鸡胚接种技术

鸡胚就会产生对立克次体和衣原体感染的抵抗。
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第一节 鸡胚的结构与生理
鸡胚是由三个胚层发育起来的， 即外胚层、中胚层和内胚层， 它们构成胚胎的组织与器官。
（约10日龄鸡胚的结构见图）
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卵壳与壳膜
卵壳位于最外层的坚硬壳层； 壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子 交换，因此培养鸡胚需一定的湿度和气体。
第二节 鸡胚的孵育和检查
受精鸡卵的供给
— 没有受到病毒和细菌的污染如新城鸡瘟病 毒、布氏杆菌等；
— 培养立克次体和衣原体，不能来自食用抗 生素的鸡群。
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鸡胚的孵育
— 温度为38～39℃； — 湿度为40％-70％； — 翻蛋：防止蛋白粘连，促进羊膜运动和空
气流通； — 通风：排出CO2和吸入O2。
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接种步骤与方法
取9~11日龄的鸡胚，标记气室与胚胎位置，并在胚胎面 与气室交界之边缘上约1mm处避开血管作一标记，此即为 注射点。
将鸡胚竖放在卵杯上，钝端向上。消毒气室的蛋壳，用 开孔器钻开一长约2mm小口。
再次消毒钻孔区，接种病毒液0.1～0.2ml，将针头刺入 孔内，经尿囊膜入尿囊腔，注入病毒液。
消毒后用石蜡溶化封孔，于33～35℃孵卵器孵育48～ 72h，；于接种后24h内死亡者为非特异性死胚应弃去。
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尿囊腔接种法
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解剖与收获
接种后收获病毒的时间根据不同病毒而异，甲型流感病 毒一般培养44～48h，乙型流感病毒培养72h。
第二章 鸡胚接种技术
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一、概况
1911年Rous和Murphy首先应用鸡胚培养 研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。
1938年Goodpasture和Burnet等应用鸡胚 繁殖病毒、Cox应用卵黄囊培养立克次体。
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鸡胚培养法的优点：
鸡胚的组织分化程度低，可选择适当途 径接种，病毒易复制，感染病毒的膜和 液体含大量病毒。
用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头紧按气室小孔向外吸 气，此时盐水小滴即可自裂隙流至绒毛尿囊膜上，从而使绒毛尿囊 膜下陷而形成人工气室。
在卵壳的窗口滴0.05~0.1ml病毒液于绒毛尿囊膜上，然后将旋转鸡胚 使接种物扩散到整个绒毛膜尿囊膜上。
在卵壳的窗口周围涂石蜡，用消毒胶布封口。将鸡胚保持人工气室 在上的位置，33~35℃继续培养48～72h。
气室
功能主要是呼吸和调节压力。
绒毛尿囊膜
壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官。
羊膜
胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中。
尿囊腔
位于绒毛尿囊腔和羊膜之间 ，胚胎排泄器 官含5－20ml尿囊液，含大量的尿酸盐， 为减少沉淀，盐水稀释再4℃保存。
卵黄囊
主要营养的储藏场所，为胚胎提供营养。
卵白
外于卵的锐端，为胚胎发育晚期提供营养。
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接种步骤与方法
将孵育l0~13日龄的鸡胚标记气室、胎位，于与胚胎略近气室端卵壳 上划一等边三角形。
消毒气室顶端及记号处，用开孔器在记号处的卵壳上开一三角形裂 痕，不可弄破下面的壳膜，同时在气室顶端钻一小孔。
轻轻揭去卵壳，露出壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖循卵 壳膜纤维方向划破一隙，勿伤及紧贴的绒毛尿囊膜。
膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便 观察胚胎的位置。 将注射器刺向胚胎的腭下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入 羊膜腔内时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入O.1～ 0.2ml病毒液。 拔出针头，孔区消毒后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳 的窗口封住，于33～35℃孵育48～72h，要保持鸡胚钝端朝上。
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第三节 鸡胚接种途径及方法 （一）羊膜腔接种
应用于从临床材料中分离流感病毒等，病 毒感染后可收集羊水和尿囊液。
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接种步骤与方法
将10~12日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。 消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻出一约10mm×6mm的长方形
裂痕，注意勿钻破壳膜。 再次消毒钻孔区后，用灭菌的小镊子除去长方形卵壳和外层壳
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检卵
— 血管：活胚可见清晰的血管，有时可见血 管搏动，死胚血管模糊成淤血带或淤血块。
— 胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其在 转动胚胎时，死胚见不到任何胎动，胚胎 发红像出血样，有的呈现黑块。
— 绒毛尿囊膜发育界限：发育好的鸡胚可见 密布丰满的血管网，也就是绒毛尿囊膜， 死胚则见不到这一现象。
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（二）绒毛尿囊膜接种
常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒 的分离，因为这些病毒在绒毛尿囊膜上可形 成肉眼可见的斑点状或痘疱状病灶。
另外，病毒可在绒毛尿囊膜上进行滴定，因 为感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑 和痘的数目来计算。该方法还可用于抗病毒 血清的滴定试验，即在有抗体存在的情况下， 痘疱形成受到抑制。
鸡胚是一整体，有神经血管的分布及脏 器的构造。
来源充足，操作简单，通常是无菌的， 对接种的病毒不产生抗体。
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鸡胚培养法的缺点：
一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指征。 卵黄中常常含有抗家禽病原体的母体抗体。 某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传递
到鸡胚。 通常鸡胚含有白血病病Biblioteka Baidu。 在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡胚，
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羊膜腔接种法
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解剖与收获
收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，但不能放置时间 过长(过长会引起散黄)。如急于收获亦可置-20℃冰 箱lh左右。
预冷的目的是，将鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获 时流出红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病 毒滴度下降。
病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过 少时，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。
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绒毛尿囊膜接种法
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解剖与收获
用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入 加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病 灶形状或用于传代，或用50％甘油保存。 同时作无菌培养。
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（三）尿囊腔接种
广泛应用于流感病毒、流行性腮腺炎病 毒和新城疫病毒的适应和传代培养，这 些病毒被接种到尿囊腔后，可在内皮细 胞中复制，复制的病毒被释放到尿囊液 中，因此，在尿囊液中含有大量的病毒。