

1、样品采集，送检和保存

乙二胺四乙酸（EDTA）-3K抗凝管采集HIV和HBV合并感染者外周静脉血，于24 h内测定CD4+T淋巴细胞计数，抗凝血经常规离心分离全血中间层，分装后-80℃冻存用于P53基因变异的测定。

2、血浆样本DNA的提取

取200 μl全血中间层于1.5ml 无菌EP管中，加入20μl蛋白酶K；再加入200μl AL缓冲液，涡旋振荡15秒，56℃孵育10分钟；瞬时离心EP管，加入200μl无水乙醇，涡旋振荡15秒，再瞬时离心收集管壁残液；将上述混合液加入到QIAMP离心柱中，6000g离心1分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管，注意不要让离心柱沾染废液；离心柱中加入500μl缓冲液AW1，6000g离心1分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管；离心柱中加入500μl缓冲液AW2，20000g 离心3分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管；20000g离心1分钟，弃去含废液的收集管，将离心柱插入1.5ml无菌EP管中，在离心柱中加入200μl 洗脱液AE（事先预热至70℃），室温孵育1分钟后，6000g离心1分钟，EP管中收集的即为目标DNA；0.7%TAE-琼脂糖凝胶电泳，验证DNA 提取质量，-20℃保存备用。

3、PCR扩增P53序列

使用引物如下：

名称方向核苷酸组成

Primer15’外侧cttgccacaggtctccccaa

Primer23’外侧aggggtcagaggcaagcaga

反应体系（50ul）

组分体积（μl）

10×PCR 反应缓冲液5

dNTP（2.5mM）5

Primer1-forward (20uM )1

Primer2-reverse (20uM )1

Promega Taq (5U/μl) 0.5

DNase/RNase free water32.5

提取的DNA5

Total volume50

PCR反应条件：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，28个循环；

4、PCR反应产物纯化

取终产物5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙啶0.5μg/ml) ，100V电泳40 min，经Ultra-Violet Product 凝胶成像后与marker比对，确认所需片段250bp，用QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。

5、PCR反应产物测序

将PCR 反应产物切胶回收，使用BECKMAN 公司的GEXP系统测序GenomeLab CEQ/GeXP遗传分析系统测序分析实验步骤：Ⅱ1，配置测序PCR反应试剂：

总体积20ul 10ul

纯水(补足至总体积) 0-9.5ul 0-3.5ul

模板(用量见附表) 0.5-10ul 0.5-4ul

引物(5pmol/ul) 1ul 1ul

DTCS Mix 8ul 4ul

质粒DNA模板的热处理: (线性DNA模板,如果为PCR产物无需加热)；在热循环仪上加

热DNA模板和水: 96°C 1-3Min；自然凉到室温后再加入其它组分；

Ⅱ2，热循环反应，程序如下：

1、96°C 20sec

2、50°C 20sec

3、60°C 4min Back to step 1, for 30 cycles.

4、4°C Holding

Ⅱ3、终止反应

a, 按照NaOAC：EDTA：Glycogen = 1：1：0.5准备测序反应终止液（即用即配，低温放置）；

b, 取出测序反应产物，稍微离心；按照2.5ul/10ul向测序反应产物加入反应终止液。

Ⅱ4、乙醇沉淀

a, 每个反应管中加入30ul 95%冰乙醇/10ul Reaction；轻混匀，离心（4°C，14000rcf，15min），去上清；

b, 加100ul 70%冰乙醇洗脱残留盐，离心（4°C，12000rcf，5min）,去上清；

c, 再次加100ul 70%冰乙醇洗脱残留的盐，离心（4°C，12000rcf，5min），去上清；d, 低速离心10S，用Tip头吸干残留液体，37°C避光干燥，3~5 Min。

e, 在每个样品管中加入20ul SLS, 反复吹打DNA沉淀（10-20次），静置3min，稍微离心；

Ⅱ5、CEQ上样

a, 小心转移样品至CEQ 样品板(不要出现气泡), 加一滴石蜡油覆盖样品；

b, 在缓冲液板孔内加入3/4体积的测序缓冲液；

上机进行测序反应

ABI 3500测序

一、实验试剂和耗材准备：

（一）实验试剂：纯化好的PCR产物，测序引物，Bigdye v3.1, ddH

O，POP7

2胶，

Sequence Standard(3130), 5×Buffer, HiDi

（二）实验耗材：96孔板，0.2EP管，移液枪，计时器，记号笔

二、实验操作具体步骤：

（一）测序反应体系（标准）：

DNA（35ng/ul） 6ul

引物（20pmol/ul）1ul

O 8ul

ddH

2

Bigdye 2ul

5×Buffer 3ul

总体积 20ul

测序PCR循环条件：