薄层色谱分离叶绿素
叶绿体色素的提取分离实验报告
叶绿体色素的提取分离、理化性质实验报告
第一部分提取与分离
一实验目的
学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法
二实验原理
叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿体a(C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H72O6N4Mg)、胡萝卜素(C40H56)和叶黄素(C40H56O2)与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离与鉴别。
薄层色谱分析法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层做固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上的逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱附、再吸附、再脱附……的过程。由于吸附剂的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。
三实验材料与试剂
1 新鲜的菠菜叶片
2 体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂(石油醚:丙酮:苯=7:5:1，体积比)
3 天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸
四实验步骤
(一)色素提取液的制备
1 取新鲜叶片4至5片(2g左右)，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入研钵中。
2 研钵中加入少量碳酸钙粉末，加2至3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加10至15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。提取液应避光保存。
薄层色谱法分离鉴定叶绿素
2. 叶绿体色素的提取：
称取1 g预处理过的大 叶黄杨叶片 剪细碎 量取30 mL提取剂(95%乙醇) 置于研钵
边加入提取剂 边快速 研磨叶片
通风橱中
用不锈钢网 得到提取液 滤去残渣
研磨约10 min
(1)提取液的粗提纯：
分液漏斗 15 mL石油醚 上步的提取液 静置30s 5 mL饱和食盐水 15 mL蒸馏水 得到 提取液 转入棕色瓶 中保存
实验122 薄层色谱法分离鉴定叶绿素
122.1 实验目的
(1) 掌握有机溶剂提取天然产物的原理和操作方法。
(2) 掌握薄层色谱法分离原理和实验技术。
122.2 实验原理
植物叶片中的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类， 主要包括叶绿素 a 、叶绿素b 、β- 胡萝卜素及叶黄素等四 种。 叶绿体色素是脂溶性色素，植物叶绿体色素通常可用 乙醇、丙酮等有机溶剂提取。在波长662 nm、644 nm测定 吸光值，可根据公式计算叶绿素a和叶绿素b的含量。通过
3. 叶绿体色素的分离:
(1) 硅胶G薄层板活化及层析液的制备：
硅胶G薄层 板活化
层析液的 制备
硅胶G薄 层板
100～120 ℃烘箱 烘30～60 min 轻轻 振荡
干燥箱中 保存 盖上层 析缸盖 静置 10～15 min
层析缸
10 mL丙酮︰石油醚 (2︰3)层析液
叶绿素和叶黄素的分离原理
叶绿素和叶黄素的分离原理
叶绿素和叶黄素是植物中两种重要的色素分子，它们在光合作用中起着关键作用。叶绿素是绿色素分子，吸收蓝光和红光的能量，并将其转化为化学能，用于光合作用的反应。而叶黄素则是黄色素，主要起到护色作用，吸收紫外光，保护植物免受光损伤。
叶绿素和叶黄素的分离可以通过多种方法实现，以下将介绍其中几种常用的分离原理。
1. 薄层色谱法（TLC）：
薄层色谱法是一种常用的色谱分离技术，通过涂覆在薄层板上的吸附剂（如硅胶或薄层板）对样品进行分离。当样品溶液在薄层板上上升时，叶绿素和叶黄素根据它们与吸附剂的亲和力不同而分离开来。之后，使用可见光或紫外线照射薄层板，叶绿素和叶黄素会显示出不同的色斑，可以通过对色斑的形状、颜色和强度进行观察和比较，确定叶绿素和叶黄素的分离情况。
2. 高效液相色谱法（HPLC）：
高效液相色谱法是一种基于溶液相交换和分配机理的色谱技术，常用于生物化学、生物技术和药学等领域。在HPLC中，样品通过一个液相柱，柱内填充有吸附剂，并通过流动相的推动进入柱内。由于叶绿素和叶黄素在化学结构上的差异，它们与柱内吸附剂的相亲性也不同，从而在柱内分离。通过检测流出柱的物质浓度或荧光信号，可以获得叶绿素和叶黄素的峰值，进而确定它们的分离情况。
3. 柱层析法：
柱层析法是一种常用的物质分离技术，通过利用样品的化学特性与填充在柱内的固定相的相亲性差异，将物质分离开来。对于叶绿素和叶黄素的分离，可以将柱内填充具有特殊结构和功能的吸附剂，如高分子凝胶、海胆骨架和金属螯合剂等，这些吸附剂具有不同的结构、吸附性质和选择性，可将叶绿素和叶黄素分离开来。柱层析法分离后的物质可以通过一系列分离和检测手段，如色谱检测、紫外吸收光谱和荧光检测等，确定分离的效果。
叶绿体色素的提取分离和理化性质实验报告
叶绿体色素的提取分离和理化性质实验报告
生物学导论实验报告
叶绿体色素的提取分离和理化性质
一、提取与分离
1、实验目的
学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2、实验原理
提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。
分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸附……的过程。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。
3、实验材料与试剂
（1）新鲜的菠菜叶；
（2）体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末、展开剂
（3）钵体、漏斗、三角瓶、剪刀、点样本、毛细管、层析缸、硅胶预制板、滤纸。
4、实验步骤
（1）色素提取液的制备
取叶4~5片新鲜叶片，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入钵体中。加入少量碳酸钙，加2~3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加入10ml乙醇，上清液过滤，残渣再用10ml乙醇冲洗过滤。
（2）叶绿体色素的分离
取硅胶预制板一个，用点样毛细管取上述提取液，平行于硅胶板
的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，风干，重复操作3~4次；
在干燥的层析缸中加入适量展开剂，高度0.5cm，将硅胶预制板带有色素一端放入，使其下端浸入展开剂中；
色谱法叶绿素分离实验PPT课件
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2．点样
普通板 点样基线----距底边2.0cm 圆点状---- R≤3mm 条带状-----宽度5～10mm
点或条带间距----＜8mm
点样量---- ＜10
高效板 点样基线----距底边0.8~1cm 圆点状---- R≤2mm 条带状-----宽度4～8mm
点或条带间距----＜5mm
（2）分离机制:吸附剂表面对不同组分吸附力的不同和流动相 对各组分的溶解能力（或称解吸能力、洗脱能力）的差异，最 终导致混合物中各组分流出色谱柱的先后顺序（或在色谱柱中 停留的时间即保留时间）不同而达到分离。 （3）应用:分离酸性及中性化合物 (如醇类和芳香烃等)
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2．吸附剂
（1）硅胶 (SiO2·X H2O)
(3）特点
消除系统误差， 值的重复性和可靠性都比 好
Rr
Rf
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3．分离度
（1)定义 衡量薄层色谱分离效果的重要指标，是 指相邻两斑点中心至原点的距离之差与 两斑点平均径向宽度（径向宽度是指斑 点沿着展开方向的宽度）的比值
(2）计算方法
R l2 l1 2(l2 l1 ) (W1 W2 ) / 2 W1 W2
10cm×20cm
2．载 板
金属箔
要求 表面光滑、平整清洁 玻板处理措施 清洁剂或铬酸洗液浸泡洗涤，用清水充分清洗，再用 蒸馏水或去离子水冲洗，表面应不附水珠，晾干备用
薄层色谱分离叶绿素
一实验目的
1．掌握提取叶绿素的方法；
2．了解薄层层析的原理，掌握薄层层析的一般操作和定性鉴定方法
二实验原理
1．叶绿素提取
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a
(C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡萝卜素(C40H56)和叶黄素
(C40H56O2)等4种。叶绿素a和叶绿素b为吡咯衍生物与金属镁的配合物，胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从植物叶片中提取出来，并通过萃取、沉淀和色谱方法将它们分离开来。
2．薄层色谱
薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。
薄层层析的器材选择：
（1）基板：玻璃、塑料、金属箔，常用玻璃板。
2）吸附剂：
吸附剂要有合适的吸附力，并且必须与展开剂和被吸附物质均不起化学反应。可用作吸附剂的物质很多，常用的有硅胶和氧化铝，由于吸附性好，适用于各类化合物的分离，应用最广。选择吸附剂时主要根据样品的溶解度、酸碱性及极性。氧化铝一般是微碱性吸附剂，适用于碱性物质及中性物质的分离；而硅胶是微酸性吸附剂，适用于酸性物质及中性物质的分离。以下简单介绍吸附剂的几个基本参数。
菠菜叶中叶绿素的提取和分离
1 实验 菠菜叶中叶绿素的提取和分离
一 实验目的
1．掌握从菠菜叶中提取叶绿素的方法；．掌握从菠菜叶中提取叶绿素的方法；
2．了解薄层层析的原理，掌握薄层层析的一般操作和定性鉴定方法．了解薄层层析的原理，掌握薄层层析的一般操作和定性鉴定方法
二 实验原理
1．叶绿素提取
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a (C 55H 72O 5N 4Mg)、叶绿素b(C 55H 70O 6N 4Mg)、
β—胡萝卜素(C 40H 56)和叶黄素(C 40H 56O 2)等4种。叶绿素a 和叶绿素b 为吡咯衍生物与金属镁的配合物，胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，与叶绿素同存在于植物体中，与叶绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从植物叶片中提取出来，并通过萃取、沉淀和色谱方法将它们分离开来。沉淀和色谱方法将它们分离开来。
R
R=H ；
叶黄素 R= OH
2．薄层色谱 薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温下显色，而且可在高温下显色，而且可在高温下显色，特别适用于挥发性小或在较高温特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。度下易发生反应的物质，同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。 薄层层析按分离机制不同可分为吸附层析、薄层层析按分离机制不同可分为吸附层析、分配层析、分配层析、离子交换层析等，离子交换层析等，最常用的为吸最常用的为吸附薄层层析，在此主要讨论。吸附层析中样品在薄层板上经过连续、吸附层析中样品在薄层板上经过连续、反复的被吸附刑吸附及反复的被吸附刑吸附及展开剂解吸附过程，由于不同的物质被吸附剂吸附的能力及被展开剂解吸附的能力不同，由于不同的物质被吸附剂吸附的能力及被展开剂解吸附的能力不同，放放在薄层上以不同速度移动而得以分离。通常用比移值(Rf)表示物质移动的相对距离：表示物质移动的相对距离：
叶绿素的提取和薄层色谱
叶绿素的提取和薄层色谱
植物光合作用是自然界最重要的现象，它是人类所利用能量的主要来源。在把光能转化为化学能的光合作用过程中，叶绿体色素起着重要的作用。高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、β−胡萝卜素和叶黄素四种。它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表12.1。
叶绿素(chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植物进行光合作用中吸收可见光，并将光能转变为化学能。叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。在绿
色植物中叶绿素主要以叶绿素a（C
55H
72
O
5
N
4
Mg）和叶绿素b（C
55
H
70
O
6
N
4
Mg）两种结
构相似的形式存在，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。叶绿素的基本结构见图47.1。在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环，它们由四个甲烯基联结成卟啉环，在卟啉环中央有一个镁原子，它以两个共价键和两个配位键与四个吡咯环的氮原子结合成内配盐，形成镁卟啉。在叶绿素分子中还
有两个羧基，其中一个与甲醇酯化成COOCH
3，另一个与叶绿醇酯化成COOC
20
H
39
长链。
类胡萝卜素(carotenoids)是一类不饱和的四萜类碳氢化合物（例如胡萝卜素，carotenes)，或它们的氧化衍生物（例如叶黄素类，xanthophylls)。所有
的类胡萝卜素均源于非环状的C
40H
56
结构。类胡萝卜素在强光下可防止叶绿素的光
氧化；在弱光下，可作为辅助色素吸收光能并传递给叶绿素分子。胡萝卜素有三种异构体，即α−、β−和γ−胡萝卜素，其中β−胡萝卜素含量最多，也最为重要。β−胡萝卜素还具有维生素A的生理活性，其结构是由两分子维生素A在端链
从菠菜中提取叶绿素实验报告
从菠菜中提取叶绿素实验报告
从菠菜中提取叶绿素实验报告1
【实验目的】
1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质的分离提纯与方法。
2、通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。
【实验原理】
叶绿色存在两种结构相似的形式即叶绿素a{C55H77O5N4Mg}和叶绿素
b{ C55H70O6N4Mg }；胡萝卜素是具有长链结构的共轭多烯，有三种异构体；叶黄素C40H56O2是胡萝卜素的羟基衍生物。当提取时，从上到下颜色依次为：黄绿色，蓝绿色，黄色和橙色。
【实验仪器】
研钵，色谱柱，丙酮，乙醇，乙醚，中性氧化铝，菠菜叶，烧杯，漏斗，玻璃棒，滤纸，剪刀，脱脂棉，纱布。
【实验步骤】
1、称取30g洗净后用滤纸喜感的新鲜菠菜叶，用剪刀剪碎，放入研钵中研磨，研磨时放入少量碳酸钙，防止研磨过猛破坏叶绿素结构，研磨至烂。
2、将研磨碎的菠菜叶转入小烧杯中，加入30mL配好的乙醇乙醚溶液，盖上表面皿，防止有机溶剂蒸发。按小组成员分别浸泡
10,15,20,25,30,35,40,45,50,55分钟。
3、浸泡期间，填充色谱柱，在最下面垫入脱脂棉，再盖上一个小滤纸片，装入氧化铝至4/5处，再盖上一层滤纸片。
4、将烧杯中的菠菜叶连带着有机溶剂用纱布挤入漏斗中，转入分液漏斗，加入10mL水洗涤，除去水层（下层），再用10mL水洗涤一次。
5、将分页漏斗中的溶液慢慢倒入色谱柱中，加几滴丙酮既可以看到颜色变化。
6、洗净仪器，收拾实验室，打扫卫生。
【实验记录】
虽然分层现象不是非常明显，但是还是可以看得见分层现象。
叶绿素分离原理
叶绿素分离原理
叶绿素是一种存在于植物和一些藻类中的绿色色素，它在光合作用中起着关键的作用。要分离叶绿素，常用的方法是色谱技术，其中常用的一种方法是薄层色谱。
薄层色谱是一种基于不同物质在固定相和流动相之间的分配系数不同而进行物质分离的方法。在薄层色谱中，固定相是涂覆在薄层板上的物质，而流动相是在薄层板上流动的溶剂。
要分离叶绿素，首先需要制备薄层色谱板。通常使用硅胶或者氧化铝作为固定相，涂覆在玻璃或铝片上制成的薄层板。然后，将制备好的薄层板放入色谱槽中，加入适当的流动相，通常是乙酸乙酯和正己烷的混合物。
在分离过程中，样品溶液被滴在薄层板的一个端点上，然后薄层板被放置在色谱槽中，让流动相逐渐上升。由于不同物质在固定相和流动相之间的分配系数不同，它们会以不同的速率移动。当流动相上升到一定高度时，不同物质会在薄层板上形成不同的斑点。
分离完成后，薄层板需要被取出并进行显色。常用的显色试剂是碘蒸汽，它可以使物质在薄层板上形成有色的斑点。叶绿素会显示为绿色斑点，而其他杂质则会显示为不同的颜色斑点。
通过观察薄层板上不同斑点的位置和颜色，可以确定叶绿素的纯度和分离效果。叶绿素斑点的大小和强度可以用来估计样品中叶绿素的含量。
总之，通过薄层色谱技术，可以有效地分离叶绿素并评估其纯度和含量。这种分离方法简单、快速且易于操作，因此被广泛应用于生物化学和植物科学研究中。
叶绿体色素的提取和分离(纸层析法)
叶绿体色素的提取和分离(纸层析法)
叶绿体是植物细胞中重要的细胞质器之一，它们负责植物的光合作用，能够将光能转化为化学能，生产出有机物质和氧气。叶绿体中含有多种色素，包括叶绿素、类胡萝卜素和花青素等，它们的色彩不同，吸收光的波长也不同，能够促进光合作用的进行。
叶绿体色素的提取和分离是一项重要的实验技术，科研工作者可以通过这种方法研究叶绿体的结构和功能，探究光合作用的机制，还可以进一步研究色素的生物活性和作用机理。下面介绍纸层析法提取叶绿体色素的方法。
实验材料：
1.醋酸丙酮乙酯
2.正戊烷
3.氯仿
4.纯化水
5.三氯乙酸
6.薄层色谱板（取硅胶G板）
7.深磁杯
8.玻璃棒（或玻璃片)
9.分离漏斗
实验过程：
1.取新鲜叶片，用纯化水冲洗干净后，将叶片用三氯乙酸溶液浸泡5-10分钟，轻轻搅拌，直至叶绿体脱离。
2.将叶绿体用分离漏斗过滤干净，加入少量的纯化水，制备得到含叶绿体的溶液。
3.将叶绿体溶液与醋酸丙酮乙酯混合，并加入一定量的正戊烷作为流动相，混合均匀后，取一片薄层色谱板，仔细涂抹硅胶G，然后放入深磁杯中。
4.将混合物用玻璃棒（或玻璃片)沿着涂有硅胶的色谱板上的一个角从上往下涂抹成一条线，使其长度大约为2.5cm左右，以保证在移液的过程中色素的有效分离。
5.将涂抹好的薄层色谱板置于流动相中，使其上升，当流动相向上液面到达约10mm处时，将其取出晾干，然后在烘箱中烘干5-10分钟，直至洁白无色，取出备用。
6.利用紫外线灯照射薄层色谱板，色素就会显示出来，然后用扫描器或者其它检测方法，对其中的不同颜色区域进行分离。
叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定
叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定
1 实验目的
（1）学习用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法；
（2）验证叶绿体素的理化性质。
2 实验原理
2.1 叶绿素的提取
叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合称为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加一分离和鉴别。
2.2 叶绿素的分离
薄层层析色谱法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上称一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。流动相通过毛细血管作用由下而上浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断地吸附、脱吸附、再吸附、再脱附……的过程。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一点，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。
2.3 叶绿素理化性质测定
叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较为稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜带叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多只植物的浸渍标本。
普通生物学实验实验报告叶绿素的提取分离与理化性质
普通生物学实验实验报告
一、实验名称
叶绿素的提取分离与理化性质
二、实验目的
1.学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法
2.验证叶绿体色素的多种理化性质
三、实验原理
1.叶绿素中的叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素是色素蛋白复合体，不
溶于水而易溶于有机溶剂，可以用乙醇进行提取。
2.由于硅胶板的吸附剂对不同色素的吸附能力不同，不同色素在展开剂中的溶
解度不同，因而叶绿素提取液进行薄层层析时各组分移动速度不同而分开，因此可以用薄层层析法对色素进行分离，进而对色素进行观察鉴别。
3.叶绿素是由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复合酯，能与碱性物质发生皂化反
应生成甲醇和叶绿醇及能溶于水的叶绿酸盐，从而绿色素和黄色素分离。4.叶绿素可以吸收光量子变成不稳定的激发态，当它变回基态时可发射红光量
子产生荧光。
5.叶绿素的化学性质不稳定，在强光照下易被破坏，类胡萝卜素则较稳定。
6.叶绿素中的镁可被氢离子取代生成绿色的去镁叶绿素。去镁叶绿素可与铜离
子反应生成稳定的铜代叶绿素。
四、实验仪器和材料
1.新鲜的菠菜叶片。
2.体积分数为95％的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂。
3.天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，毛细玻璃管，层析缸，硅胶预制板，
滤纸。
4.刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10mL移液管。
5.苯，醋酸铜粉末，质量分数为5％的稀盐酸，醋酸-醋酸铜溶液，氢氧化
钾-甲醇溶液。
五、实验步骤
1.叶绿素提取液的制备
2.叶绿体色素
的
分
离
3．光对叶绿素的破坏作用
取两只小试管，各加入2.5mL 的叶绿素提取液和2.5mL 的95％乙醇。一支试管放在直射阳光下，另一支试管用锡箔纸包严，均静置40分钟。
薄层色谱法分离韭菜中的叶绿素
薄层色谱法分离韭菜中的叶绿素
实验步骤
薄层板的制取比较麻烦，耗时比较长，从市面上购买来使用叶绿素的提取：
（1）韭菜中含有叶绿素a，叶绿素b，B一胡萝卜素和叶黄素四种。整个实验是利用叶绿体色素是脂溶性的色素，不溶于水，这种植物的叶绿体色素通常可溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂。根据这一性质，我们可以利用有机溶剂来将其提取出叶绿体中的色素。
（2）韭菜叶子的预处理。
挑十几根新鲜的韭菜叶子，将其洗干净，放在通风处晾干第二天实验时用。
（3）研磨。将处理好的韭菜叶剪碎放入研钵中，加入少许的粗砂和6毫升的丙酮，充分研磨。然后用脱脂纱布将绿色溶液倒出至锤形瓶中，然后再加入6毫升的丙酮，再次
研磨，再将绿色的溶液过滤出。
（4）萃取。含有绿色溶液的锤形瓶倒入分液漏斗中，再往分液漏斗中加入10毫升乙醚和10毫升的饱和NaC1溶液，充分摇匀，静止，将水层去掉，然后再分别两次加入10毫升的水，摇匀静置，洗涤过滤。然后将所得的有机层倒入锤形瓶中，加入5克的无水Na2S04用于干燥。
要使叶绿体中的几种色素能够充分地分离，而且不产生拖尾的现象，就要求在实验过程中要注意点样而选择对展开剂是关键。前面已
经介绍过展开剂的相关知识，叶绿体中的色素可用有机溶剂乙酰，丙酮，乙醇和甲醇等作为展开剂，在很多文献中经常用到多元展开剂，其中最常见的有丙丽一乙醛—乙醇，丙酮—乙酰和甲醇—石油酰这几种组合，在本次实验中，采用了丙酮—乙酰这组合。
在展缸中倒入适量的丙酮—乙酰溶液，并在上面放个表面血，使得缸内的溶剂蒸汽达到饱和。然后将点样好的层析板放入展红内，要注意，点样的点不得触碰到溶剂表面。盖上盖子或表面血，让溶剂缓慢地沿着层析板往上爬，当溶剂遇到点样点时，也会带着样品上升。当溶剂上升到快到层析板的另一端时，将其取出，并迅速做好溶剂到达点的位置将板晾干。
叶绿素的提取与分离
在研钵中放入约5g菠菜叶，加入10mL 2:1石油醚和乙醇混合液，适当研磨。将提取液用滴管转移至分液漏斗中，加入10mL饱和NaCl溶液（防止生成乳浊液）除去水溶性物质，分去H2O层，再用蒸馏水洗涤两次。将有机层转入干燥的小锥形瓶中，加入2g无水Na2SO4干燥。干燥后液体倾至另一锥形瓶中。如颜色太浅，可在通风柜中进行蒸发浓缩。
②薄层层析按分离机制不同可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。
(1)吸附层析中样品在薄层板上经过连续、反复的被吸附剂吸附及展开剂解吸附过程，由于不同的物质被吸附剂吸附的能力及被展开剂解吸附的能力不同，放在薄层上以不同速度移动而得以分离。通常用比移值（Rf）表示物质移动的相对距离：
Rf=
图注：1—起点线；2—展开剂前沿；a—色斑最高浓度中心至原点中心的距离；b—展开剂前沿至原点中心的距离。
1、叶绿素的提取
①叶绿素a：C55H72O5N4Mg
②叶绿素b：C55H70O6N4Mg
叶绿素a、叶绿素b同为吡咯衍生物与金属镁的配合物，是植物进行光合作用必须的催化剂，易溶于石油醚等非极性溶剂中。
③胡萝卜素:C40H56
胡萝卜素是一种橙色天然色素、属于四萜类，为一条长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体。其中，β异构体在叶绿体色素中含量最多。
④叶黄素
叶黄素是一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，是胡箩卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。
叶绿体色素的提取分离及理化性质检测实验报告
叶绿体色素的提取分离及理化性质检测
实验报告
一、实验目的：
1. 学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2. 了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。
二、实验原理：
叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。
薄层层析色谱法是将吸附剂均匀地涂在玻璃板上成一薄层，将此吸
附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用
一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。由于吸附
剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，
而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度
而彼此分开。
植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适
用于大量制备。本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。
三、实验材料与试剂：
1. 新鲜的菠菜叶片。
2 体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂〈石油醚：丙
酮：苯=75：1，体积比>。
3.研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸。
四、实验步骤：
(一) 色素提取液的制备
1. 取新鲜叶片4“5片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎，
放入研钵中。
2. 向研钵中加入少量CaCO₃**,再加2*3ml体积分数为 95%
的乙醇,充分研磨至糊状，再加10°15ml体积分数为95%的乙
醇，上清液用漏斗过滤出。残渣再用10ml体积分数为95%的乙
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一实验目的
1．掌握提取叶绿素的方法；
2．了解薄层层析的原理，掌握薄层层析的一般操作和定性鉴定方法
二实验原理
1．叶绿素提取
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a
(C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡萝卜素(C40H56)和叶黄素
(C40H56O2)等4种。叶绿素a和叶绿素b为吡咯衍生物与金属镁的配合物，胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从植物叶片中提取出来，并通过萃取、沉淀和色谱方法将它们分离开来。
2．薄层色谱
薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。
薄层层析的器材选择：
（1）基板：玻璃、塑料、金属箔，常用玻璃板。
2）吸附剂：
吸附剂要有合适的吸附力，并且必须与展开剂和被吸附物质均不起化学反应。可用作吸附剂的物质很多，常用的有硅胶和氧化铝，由于吸附性好，适用于各类化合物的分离，应用最广。选择吸附剂时主要根据样品的溶解度、酸碱性及极性。氧化铝一般是微碱性吸附剂，适用于碱性物质及中性物质的分离；而硅胶是微酸性吸附剂，适用于酸性物质及中性物质的分离。以下简单介绍吸附剂的几个基本参数。
种类：常用：氧化铝（强极性）、硅胶（中强极性）
不常用：硅藻土、纤维素、糖类、活性碳
符号：H——无任何添加剂；G——加有锻石膏（Gypsum，CaSO4·1/2 H2O）粘合剂；
F——加有荧光素（Fluorescein）
CMC——加有羧甲基纤维素钠（Carboxymethyl cellulose）
例：硅胶GF254表示硅胶中既加有煅石膏粘合剂，也加有荧光素，可以在波长254nm的紫外光下激发出荧光
粒度：目：1cm2内的筛孔数，数目越大，颗粒越小。薄层所用吸附剂颗粒较细，氧化铝为200目，硅胶为100~150目。
μ：颗粒的平均直径，以微米表示。例如：40μ的颗粒与100目相当。
活性：
吸附剂按其含水量的多少各分为五个等级：I级含水量最少，活性最高；V级含水量最多，活性最低；但并不是活性越高分离效果越好，选用哪种活性级别的吸附剂，要用实验的方法来确定。
酸碱性：
市售氧化铝有酸性（用以分离酸性化合物）、中性、碱性（用以分离生物碱等碱性化合物），其蒸馏水洗出液的pH值分别为4、7.5、9—10；其中以中性氧化铝应用最广，可用来分离各种化合物，特别是那些对酸、碱敏感的化合物。
硅胶没有酸碱性之分。
（3）展开剂
在样品组分-吸附剂-展开剂三个因素中。对一确定组分，样品的结构和性质可看作是一不变因素，吸附剂和展开剂是可变因素。而吸附剂的种类有限，因此选择合适的展开剂就成为解决问题的关键。展开剂的选择有以下要求:
（a）对待测组分有很好的溶解度。
（b）能使待测组分与杂质分开，与基线分离。
（c）使展开后的组分斑点圆而集中，不应有拖尾现象。
（d）使待测组分的Rf值最好在0.4~0.5，如样品中待测组分较多，Rf值则可在0.25~0.75范圈内，组分间的Rf值最好相差0.1左右。由于薄层色谱法用途非常广泛，国内外均有现成的铺有吸附剂的薄层板出售。一般实验室中也可自己制备。
(e)不与组分发生化学反应，或在某些吸附剂存在下发生聚合。
(f)具有适中的沸点和较低的粘滞度。
展开剂的极性是指与样品组分相互作用时。展开剂分子与吸附剂分子的色散作用、偶极作用、氢键作用及介电作用的总和。展开剂要根据样品的极性及溶解度，吸附剂活性等因素进行选择，总的原则是展开剂的极性能使组分的Rf值在0.5左右。常用溶剂极性次序是：石油醚<环己烷<苯<乙醚<氯仿<乙酸丁酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇。
如一种溶剂不能充分展开，可选用二元或多元溶剂系统。
4．展开槽与展开：
薄层的展开在密闭的容器即展开槽或称为层析缸中进行。
展开：
合适的展开剂用量为浸及下端硅胶，但不浸及样点；点样端向下，每次只展开一块，放在正中，以免爬斜（进而展开倾斜）。
5．显色：
如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色，可先在紫外灯光下观察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在薄层板上划出斑点的位置；对于在紫外灯光下不显色的，可放在含少量碘蒸气的容器中显色来检查色点（因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑点），显色后，立即用铅笔标出斑点的位置。常用
普适性显色剂：浓硫酸、碘蒸气、荧光素，专用显色剂：茚三酮、三氯化铁溶液等
三、实验仪器与药品
仪器：半微量玻璃仪器一箱，小烧杯，层析缸(槽)，载玻片(100mm×25mm)干燥器，电吹风，毛细管，移液管，研钵，布氏漏斗，抽滤装置。
试剂：硅胶，1％CMC，石油醚（60~90℃），乙醇，丙酮，乙醚，饱和NaCl溶液，无水Na2SO4
四、实验步骤
1．制板：
将硅胶加1％CMC，调成桨状(硅胶：CMC=1:3~4)（在平铺玻璃板上能晃动但不能流动），将其涂在载玻片上（100mm×25mm）），为使其坦平，可将载玻片用手端平晃动，至平坦为止，放在干净平坦的台面上，晾干之后放入105℃烘箱活化1小时，取出放入干燥器内待用。
2、叶绿素的提取
在研钵中放入几片(约5g)菠菜叶(新鲜的或冷冻的都可以．如果是冷冻的，解冻后包在纸中轻压吸左水分)。加人10mL2:1石油醚和乙醇混合液，适当研磨。将提取液用滴管转移至分液漏斗中，加人10 mL饱和NaCl溶液(防止生成乳浊液)除去水溶性物质，分去H2O层，再用蒸馏水洗涤两次。将有机层转入干燥的小锥形瓶中，加2g入无水Na2SO4干燥。干燥后的液体倾至另—锥形瓶中(如溶液颜色太浅，可在通风柜中适当蒸发浓缩)。
3、点样
用一根内径1mm的毛细管，吸取适量提取液，轻轻地点在距薄板一端1.5cm处，平行点两点，两点相距1cm左右。若一次点样不够，可待样品溶剂挥发后．再在原处点第二次，但点样斑点直径不得越过2mm。
4、展开
先在层析缸中放入展开剂[石油醚（60~90℃）-丙酮—乙醚(体积比为3:1:1)]，加盖使缸内蒸气饱10min，再将薄层板斜靠于层析缸内壁。点样端接触展开剂但样点不能浸没于展开剂中，密闭层祈缸。待展开剂上升到距薄层板另一端约1crm时，取出平放，用铅笔或小针划前沿线位置，晾干或用电吹风吹干薄层。
五、实验注意事项
1．制板时用注意使板上硅胶厚度尽量一致。
2．植物叶片不要研成糊状，否则会给分离造成困难
六.实验思考题
1.做薄层色谱法实验时，为什么展开剂不可浸过样品点？
根据原理，色谱法需要溶剂与固定相的相对流动，才能够通过不同组分“溶解、吸附平衡”的不同，使它们随溶剂的迁移速率不同（极性小溶解好的迁移快，极性大易于吸附的迁移慢），从而达成分离。
具体到TLC而言，溶剂靠硅胶板“虹吸作用”从溶剂液面起向上流动。这也就是说，被溶剂