枯草芽孢杆菌的培养

菌种的培养

1.1材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌。

1.1.2 培养基

（1）LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH为7，（可溶性淀粉20g）琼脂20g。

（2）筛选用培养基：含有2%可溶性淀粉的LB培养基。

（3）种子培养基：豆饼粉4%，玉米粉3%，Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%，NH4Cl0.15%，H2O。

（4）发酵培养基：豆饼粉5.6%，玉米粉7.2%，Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%，NH4Cl0.13%，CaCl20.13%，α—淀粉酶50g。【2】

1.1.3 主要试剂

蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和氯化钙。

1.1.4 仪器设备

控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电子天平、pH测定仪、无菌操作台和紫外分光光度计。

1.2方法

1.2.1 培养基的制备

(1)称量

按培养基配比依次准确地称取酵母膏、NaCl、蛋白胨放入烧杯中，并在烧杯中加入少量蒸馏水。注：酵母膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，酵母膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片【3】。

(2)溶化

可溶性淀粉溶液的配制方法：将所需克数的可溶性淀粉放入一个小烧杯中，加入少量蒸馏水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均匀倒入少于培养基总体积的沸水中，一边搅拌一边加热，待其溶化成透明状后继续在电炉上加热5分即制成可溶性淀粉溶液。

如果配制固体培养基时，将已准备好的可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，补水到所需的总体积。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按2%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间【4】。

在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不能用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。

(3)调pH

培养基配好以后，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直到pH达7为止；反之，用1mol/LHCl进行调节。

对于有些要求pH较精细的微生物，其pH的调节可用酸度计进行【5】。

注意：pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度，配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。

(4)分装

按照实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶中。

液体分装：分装的高度以试管高度的1/4左右为宜；分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶的一半为宜。

固体分装：分装于试管中的应不超过试管的1/5，灭菌后制成斜面；分装三角瓶的量以不超过一半为宜。

(5)加塞

培养基分装完毕后，在试管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。

(6)包扎

加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，外边再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称，组别，配制日期。三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结扎好，使用时容易解开，同样注明。

(7)灭菌

将配置好且包扎完毕的固体、液体培养基及本实验涉及的试管、三角瓶等及400ml 纯水于高压灭菌器中以0.14Mpa，121℃条件下高压蒸汽灭菌20分钟。

(8)斜面搁置

将培养基冷却至50℃左右时放置斜面，斜面在试管的1/2处为宜，待斜面凝固后，放置于冰箱中待用。

1.2.2菌种的筛选与保藏

(1)倒平板

将实验配制好的培养基加热溶化，待冷却至55—60℃时，倒平板9皿【6】。

(2)稀释

用接种环取菌种，放入盛90ml无菌水的三角瓶中，振摇。用一支1ml无菌吸管吸取1ml菌液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的菌液。

(3)划线

将平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5、10-6三种稀释度（共三组）然后用接种环分别沾取浓度为10-4、10-5、10-6稀释液并对号在相应平板上划线，室温下静止5—10min，使菌液吸附进培养基。

(4)培养

将培养基平板倒置于37℃的培养箱中，培养2—3天，观察淀粉圈。对有淀粉圈的菌落，测量淀粉圈的直径D，菌落直径r，计算D/r的比值，可进行拍照，选择淀粉圈较大的菌落作为后续实验的菌种【7】。

(5)接种

接种到斜面培养基中，标注上日期等信息。放入恒温培养箱中培养作为一级种子。

(6)保藏

斜面置于37℃的培养箱中，培养2—3天，观察菌种长势好坏，若菌种长势好则将其放入冰箱中保藏，若长势不好则需多次斜面转接。