恶性髓系血液肿瘤基因突变检查临床意义-陆道培血液肿瘤中心血液科主任童春容

恶性髓系肿瘤基因突变检查的临床意义
陆道培血液•肿瘤中心童春容
对恶性血液病的诊断与分型，目前专家的共识是应采用MICM的整合诊断方法，也就是联合形态学、免疫学、染色体、基因分析来诊断与分型，以达到更全面准确的诊断、指导精确治疗的目的。

我中心既往已经可以筛查100多种急性白血病的融合基因，并能检测一些恶性血液病的突变基因，基因突变包括基因丢失、新基因插入或被替代等。

既往的研究显示，40%多的急性白血病有白血病特异的融合基因。

恶性血液病是多种基因异常或突变的结果，我中心最近成功采用基因测序方法筛查数十种基因突变，与既往的方法比较，可以检测以上基因的全部突变位点，提高了基因突变的检出率。

如NPM1有40多种突变位点，既往的方法只能检测其中最常见的10种突变位点，而目前的方法可检测几乎NPM1的全部突变位点。

基因突变的筛查有以下临床意义。

一帮助诊断恶性血液病
一些恶性血液病，尤其是骨髓增殖性肿瘤(MPN)、骨髓增生异常综合征(MDS)、MDS/MPN综合征等，没有特异性的免疫学、染色体或融合基因异常，在早期时主要表现为血液细胞轻度升高或降低，难以与再生障碍性贫血、类白血病反应等良性疾病鉴别。

既往诊断主要靠排除多种疾病，并需要较长时间的观察才能诊断。

几乎所有恶性血液肿瘤都能检查到某种或多种基因突变，因此当具有髓系恶性肿瘤的临床表现及一些实验室特征时，相关基因突变阳性对这些疾病的诊断有重要意义，基因突变检查可明显提高恶性血液肿瘤的准确率及速度。

还有一些髓外恶性血液病，由于组织标本少，其它方法难以有足够标本诊断；或治疗获得完全缓解后来到我院，怀疑既往的诊断。

因此我们发展了用骨髓/血涂片、组织切片等少量标本做几十种基因突变检查的方法，对于这些患者可以用治疗前做其它检查留存的标本（骨髓涂片、血液涂片、组织切片等）来检测恶性血液病的基因突变，从而帮助进一步确定恶性血液病的诊断及预后，并帮助治疗选择。

1JAK2（包括V617F和Exon12）基因突变在髓系恶性肿瘤诊断中的价值JAK2基因突变可见于多种MPN及其它恶性血液病。

JAK2 V617F突变见于约95%的真性红细胞增多症（PV）, JAK2 Exon12突变见于2-5%的PV，实际上全部的PV 患者都有JAK2的激活性突变。

JAK2 V617F突变见于50-60%的原发性血小板增多症(ET)或原发性骨髓纤维化（PMF），50-80%的伴铁粒幼红细胞及血小板增多的难治性贫血（RARS-T）有JAK2 V617F突变。

但是其它一些恶性血液病也可伴 JAK2 V617F基因突变，如见于8%的慢性粒单核细胞白血病，还可偶见于少数急性髓性白血病（AML）、MDS、慢性髓性白血
病。

2 研究显示，70%的青少年型慢性粒单核细胞白血病（JMML）有累及GM-CSF信号传导途径的突变，如NRAS、KRAS、PTPN11、CBL等。

Meggendorfer M等（2012）对275例CMML分析了SRSF2、ASXL1、CBL、EZH2、JAK2 V617F、KRAS、NRAS、RUNX1、TET2 基因突变。

发现93% 的CMML至少有一种基因突变，47% (129/275)的患者有SRSF2基因突变，其中120例为SRSF2 Pro95突变。

3 近年的研究发现以下基因突变常见于MDS: TET2、ASXL1、DNMT3A、EZH2、SRSF2、SF3B1、IDH1、IDH2、U2AF1、ZRSR2。

在MDS患者中，以下基因突变发生率分别为：TET2 20.5-25%，DNMT3A 3-13%，ASXL1 14.4-20.7%，EZH2 6.4-12%，IDH1/2 4-12%，SF3B1见于6-18% 非环形铁幼细胞性难治性贫血-MDS（RS-MDS）、57-75.3%的RS-MDS, SRSF2 1.5-11.6%, U2AF1 8-12%, ZRSR2 1.4-8.0%。

U2AF1基因突变多见于ASXL1突变或20q-染色体异常的MDS患者。

4 ASXL1基因突变见于MDS、CMML、AML 等髓系肿瘤患者，更多见于CMML；见于38-43%的MDS/MPN 综合征，2-10%的前列腺癌。

二提供预后指标
临床指标、染色体、融合基因、免疫标志都具有良好的预后价值。

染色体具有独立的预后价值。

但是仍有一些患者用目前的预后指标不能准确预测化疗等治疗的效果，AML中仅40-50%患者有染色体异常。

基因突变对这部分患者可进一步提供预后指标。

但临床医生要注意恶性肿瘤是多个基因突变引起的，每个患者可有多个基因突变，不同突变之间可以相互作用，因此分析基因突变时要综合判断。

基因突变的预后意义还与突变的位点有关，因此还要了解不同突变位点的意义。

1染色体联合基因突变对AML进行整合的预后分型
最近美国东部癌症协作组ECOG E1900研究采用高通量基因测序方法检测了657例17-60岁自发AML的TET2、ASXL1、DNMT3A、PHF6、WT1、TP53、RUNX1、EZH2 PTEN、FLT3、NPM1、CEBPA、HRAS、KRAS、NRAS、KIT、IDH1、IDH2基因突变。

联合染色体异常，提出了整合的危险分层指标（表1），97.3%的AML至少有一种基因突变。

在染色体基础上，基因突变可以进一步使预后分型更为精确，而与初发病时的年龄、白细胞计数、诱导药物的剂量、缓解后的治疗关系不大。

根据染色体及基因突变可将AML按预后的好坏分成以下几组。

(1) 高危组：3年总存活率（OS）<20%
●FLT3-ITD基因突变同时合并以下指标至少一种：TET2、DNMT3A、MLL-PTD突
变或+8染色体异常，3年总生存率为14.5%。

约47%的FLT3-ITD突变AML为此类极高危患者。

●无FLT3-ITD突变，但有TET2、ASXL1、PHF6和/或MLL-PTD突变。

●有预后不良染色体。

(2) 预后最好组：3年OS >80%
染色体正常且无FLT3-ITD基因突变，但有NPM1+及IDH1或IDH2突变者的预后最好，比预后良好染色体AML（t(8;21)/AML1-ETO+或inv16/CBFB-MYH11+）的OS更高。

(3) 预后良好组: 3年OS >50%。

无KIT基因突变的t(8;21)/AML1-ETO+或inv16/CBFB-MYH11+AML。

(4)预后中等：无高危或低危染色体及基因突变者，3年OS 40%左右。

图1：不同预后组的生存概率（摘自：Patel JP, 2012）
表1：染色体预后分组及整合后的预后分组（摘自：Patel JP, 2012）
ECOG 染色体预后分组：良好：t(15;17)，t(8;21)(q22;q22)但无del(9q)，inv(16)(p13.q26)
t(16;16)(p13.q26)；中等：正常、+6、+8、-Y、12p-；差：累及3q、9q、11q、21q、17p、-5、5q-、-7, 7q-、T(6;9)、T(9;22)、≥3个染色体异常。

图2：多参数分析不同基因突变预后组的生存率（摘自：Patel JP, 2012）
图3：染色体及整合预后组生存率的比较（摘自：Patel JP, 2012）
2Fernandez-Mercado M 等（2012）报告17/19例发展为AML的MDS或慢性粒单核细胞白血病（CMML）患者至少有ASXL1、TET2、IDH1、IDH2中一种基因突变。

3ASXL1、EZH2突变是MDS独立的预后不良指标。

几份研究显示，SF3B1突变的环形铁粒幼细胞难治性贫血（RARS）预后比无SF3B1突变者预后好。

SRSF2突变多见于原始细胞过多性难治性贫血，至少两份研究显示其预后不良。

有DNMT3A突变的MDS更容易发展为AML。

Mayo Clinic的研究显示，IDH2 R140 突变者与MDS生存期及发展为AML的概率无关，但是其它等位基因的突变预后差。

三帮助选择治疗方案或途径
4FLT3-ITD突变阳性的难治AML患者可用索拉菲尼、苏坦等靶向治疗药物暂时获得完全缓解或部分缓解，为移植创造好的条件。

5有KIT基因突变者用格列卫等酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗有一定的疗效，应用降低白血病负荷后再移植可提高移植的成功率。

6DNA的甲基化异常多见于髓系恶性肿瘤，尤其是MDS、AML，通过分离染色质与CpG岛甲基化的异常以灭活肿瘤抑制基因、激活原癌基因。

表观基因异常通过基因的去甲基化或影响小RNA的机制导致恶性疾病的发生。

表观遗传学基因突变还可能是基因不稳定的原因，治疗后易诱发FLT3-ITD突变，导致白血病耐药复发（Wakita S等，2012）。

表观调节基因TET2、IDH1、IDH2、DNMT3A、ASXL1等突变，MLL基因突变可采用甲基化抑制剂(5氮杂胞苷、地西它滨)及组
蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂治疗，对部分MDS、AML有效，尤其是TET2基因突变者用5氮杂胞苷疗效好。

7伴NRAS或KRAS基因突变的AML患者可从大剂量AraC化疗获益。

8大剂量柔红霉素(90mg/m2)可改善DNMT3A 突变、NPM1基因突变、MLL融合基因AML的预后。

在ECOG E1900研究中，NPM1突变或DNMT3A突变或MLL易位占44.2% ，采用大剂量柔红霉素诱导缓解治疗，3年OS从25%提高到44%(见图3)。

最近一份研究显示，对DNMT3A exon 23突变的患者，采用去甲氧柔红霉素12 mg/m2的疗效同大剂量柔红霉素。

9以下基因突变可能用全反式维甲酸(ATRA)治疗获益:FLT3-ITD、NPM1、CEBPA、MLL基因易位。

10伴JAK基因突变的恶性血液病可从JAK基因拮抗剂治疗获益。

图4：柔红霉素剂量对DNMT3、NPM突变及MLL易位AML疗效的影响（摘自：Patel JP, 2012）
11NPM1突变：正在进行临床试验以了解干扰NPM1定位的药物如喜树碱、5-氟尿嘧啶、放线菌素D对NPM1突变白血病的疗效。

12最近CALGB的研究显示，MLL-PTD突变的AML缓解后的强化治疗可改善患者的长期生存率。

13Fernandez-Mercado M等（2012）报告17/19例要发展为AML的 MDS或慢性粒单核细胞白血病（CMML）至少有ASXL1、TET2、IDH1、IDH2中一种基因突变。

四增加追踪微小残留白血病（MRD）的指标
基因定量是最敏感的MRD监测指标，其敏感性可达到1/10万-1/100万，也就是说在十万个细胞中有一个恶性血液细胞都可能用基因定量检测出来。

我们多年的临床实践显示，用最敏感的实时定量PCR检测患者的白血病基因,如果在治疗后从阳性转为阴性，治愈率明显提高。

既往我们主要筛查急性白血病的融合基因并定量监测其疗效，但仅40%多的急性白血病有特异性融合基因，因此对大多数白血病患者难以用基因定量监测白血病。

由于融合基因检测的是RNA，我们不能回顾分析既往的标本。

治疗达到完全缓解后来我院筛查融合基因，阳性率降至15%左右。

绝大多数恶性血液病都有基因突变，用治疗前的标本如骨髓涂片、血液涂片、组织切片等也可以检测恶性血液病的基因突变，以后再对突变的基因定量监测，可大大提高基因监测微小残留白血病的覆盖率，以帮助判断疗效，帮助治疗决策。

五复发机制的探讨
最近一份研究对8例AML初诊及复发时的标本进行全基因组测序，发现有两种不同的复发形式：5/8例患者为：在初诊时有一个主要克隆，多个亚克隆，复发时某一亚克隆成为主要克隆，且携带有附加的基因突变；另3例是初诊时的克隆获得更多基因突变后复发。

六以上各个基因突变的意义详述
1ASXL1
ASXL1突变见于MDS、CMML、AML等髓系肿瘤患者，更多见于CMML。

老年AML 的ASXL1突变阳性率明显高于年青患者，分别为16%和3-5%。

ASXL1突变见于14.4-20.7% 的MDS、38%-43%的MDS/MPN综合征、2%-10%的前列腺癌。

ASXL1是MDS独立的预后不良指标。

2CEBPA
仅见于AML，占AML的6～15%，占染色体正常AML的15～18%。

3DNMT3A
DNMT3A蛋白是一种甲基转移酶，其基因位于染色体2p23.3。

DNMT3A突变导致DNA甲基化异常，与MDS 及AML的发病有关。

约20%的AML有DNMT3A突变（Ribeiro AF等，2012），是自发AML中第二常见的基因突变。

约3-8%的MDS 可检测到DNMT3A基因突变，频率分布与MDS 亚型无关，但是多见于老年患者，有DNMT3A突变的MDS更容易发展为AML，生存期较短。

4EZH2
2010年首先报告在弥漫大B细胞淋巴瘤发现EZH2突变。

最近2份研究显示，在MDS、MDS/MPN综合征、原发性骨髓纤维化检查出EZH2突变，见于6.4-12% 的自发性MDS。

EZH2突变是MDS的独立预后不良指标，生存率低，但是很少发生AML。

5FLT3
FLT3是AML中最常见的突变基因，见于20～40%的AML患者，最常见于t(6;9)(p23;q34)异常、APL及染色体正常的AML患者。

FLT3突变主要分两种，一种是内部连续重复序列突变（FLT3-ITD），占75～80%；另一种是累及第二酪氨酸激酶区（TKD）的835或836密码子（FLT3-TKD），占20～35%。

很多研究显示FLT3-ITD是染色体正常AML独立的预后不良因素，但对有预后良好或预后差染色体AML患者的预后没有影响（Santos FP，2010）。

FLT3-TKD 突变的临床意义尚不一致。

6IDH1/IDH2
约15%-30% 的AML，4-12%的MDS有IDH1或IDH2基因突变，老年患者多见。

IDH基因突变导致细胞高甲基化、造血干细胞扩增，分化受阻。

Mayo Clinic 的研究显示，IDH2 R140 突变者与MDS生存期及发展为AML的概率无关，但是其它等位基因的突变预后差。

7KIT
对以前分类为预后良好的AML 伴t（8;21)(q22;q22)或Inv(16)(p13.1q22) 或t(16;16)(p13.1;q22) 患者来说，伴KIT基因突变使其预后变差。

但KIT 基因突变者用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗有效，可用TKI降低白血病负荷后移植。

8MLL-PTD
MLL部分基因重复序列复制,在5～10%染色体正常或可见于约10%正常核型AML及90%伴11q23异常的AML。

MLL-PTD的AML患者有30～40%合并FLT3-ITD。

9NPM1
NPM1是AML中最常见的突变基因。

约2～8%的儿童AML, 27～35%的成人AML 有NPM1基因突变。

在染色体正常的成人AML中，45～64%有NPM1基因突变。

多见于急性粒单核细胞型或单核细胞型白血病。

约80～90%的急性单核细胞型伴NPM1突变。

已报告有40种NPM1变异型突变。

约40%的NPM1突变患者伴有FLT3-ITD突变。

5-15%的NPM1突变患者伴有其它染色体异常，如+8、del(9q)，NPM1患者可伴三系造血细胞增生异常，其临床意义尚不太清楚。

10PHF6
PHF6位于X染色体，是一种性联肿瘤抑制基因，最初在T-ALL中发现。

约3% AML有PHF6基因突变。

11SF3B1
见于 75% 的RARS，比无此基因突变者预后良好。

12TET2
TET2基因位于4q24染色体上，与DNA的甲基化有关。

研究显示，TET2基因突变导致造血干细胞自我更新能力增强，分化能力受损。

其突变主要见于MDS、MPN等髓系肿瘤，约10%的AML有此基因突变，在染色体正常的AML，23% 有TET2基因突变。

TET2基因突变还见于19%-26%的MDS，58% 的MDS/MPN 综合征的患者。

最近法国MDS 研究协作组(GFM)报告5氮杂胞苷(AZA)治疗TET2突变的MDS患者的疗效好，有效率分别为82% vs 45%，TET2突变有独立的预测AZA疗效的作用。

13其它：
SRSF2, U2AF1, ZRSR2 突变更常见于自发MDS, 发生频率分别为1.5%-11.6%, 8%-12%, 1.4%-8.0%。

SRSF2 突变与高危险性MDS有关，更易转化为急性白血
病，生存期更短。