中国典型培养物保藏中心-如何保藏微生物
微生物菌种保藏的原理和方法
微生物菌种保藏的原理和方法一、原理：1.休眠状态：微生物菌种在低温下可进入休眠状态，减缓代谢活动，延长存活时间。
2.冷冻保存：通过降低温度到零下或较低的温度，减慢微生物体内化学反应速率，延缓其代谢活动和死亡过程。
3.干燥保存：通过去除菌种周围的水分，降低微生物体内化学反应速率，延缓其代谢活动和死亡过程。
4.冻干保存：先冷冻再干燥保存，通过冷冻降低微生物体内的水分活性，再通过干燥去除冻结水，使菌种能在实验室条件下保存较长时间。
二、方法：1.冷冻保存：（1）使用离心管或培养管制备菌种的蛋白质保护液，可以是细胞培养基、缓冲液等。
（2）将培养物转移到保护液中，使其悬浮均匀。
（3）加入保护剂，如甘油或DMSO（二甲亚砜），提高菌种的冷冻抵抗力。
（4）将混合物分装到小容器或冻存管中。
（5）使用特定的冷冻方案，将菌种快速冷冻，并存储在低温下，通常为零下80℃或更低的温度。
2.干燥保存：（1）用无菌技术转移到无菌条件下的试管中。
（2）将菌种培养在无菌的固体培养基上。
（3）收集培养物，将其平均分布在无菌试管或培养皿中。
（4）将试管或培养皿放在无菌的通风柜中，使培养物在无菌环境下干燥。
（5）将干燥的培养物贮存在干燥无菌容器中。
3.冻干保存：（1）将培养物转移到无菌离心管或培养皿中。
（2）使用细菌培养基将菌种制备为细菌悬浮液。
（3）在细菌悬浮液中加入保护剂，如蔗糖或甘露醇。
（4）将混合物分装到冻干瓶中。
（5）使用低温冷冻机将菌种冷冻为固体，再将其放入冻结干燥机中进行冻干。
（6）将冻干的菌种贮存在密封的冻干瓶中。
4.长期保存：通常，冷冻保存和冻干保存可以实现长期保存，但仍需定期检测和维护保存条件。
在微生物菌种保藏过程中，还需注意以下几点：1.选择合适的保存条件：根据菌种的特性和要求，选择适宜的保存方法和温度。
2.制备合适的保存液：保存液的配方和pH值应与菌种相适应，以保证菌种的存活和精确性。
3.保持无菌操作：在菌种保藏过程中，需保持无菌操作，以防止细菌污染。
微生物的保藏技术
a、装安瓶管：使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻 剂（保存霉菌不用防冻剂）的灭菌溶液中，将0.2～1ml的 这种溶液分装于安瓶中，或在装有分散剂的安瓶中直接接 种，或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。 b、熔封安瓶管：若直接贮存于气相液氮中（－150℃～－ 170℃）时，则不需熔封。
c、检查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，将熔封安瓶 管在适当的色素溶液中浸泡2～30分钟后，观察有无色 素进入安瓶。
菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的 的不同，给微生物菌株以特定的条件，使 其存活而得以延续。
菌种保藏原理
• 根据微生物的菌种生理、生化特性， 在人工创造的条件下尽量降低微生物 细胞的代谢强度，使细胞基本处于休 眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至 于死亡，以减低菌种的变异率。低温、 干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都 有抑制微生物的代谢作用。
微生物的保藏方法
Companyຫໍສະໝຸດ LOGO主要内容1 常用的保藏方法 2 保藏原理 3 注意事项
菌种保藏的原因
通过分离纯化得到的微生物纯培养物， 还必须通过各种保藏技术使其在一定时间 内不死亡，不会被其他微生物污染，不会 因发生变异而丢失重要的生物学性状，否 则就无法真正保证微生物研究和应用工作 的顺利进行。
• ③要选择合适的菌液浓度，通常菌液浓度越高，生存率越 高，保存期也越长；
• ④最好在菌液内不添加电解质（如食盐等）；
• ⑤可在菌液内添加甘油（甘油管冷冻保藏法）等保护剂， 以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样，也 可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护 效果的溶剂，但对有些微生物而言，不加保护剂时更有效。
该中心保藏有藻类111株，细菌和抗生 素16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝 状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种 子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣 原体和病原体2189株，植物病毒1563种。 另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及 保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法微生物菌种保藏是指将微生物菌种保存在适宜的条件下，使其保持活力和遗传稳定性的方法。
随着微生物资源的日益减少，菌种保藏对于微生物研究和应用具有重要意义。
现今常见的微生物菌种保藏方法主要包括冷冻保存、冷冻干燥和液氮保存等。
I.冷冻保存法冷冻保存法是将微生物菌种在低温下保存，通常是在-80℃或更低的温度下。
冷冻保存的优点是简单易行，保存效果较好。
其步骤如下：1.选择合适的培养基和条件进行培养，确保菌种处于活跃状态；2.菌种分装，常用的分装方式有管内冻存和板块冻存两种。
管内冻存是将菌种转移到小试管中，加入一定的保护剂，如甘油，然后在-80℃下冷冻。
板块冻存是在无菌平板上涂布菌种，用无菌的干胶涂布，然后在-80℃下冷冻；3.将分装好的菌种保存在冷冻机或液氮罐中。
II.冷冻干燥法冷冻干燥法是将微生物菌种先进行冷冻，然后在真空条件下除去水分，最后进行密封保存。
冷冻干燥法的优点是菌种保存稳定性较好，不易失去活力。
其步骤如下：1.选择合适的培养基和条件进行培养，确保菌种处于活跃状态；2.将菌种在低温下冷冻，例如在-80℃冷冻24小时；3.将冷冻的样品放入真空干燥机中，通过极低的压力和温度，使水分从固态直接转变为气态，并在防止湿气生成的条件下除去水分；4.将干燥后的菌种用无菌胶瓶进行密封保存。
III.液氮保存法液氮保存法是将微生物菌种保存在液氮中，保证其温度处于极低的状态。
液氮保存法的优点是保存时间长，保存效果好。
其步骤如下：1.选择合适的培养基和条件进行培养；2.将菌种在低温下冷冻，例如在-80℃冷冻24小时；3.将冷冻的菌种转移到液氮罐中，确保菌种完全浸泡在液氮中；4.密封液氮罐保持其内部温度稳定。
总结起来，微生物菌种保存方法包括冷冻保存、冷冻干燥和液氮保存等多种方法。
科学选用适合的保存方法以及正确操作步骤，可以有效地保护微生物菌种的活力和遗传稳定性，为微生物研究和应用提供有力支持。
微生物菌种保藏方法及关键技术
目录
01 一、微生物菌种保藏 方法
02
二、微生物菌种保藏 关键技术
03
三、应用实践及注意 问题
04 四、结论
05 参考内容
微生物菌种是生物科学领域中的重要资源，它们具有广泛的工业和医学应用价 值。然而，微生物菌种的保存和保藏是一项充满挑战性的任务，因为微生物细 胞的生命周期短暂，且对环境条件极为敏感。为了更好地利用和保护这些珍贵 的资源，本次演示将详细介绍微生物菌种保藏方法及关键技术。
2、需要根据菌种的特性和应用需求，选择合适的培养基和培养条件，以保证 菌种的活性和稳定性。
3、在使用液氮保藏方法时，需要注意液氮的纯度和保存容器的密封性等问题， 以免影响菌种的存活率和保藏效果。
4、在菌种保藏过程中，需要注意防止杂菌污染和交叉感染等问题，以保证菌 种的纯度和质量。
5、需要注意菌种的定期检测和维护，及时发现并处理衰退和失活的菌种，以 保持菌种种群的健康和稳定。
三、应用实践及注意问题
在实际应用中，不同微生物菌种的保藏方法具有各自的优势和适用范围。一般 来说，对于一些常见的微生物种类，如细菌、酵母和霉菌等，冷冻保藏和液氮 保藏是常用的保藏方法。在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的保藏方 法和操作条件。此外，还需要注意以下问题：
1、在菌种保藏过程中，需要注意菌种的来源和背景信息的记录和整理，以便 更好地了解菌种的特性和进行相应的管理。
2、种子管理
种子管理是微生物菌种保藏的关键环节之一。良好的种子管理包括对菌种的纯 度、质量、稳定性和活性的监控和维护。在菌种保藏过程中，需要定期对菌种 进行纯度检测，确保菌种的纯度和质量。同时，需要根据菌种的生长特性和环 境条件，制定相应的管理措施，包括培养基的选择、培养温度和湿度的控制等， 以维持菌种的稳定性和活性。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法微生物菌种保藏方法主要包括冷冻保存、冷冻干燥保存和鉴定保存等多种方式。
以下将逐一介绍这些方法。
冷冻保存是一种常用的微生物菌种保藏方法，它的原理是通过将菌种置于低温环境中，减缓细胞新陈代谢和繁殖，使菌株处于休眠状态，从而达到长期保藏的目的。
冷冻保存的步骤包括：培养优良菌株、制备菌种冻存液、冻存及复苏。
制备冻存液时，通常使用亲水性保护剂如甘油、乳糖等，以及抗冻剂如酪蛋白、卵黄等，混合菌株培养物与冻存液，并移液到冻存管中，放置于低温冷冻器中迅速冷冻。
复苏时，将冻存液迅速复苏并接种于适宜的培养基上，培养条件要注意逐步恢复菌株的新陈代谢活力，以避免菌株死亡。
冷冻干燥保存是一种将菌种置于低温和低压条件下脱水处理的保存方法。
冷冻干燥保存的原理是通过脱水将菌株处于休眠状态，并使用适当的干燥保护剂，如蛋白质、糖类等，保护菌株的细胞结构和功能。
制备冷冻干燥菌种的步骤包括：菌株预处理、菌株悬浮液制备、脱水处理、真空干燥、密封保存等。
制备菌株悬浮液时，通常使用含有保护剂的培养基，将菌株培养到对数期，制备含有菌株的悬浮液。
脱水处理时，将菌株悬浮液置于脱水试剂中，使其渐渐减少，最终减至约1%的含水量。
真空干燥时，将脱水后的菌株置于真空干燥器中，利用低温低压的条件下，使菌株中的水分转化为气态水分，实现菌株的干燥。
最后，将干燥的菌株装入密封容器中保存。
鉴定保存是一种将微生物菌株保藏在鉴定标本库中的方法。
该方法适用于那些已经得到准确鉴定和分类的菌株。
鉴定保存的步骤包括：菌株鉴定、鉴定数据记录、鉴定标本制备及识别、存储方法选择和管理等。
菌株鉴定时，通常使用形态学观察、生理生化特性分析以及16S rRNA序列分析等方法，确保菌株的准确性和可重复性。
鉴定数据记录时，要详细记录菌株的相关数据，如菌株来源、鉴定结果、鉴定依据等。
鉴定标本制备及识别时，可以通过制备菌株培养物、制备冻存液等方式保存菌株，并制备鉴定标本。
存储方法选择和管理时，要根据菌株类型和特性选择适当的保存方法，同时要做好菌株信息的管理和查询。
微生物管理办法(专利法)
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心用于专利程序的微生物保藏方法〔1985年3月12日中国专利局公告第八号〕第一条中国专利局委托中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心〔以下简称保藏中心〕担负用于专利程序的微生物的保藏工作。
第二条保藏中心担负保藏除动物病原以外的各种细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、存在于上述宿主细胞内的质粒、以及单细胞藻株。
第三条请求保藏人在将微生物送交保藏中心时应提交两管该微生物的培养物，并附具请求书写明以下事项：１、请求保藏的微生物是用于专利程序；２、请求人的姓名或者单位名称和地址；３、详细表达微生物的培养、保藏和进行存活性检验所需的条件，保藏数种微生物的混合培养物时，应说明其组分以及至少一种能检查各个组分存在的方法；４、请求人给予保藏微生物的分类命名〔注明拉丁文名称〕或者鉴别符号；５、对危及健康或者环境的微生物特性的说明或者请求人不知有无此种特性的说明。
请求人如果是在我国没有经常居所或者营业所的外国人，应当通过国务院指定的专利代理机构办理上述手续。
第四条保藏管理中心一般采用冻干或者液氮的方法保藏，对请求保藏的微生物的生物特性不负复核的责任。
如果请求人要求采用特殊的保藏方法，或者要求对该微生物的生物特性和分类命名进行复核检验，那么应当在提交保藏微生物培养物时与保藏中心另行签订合同。
第五条保藏中心在收到保藏请求和微生物培养物时，应当给请求人书面证明，其内容包括：１、保藏单位的名称和地址；２、请求人的姓名或者单位名称和地址；３、收到微生物培养物的日期；４、保藏中心给予该带保藏微生物的保藏号；５、保藏中心盖章或者负责人签字。
第六条除按照本方法规定提供有关保藏微生物的情报和样品以外，在保藏期间，保藏中心负有保密的责任，不得向任何第三者提供该微生物的情报和样品。
第七条保藏中心负责保藏的期限，自收到微生物之日起至少为三十年，期满前收到提交微生物样品的请求以后，至少应再保藏五年。
第八条保藏中心应当自收到微生物培养物之日起一个月内，对请求保藏微生物进行存活性试验。
保藏微生物的方法
1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法
微生物菌种的保藏是非常重要的，因为这些菌种可能用于各种实验和研究中。
以下是一些常见的微生物菌种保藏方法：
1. 冷冻保存：将菌种在液氮或-80的冰箱中冷冻保存。
这是最常见的保藏方法，能够长期保存菌株并保持其遗传稳定性。
2. 干燥保存：将菌种在无菌室中取出，用无菌纸或吸水纸吸干，然后放入无菌瓶中密封保存。
干燥保存适用于某些孢子或芽孢的微生物，比如放线菌、链霉菌等。
3. 明胶斜培养基保存：将菌种接种在含有明胶的固体培养基上，然后密封保存。
这种方法适用于某些菌株，如革兰氏阳性菌和厌氧菌。
4. 低温保存：将菌种保存在4的冰箱中。
这种保存方式可以在短时间内保持菌株的活性，但不能长期保存。
5. 液氮保存：将菌种在锅内预冷冷冻过的无菌玻璃管中加入10%甘油或蔗糖，然后立即在液氮中保存。
这种方法适用于大多数微生物，并且可以长期保存。
中 国 典 型 培 养 物 保 藏 中 心
中国典型培养物保藏中心CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION (CCTCC) 电话：027）8768 2319 传真:(027)8788 3833 E-mail:cctcc@ 地址：武汉武汉大学邮编：430072.用于专利程序的培养物保藏登记表1、培养物名称(属、种的学名)：2、请求保藏人对培养物指定的名称、株号和符号(包括基因型)：3、该培养物是否为混合培养物?如是，请注明其组份以及能检查各组份存在的方法：4、该培养物的培养条件、检测存活性条件：培养基：pH 温度℃抗生素浓度 /ml □好氧□厌氧5、该培养物是否对人、动物和植物有害或污染环境?请详细注明。
6、该培养物由何处、何种基物分离得到或衍生而来?7、建议保存该培养物最适宜的方法及其使用的保护剂。
□液氮法□ -70℃□冷冻真空干燥法保护剂8、其他需说明的事项：我(们)理解而且同意下列事项：1)我(们)请求中国典型培养物保藏中心保存我(们)所提交的用于专利程序的培养物；2)我(们)理解并依照中国专利局公布的“用于专利程序的微生物保藏办法”办理委托保存培养物手续、并遵照规定，执行协议；3)我(们)同意提交的培养物保存期限为三十年(自保藏中心收到之日起计算)。
期满前收到提供培养物样品的请求后再延续保存五年，在此期间内不撤回保存物和有关的资料；4)我(们)将按照规定缴纳保藏、存活性检测等费用。
9、请求保藏人/单位:通讯地址:Tel: Fax: E-mail: 邮编:姓名签名年月日10、专利代理人:通讯地址:Tel: Fax: E-mail: 邮编: 姓名签名年月日11、中国典型培养物保藏中心负责人姓名、签字和日期：姓名签名年月日注：填写时字迹务必清楚。
菌种保藏方法
菌种保藏方法及重要保藏机构简述楼骏陈令会钱佳颖陈真真（浙江大学宁波理工学院07生物技术浙江宁波315100）【摘要】本文简述了菌种的保藏方法并介绍了国内外重要菌种保藏机构，并比较了各菌种保藏方法的优缺点。
【关键词】菌种保藏保藏机构菌种是国家的重要资源，是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产更离不开菌种。
所以，菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。
菌种保藏是指保藏机构依法以适当的方式收集、检定、编目、储存菌种或样本,维持其活性和生物学特性,并向合法从事病原微生物相关实验活动的单位提供菌种或样本的活动。
保藏机构是指由卫生部指定的,按照规定接收、检定、集中储存与管理菌种或样本,并能向合法从事病原微生物实验活动的单位提供菌种或样本的非营利性机构。
1．几种常用的菌种保藏方法：低温斜面试管保藏法穿刺保藏法液体试管保藏法液体石蜡斜面保藏法无菌蒸馏水保藏法液氮罐超低温保藏法主要措施低温低温，避氧低温，避氧低温，阻氧低温，阻氧超低温，保护剂常用菌种各大类细菌，酵母菌各大类各大类* 各大类各大类培养基按不同细菌的营养要求制备按不同细菌的营养要求制备按不同细菌的营养要求制备按不同细菌的营养要求制备按不同细菌的营养要求制备麦芽汁琼脂斜面保护剂无无无无无10%甘油或二甲基亚砜保藏温度4℃4℃4℃4℃4℃-150℃~-196℃保藏期1~6月1~12月1~12月1~2年4年>15年优点操作简单,使用方便,不需特殊设备穿刺法可保藏细菌2年之久存活率高变异少简单易行保藏时间长能较好保持发酵活性较斜面保存操作简便可减少翻管次数存活率高，稳定性强，保藏时间长，缺点容易变异污染杂菌的机会较多操作程序较麻烦，需一定设备条件直立存放，占空间大，不便携带必须定期向贮罐补充液氮来保持其温度真空冷冻干燥保藏法砂土管保藏法生理盐水保藏法甘油冷冻保存法主要措施干燥，低温，无氧，保护剂干燥，无营养干燥，低温低温，保护剂常用菌种各大类产孢子的微生物各大类不产孢子或芽孢的微生物培养基按不同细菌的营养要求制备按不同细菌的营养要求制备按不同细菌的营养要求制备按不同细菌的营养要求制备保护剂可选择血无无无清、脱脂牛奶和海藻糖等保藏温度5~7℃4~6℃-80℃保藏期>5~15年1~10年16月约10年优点存活率高变异少方法简便，设备简单，适用于产孢子和有芽孢的菌种保藏操作简便,不需特殊设备, 适合于液体深层培养菌株的保存缺点但操作程序较麻烦需一定设备条件在真空干燥过程中，机械力容易造成孢子的死亡，* 对石油发酵微生物不适宜2．重要的保藏机构：2.1国内主要菌种保藏机构及简介国内主要菌种保藏机构名称简介中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)—1980 中国国家级农业微生物菌种保藏管理专门机构。
微生物保藏
B1-341
2015年9月19日9时48分
菌种保藏要求各保藏管理中心 所保藏的菌种，必须具有该菌种的 详细历史及有关实验资料。并对其 所负责保藏的菌种均应采取妥善、 可靠的方法保藏，避免菌种的污染 或死亡。
《中国微生物菌种保藏管理条例》
1986年
微生物个体微小，代谢活跃， 生长繁殖快，如果保存不妥容易发 生变异，或被其他微生物污染，甚 至导致细胞死亡。 因此，在保藏过程中，必须使 微生物的代谢处于最不活跃或相对 静止的状态，才能在一定的时间内 使其不发生变异而又保持生活能力。
5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约 -70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左 右）下快速冷冻，然后在减压下利用 升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保 藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保 护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻 或水分不断升华对细胞的损害。 保护性溶质可通过氢和离子键对 水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞 成分的构型。 保护剂有牛乳、血清、糖类、甘 油、二甲亚砜等。
1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养 基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培 养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延 长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培 养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可 防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡， 另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作 用。
5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂 的干燥器中，用真空泵抽气至干。 6）将棉花塞入管内，用火焰熔封，保存于 低温下。 7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿 管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的 部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的 玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入 液体培养基内，置温箱中培养。
微生物菌种保藏的原理和方法
微生物菌种保藏的原理和方法微生物菌种保藏是指将微生物菌种保存在一定的条件下，以确保其持久的存活和繁殖能力。
微生物菌种的保藏可以用于科学研究、工业应用和生物资源保护等领域。
本文将介绍微生物菌种保藏的原理和方法。
微生物菌种保藏的原理主要包括冷冻保藏、干燥保藏和液氮冷冻保藏等。
冷冻保藏是将微生物菌种保存在低温条件下，常见的温度为-70℃或-80℃。
低温可以减缓微生物的新陈代谢过程，降低细胞内酶的活性，从而延缓细胞的老化和死亡。
冷冻保藏的关键是要使用适当的保藏液，如冻干保藏液、甘油保藏液等，以保护细胞在冷冻过程中的完整性和活力。
干燥保藏是将微生物菌种保存在无水或低水分条件下。
干燥可以通过脱水或真空干燥等方法实现。
干燥保藏的原理是通过降低细胞内水分含量，使微生物处于休眠状态，从而延缓细胞的代谢活动和老化过程。
干燥保藏的关键是要选择适当的干燥剂，如硅胶、脱水剂等，以吸附和吸收细胞内的水分。
液氮冷冻保藏是将微生物菌种保存在液氮温度下，常见的温度为-196℃。
液氮冷冻保藏的原理是通过极低的温度和极低的氧气浓度，使微生物处于极度低温和低代谢状态，从而延缓细胞的老化和死亡。
液氮冷冻保藏的关键是要使用适当的冷冻容器，如液氮罐、冷冻管等，以确保微生物菌种的长期保存。
微生物菌种保藏的方法包括冻干法、冷冻法、液氮冷冻法等。
冻干法是将微生物菌种培养物冻干后保存。
冻干法的步骤包括培养微生物菌种、制备冻干保藏液、将菌种混合冻干保藏液后冻干、密封保存。
冻干法保存的菌种可以长期保存，并且对于某些对冷冻保存敏感的微生物有一定的保护作用。
冷冻法是将微生物菌种保存在低温条件下。
冷冻法的步骤包括培养微生物菌种、制备冷冻保藏液、将菌种混合冷冻保藏液后冷冻、保存在低温条件下。
冷冻法保存的菌种可以长期保存，并且对于某些对冷冻保存敏感的微生物有一定的保护作用。
液氮冷冻法是将微生物菌种保存在液氮温度下。
液氮冷冻法的步骤包括培养微生物菌种、制备液氮保藏液、将菌种混合液氮保藏液后保存在液氮温度下。
微生物菌种的保藏
微生物菌种是实验室乃至国家十分宝贵的生物资源，是微生物教学和研究的最基础工作，是保证研究、教学和生产工作顺利开展的重要因素。
一、微生物菌种的保藏要求微生物菌种保藏的要求：①是广泛收集各种研究、教学和生产性菌种，满足各方面需求；②高质量保藏，即要求保藏的菌种不死亡、活性不衰老、特性不变异、分类不紊乱；③随时可提供保持有原始特性的菌种用于交换和使用。
菌种保藏的基本原理是将微生物菌种保存在不利于微生物活跃生长和代谢的不良环境中，如干燥、低温、缺氧、黑暗、营养饥饿等等，使微生物代谢速率极为缓慢或处于休眠状态。
而一旦恢复所保存菌种生长的正常环境和营养条件，即可获得具有高生理活性和保持原种优良性状的菌种培养物。
二、微生物菌种保藏的常用方法菌种保藏的方法有多种多样，常用方法简介如下：1、培养物传代保藏法这是将微生物菌种不断地在新鲜培养基上（中）转接传代或专性寄生微生物不断地在新的寄主组织中转接传代。
十分简便，但这种方法由于不断地转接传代，易造成污染和菌种本身的变异，如活性衰退、生产力下降等。
2 、低温保藏法低温保藏即是将已培养生长良好的固体斜面培养物或液体培养物置于低温环境下保存。
一般用 4 ℃冰箱即可，也可置于液氮（－196 ℃）或其他低温环境。
如果在培养物上面覆盖一层灭菌冷却的石蜡油则效果更好。
置冰箱（ 4 ℃）保藏的菌种宜 3 个月左右转接一次，并经常检查是否安全。
3 、干燥保藏法对于那些产生芽孢的细菌、形成孢子的放线菌和霉菌等都可用此法保藏。
待细菌培养物形成大量芽孢、放线菌和霉菌形成孢子后接入经酸洗、灭菌、干燥的砂土混合物中，真空干燥后，石蜡密封。
砂土也可用其他材料如硅胶、瓷球、滤纸片、明胶小片、曲料、麦粒等代替。
或直接转接入灭菌试管或安瓿小瓶中再干燥后封口。
制作后置冷凉干燥处或低温处。
此法菌种保存时间较长，可几个月、几年甚至更长。
几种常用的菌种保藏方法比较见表14-5 。
表14-5 常用菌种保藏方法的比较引自沈萍主编《微生物学》，高等教育出版社，2000 。
1-微生物保藏及基本操作技术
液体石蜡法
指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件 下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个 斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行 保存的一种菌种保藏方法。
❖ 操作步骤 ：
藏
液体石蜡法
操作简单，使用比较方便； 对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；· 菌种易退化、污染。
速放入凉水中冷却； 30℃培养2天，无菌检查合格后备用。
冻干样品制备
制备斜面培养物； 将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜
面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。 用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管
，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的 底部，勿使菌液沾在管壁上。
要求高； ❖ 保藏成本高。
不同保藏方法的比较
菌种保藏技术进展
程序降温控制技术
•冷冻速度慢：细 胞内水分外渗多 ，细胞脱水，体 积收缩。 •冷度速度快：细 胞内水分没有足 够时间外渗，细 胞内结冰。 •冷冻速度非常快 ：细胞内冰晶非 常小或称玻璃化 状态。
•冻结速度对菌种细胞的影响
菌种保藏技术进展
标签
激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。 喷码于安瓿管外，160℃固定20min。
灭菌
121 ℃，30min.
保护剂的准备
保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管； 灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌
20min； 打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅
《中国微生物菌种保藏管理条例》
微生物菌种保藏
制订专门菌种保藏管理制度； 同一株菌种采用两种以上保藏方法保存； 对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保
微生物菌种保藏的原理和方法
微生物菌种保藏的原理和方法微生物菌种保藏是指将微生物菌种保存在适宜的条件下，以保证其长期存活和遗传特性的保持。
微生物菌种的保藏有着重要的科研意义和应用价值，可以用于微生物学研究、新药研发、环境修复等领域。
微生物菌种保藏的原理主要包括冷冻保存和冷冻干燥保存两种方法。
冷冻保存是将微生物菌种存放在低温环境下，通过降低菌种代谢活动的速度来保持其存活和遗传特性。
冷冻保存的主要步骤包括选择合适的保藏液、培养菌种、制备冷冻物等。
保藏液一般是由无菌培养基和一定浓度的甘油或蔗糖组成，可以提供菌种所需的养分和保护菌体免受冷冻引起的损伤。
培养菌种时需要选择处于活跃生长期的菌株，通过适当的培养条件来使其保持较高的活力。
制备冷冻物时，可以将菌株转移到保藏液中，并在超低温环境下迅速冷冻。
冷冻干燥保存是将微生物菌种冻结后，通过真空干燥的方法除去水分，将菌种转变为无水状态，以提高其耐久性和保存时间。
冷冻干燥保存主要包括培养菌种、冻干物制备和密封保存等步骤。
培养菌种的方法与冷冻保存类似，选择合适的培养基和培养条件来培养活跃菌株。
冻干物制备时，将菌株转移到含有保护剂的培养基中，并通过冻结和真空干燥的过程除去水分，形成冻干物。
最后，将冻干物密封保存，避免受潮和污染。
微生物菌种保藏在实际操作中需要注意一些关键技术和管理要求。
首先，要确保保存的微生物菌株是原始菌株的纯种，并且具有所需的遗传特性。
其次，保藏液或冻干物储存容器应该具备良好的密封性能，以防止水分的进入和菌株的污染。
另外，保存的温度应该稳定在低温，通常为-80℃或更低的温度，以保证菌株的长期存活。
此外，对于长时间保存的菌株，应定期进行复苏培养，以确保其存活和活力。
总之，微生物菌种保藏是一项重要的技术，为微生物资源的保存和利用提供了有效的手段。
通过冷冻保存和冷冻干燥保存等方法，可以长期保留微生物菌种的遗传特性和活力，为微生物学研究和应用提供了可靠的资源。
在实际操作中，应遵循正确的步骤和管理要求，以确保菌种的质量和保存效果。
微生物的纯培养 菌种保藏
• 干燥保藏法：沙土管保存和冷冻真空保藏 • 冷冻真空保藏：干燥、缺氧及低温，目前使用最普
遍、最重要的微生物保藏方法
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
主要措施 适宜菌种 保藏期 评价
冰箱保藏法（斜面）
低温
冰箱保藏法（半固体）
低温
通过宿主体内生长进行复壮 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处
理，以杀死生命力较差的已衰退个体）
THANKS
创造良好的培养条件 利 用 不 同 类 型 的 细 胞 进 行 接 种 传 代 ： 对 丝 状 微
生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种。
采用有效的菌种保藏方法
菌种的复壮措施
纯种分离
菌落纯的分离方法（平板表面涂布法，平板划线分 离法，琼脂培养基浇注法）
细胞纯的分离方法（分离小室进行单细胞分离，显 微操纵器进行单细胞分离，菌丝尖端切割法进行单细胞 分离）
在，使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退。
• 复壮：狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况
下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群 体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状 的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就 有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作， 以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变 （正变）不断地从生产中选种。
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
沙土保藏法
干燥、无营养
各大类 细菌、酵母菌
各大类** 产孢子微生物
冷冻干燥法
干燥、无氧、低 温、有保护剂
各大类
3~6月 6~12月 1~2年 1~10年
5~15年 以上
菌种保藏方法
菌种保藏方法(来源:微生物保藏管理中心)定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
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中国典型培养物保藏中心（中国最大的培养物保藏中心）
中国典型培养物保藏中心受理以下各类培养物（生物材料/菌种）的专利保藏：
细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、高等真菌、单细胞藻类、动物细胞系、植物组织培养、原生动物、地衣、病毒(包括动植物病毒、噬菌体)、质粒、基因片段、基因文库、植物种子、其它生物材料（最高物理防范等级不超过P2级）以及生物材料的混合培养物。
除人和动物的一、二类病源菌以外的培养物（生物材料），根据一般原则，保藏中心仅受理现行的技术条件下长期保存时，其性状不发生明显变异的培养物。
对一些较为特殊的生物材料，如必须保持其处于生命活动状态，可依据具体情况加以受理，但应事先协商。
保藏各类专利培养物（生物材料/菌种）及其应提交样品的数量
1．细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、高等真菌、单细胞藻类-----5安瓿管/株
2．动物细胞系、植物组织培养、原生动物、地衣、病毒(包括动植物病毒、噬菌体)质粒、基因片段、基因文库-----10安瓿管/株
3．植物种子-----2000粒/份
4．其它生物材料-----适量数
国内申请人
1．申请人或其代理人从CCTCC索取或从CCTCC网页上下载"用于专利程序的培养物保藏登记表"，逐栏填写、签名或加盖公章；
2．申请人在专利申请日前或最迟在申请日将要保藏的培养物按规定的数量与保藏登记表直接送交或寄至CCTCC；微生物菌株、质粒、噬菌体等样品可通过特快专递(EMS)寄送，细胞系和动植物病毒等样品需在冷冻条件下寄送，在寄送包装箱内放入适量的干冰，以保证CCTCC 收到样品时仍保持冷冻状态；
3．收到样品后，本中心将及时通知申请人或其代理人，告知收到样品的状况；同时，按照申请人提供的培养条件及时进行存活性检测，并妥善保藏；
4．申请人按有关规定缴纳专利培养物保藏和存活性检测等费用；
5．CCTCC向专利申请人或其代理人出据该培养物保藏受理通知书(存活报告)。
根据布达佩斯条约，专利申请人如需IDA保藏证明，CCTCC可及时出据该证明。
国外专利申请人
1．我国涉外专利代理机构收到国外申请人的专利请求书后及时与CCTCC联系，CCTCC将根据我国的有关规定向国家相关主管部门申请培养物入境许可；
2．CCTCC收到入境许可的批文后及时通知涉外专利代理机构，由涉外代理机构通知国外申请人直接将专利培养物寄送至CCTCC；
3．普通样品，国外申请人或其代理人可通过特快专递将样品直接寄至CCTCC。
需冷冻寄送的样品，国外申请人或其代理人应提前两天将运寄培养物的货运号(或运单号)、航班号、抵达中国境内机场及日期等通知CCTCC；
4．CCTCC收到培养物后，将收到样品的状况通知其国内专利代理人；同时，及时进行存活检测，并妥善保藏；
5．申请人应按有关规定缴纳专利培养物保藏和活性检测等费用；
专利培养物保藏收费标准（保藏期限为三十年，包括保藏费、存活检测费）
1. 细菌、噬菌体、质粒、放线菌、酵母菌、丝状真菌、高等真菌1620元/株/30年
2. 动物细胞系、植物组织培养、动植物病毒原生动物、地衣3600元/株/30年
3. 单细胞藻类、基因片段、基因文库、植物种子、其它生物材料酌情而定
服务项目
1.向单位或个人提供各类非专利培养物，包括各类微生物菌种、动物细胞系、病毒等,价格优惠；
2.为单位或个人从国外引进所需的培养物，并负责办理培养物入境许可证、申报海关、检疫等手续，按单据收取所需费用；
3.接受某些类型微生物的鉴定；
4.接受微生物菌种或其他生化制品的冷冻干燥(具腐蚀和有毒样品除外)；
5.承担动物细胞系外源因子(细菌、真菌、支原体、病毒等)污染检测、动物细胞系染色体核型分析、细胞肿瘤原性检查以及细胞系鉴定；
6.培训各类培养物保藏和动物细胞系质量控制方面的技术人员。