甘薯β淀粉酶cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

! "# " $ ! %淀粉酶活性的平板检测 将含质粒的大 肠杆菌细胞接种在 &’ ( )*+, 可溶性淀粉的固体培 养基 （含 +) 过夜培养后， 加入 - . /0 的氨苄青霉素） " 淀粉 12 # //30 . &%41 !) //30 . & 染色。背景为蓝色， 酶所在位置因淀粉被水解而呈无色透明。 ! "# " 5 大肠杆菌的诱导表达 将带 678%9:/; 的 大肠杆菌单菌落接种至 &’ 液体培养基 （含 +) - . /0 " 的氨苄青霉素） ， 然后按 !), 的接种 #5< 过夜培养， 量转种， 当 =8$)) 达到 )*$ > #5< 振荡培养适当时间， 加入 1@AB 至终浓度为 ! //30 . & 诱导， 并在 )*? 时， 提取淀粉酶和 @:BE !C、 2 C、 # C、 D C、 + C、 $ C 后取样， 检测。 ! " # " ? 大肠杆菌和块根! %淀粉酶提取 将带 678% 的大肠杆菌培养液在 9:/; D< ， !) )))- 离心 !)/FG， 上 清 液 装 入 透 析 带 中，用 聚 乙 二 醇 2)))) （ @EB2))))） 浓缩 !+ 倍； 细胞沉淀用 +)//30 . & 6H5*2 的磷酸缓冲液悬浮， 超声波破碎， D< ， !) )))- 离心 上清液即为所需。块根 ! !)/FG， %淀粉酶提取按张勇
图 0 重组子 %&’$()*+ $淀粉酶的平板检’5$-)/2 分析
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中可以看出， 在 !!"# 和 $%"# 间， &’#()*+, 比 &’#( （图 .，第 / - 的胞内 提 取 物 明 显 多 一 条 蛋 白 质 带 道） ， 分子量约为 01"#， 这与克隆的 ! (淀粉酶 )#2* 推 导 的 多 肽 分 子 量 00 %%3"# 接 近， 与 报 道 4#4( 5*67 确定的! (淀粉酶亚基的分子量基本相同。 ! "# 大肠杆菌表达的 ! $淀粉酶与甘薯块根的 ! $淀 粉酶比较 / 8 9 8 : 不同来源! (淀粉酶迁移率的差异 由于大肠杆菌和甘薯分别属于原核和真核表达 系统， 它们在蛋白质表达和修饰方面存在许多不同， 这种不同可能对蛋白质的性质产生影响， 加之甘薯 中表达的 ! (淀粉酶是由相同亚基构成的同源四聚 体， 因此， 不同表达系统所得 ! (淀粉酶可能出现差 异。图 3 表示大肠杆菌和块根表达的! (淀粉酶在迁 移率方面的不同。从图中可以看出大肠杆菌的! (淀 粉酶比块根的! （图 3 第 / 道） 。 (淀粉酶迁移率更快
［J］ 所述双脱 " /R / $ 756 序列测定 按照 M+2HCO 等 氧核苷酸链终止法进行。
"
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材料与方法
材料 甘薯品种新 大 紫 （ !"#$#%& ’&(&(&) *+, -. / 012’
"/R/8 # ’淀粉酶活性的 (6LN 检测 所述方法进行。
［@］ 按张勇为等
（>##"66>"$"@"） ， 四川农业生物技术攻关及四川大学青年科学研究基金 （Y#>##R#!>） 资助项目。 % @!R 计划 博士生； 研究方向： 分子遗传学及基因工程。 "?!$ 年生， ! 男， " 联系人。 （收稿日期： >##$’#8’#@）
无模板、 双 ! 道： 8L: . !"# M$% $%& K1 7NOPQO； 2 道： # 引物； 模板、 双引物； 模板、 单引物 # 道： D、 + 道：
图#
甘薯淀粉酶 )*’( 的 *+$,-* 扩增
将 KA%@JK 产物与载体 678%A 连接， 转化大肠 — #) —
张勇为等： 甘薯! 5淀粉酶 %678 克隆及其在大肠杆菌中的表达
质 粒 提 取、 限制酶切以及 " / R / > 大 肠 杆 菌 转 化、 ［!］ 756 连接等 参照 M+,:OBB9 等 所述方法或厂家 推荐方法进行。 反转录 -756 " / R / R %&’()% 在 8# E 反应体系中， $ 上、 下游引物各 > ,BE V *， 35&(F >## ,BE V *， NT "##2H， $ $ &+H ;BE=,CO+FC " / 8W。扩增条件： ?$X 变性 $,12 后进 入循 环， ?$X 变 性 ",12， 8@X 复 性 ",12，J>X 延 伸 经 R# 个循环后再 J>X 延伸 "#,12。 R,12，
张勇为等： 甘薯# ’淀粉酶 -756 克隆及其在大肠杆菌中的表达
甘薯 ! ! 淀粉酶 "#$% 克隆及其在大肠杆菌中的表达 "
张勇为! 张义正"
成都 !"##!$） （四川大学生命科学学院四川省分子生物学及生物技术重点实验室
利用 %&’()% 技术从甘薯新大紫 （ !"#$#%& ’&(&(&) *+, -. / 0123+41） 块根总 （约 " / 89:） 。将该片段克隆至 ;<7’& 载体， 经酶切分 %56 中扩增出预期大小的 756 片段 析和序列测定后， 正向插入的重组子命名为 ;<7’-6,=， 插入片段长 "8>":;， 编码 $?? 个氨 基酸残基的多肽， 分子量 88 ??@97。克隆的# ’淀粉酶 -756 与报道的甘薯另一品种 AB9C1 与 )+E=FGCH1+ FC;1I, # 5B / "$ 的 ,%56 有 ??D 的序列相同， ’淀粉酶 ,%56 有 @JD 相同。重 组子 ;<7’-6,= 经 K(&L 诱导后， 胞内可溶性提取物经凝胶电泳和活性染色， 出现明显的 淀粉酶活性带。M7M’(6LN 表明， 大肠杆菌表达的 # ’淀粉酶亚基的分子量约为 8#97。重 组子 ;<7’-6,= 在淀粉平板上形成明显的水解圈， 说明甘薯# ’淀粉酶 -756 不仅能在大肠 杆菌表达， 而且能将有活性的 # ’淀粉酶分泌到胞外。对重组子 ;<7’-6,= 和甘薯块根可 溶性提取物的比较发现， 大肠杆菌表达的# ’淀粉酶与甘薯块根的 # ’淀粉酶除迁移率不同 外， 对淀粉酶活性抑制剂 N7&6 和# ’巯基乙醇的敏感性相同。 关键词 甘薯， ’淀粉酶，-756 克隆，表达 # ， 种 于 四 川 大 学 生 命 科 学 学 院 实 验 地。质 粒 3+41） ;<7’& 购自大连 &+9+O+ 生物工程 公 司。大 肠 杆 菌 （ * + ,#-. ） S<"#? 本室保存。 & / ’ 试剂 聚合酶 NT &+H ;BE=,CO+FC、 限制性内切酶、 连接 酶、 35&( 等购自大连 &+9+O+ 生物工程公司。反转录 酶购自 )EB2GCU 公司。其余试剂均为国产分析纯试 剂。 &/( 方法 按照 M+,’ " / R / " 甘薯块根总 %56 提取及反转录 ［!］ 所述方法进行。 :OBB9 等
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2))D*I 对转化子质粒 8L: 经凝胶电泳和酶切 杆菌 R7!)I， 鉴定后， 正向插入的重组子命名为 678%9:/;， 并对 重组子进行序列测定， 结果如图 2 所示。与甘薯另 发现只有 一品种 43PQF L3 " !D ! %淀粉酶 98L: 相比， 很少的核苷酸序列发生变化。
上、 下游引物： ::ABJJ::AA %#’ 引物 @2： +’ % BAB:ABAJ:AJJA::AJ::AJ:::JB BBAAAB:BJJ%#’ 对甘薯块根的总 KL: 进行 KA%@JK 扩增， 结果 如图 ! 所示。
方框处表示存在插入， 阴影表示替换
图 ! 甘薯! $淀粉酶 %&’( 序列和推导的氨基酸序列
摘
要
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引 言
甘薯是全球种植的主要作物之一， 具有高产稳
产、 抗逆性强、 适应性广等特点。我国年甘薯种植面 积占世界甘薯种植面积的 J#D 左右， 是夏季重要的 旱地作物。贮藏蛋白 （ F;BO+,12） 和# ’淀粉酶是甘薯 块根中 > 种最主要的蛋白质， 对甘薯的营养品质和
［"， >］ 口感起决定性作用 。由于甘薯潜在的用途以及
尽管大肠杆菌可将表达的 ! 5淀粉酶分泌到胞 外， 但胞内外的! 5淀粉酶是否存在某些差异仍然有 发 待确定。通过对胞内外 ! 5淀粉酶的 C8DK 检测， 现它们的迁移率相同 （见图 <） 。
@5G 道： EF65%8’- 经 BC!D 诱导 H，@，?，>，I，=，<J 后的胞内可溶性提取物
@ 道： EF65%8’- 上清液；? 道： EF65%8’- 胞内提取物
［$］ 为等 所述方法进行。
! " # " I 淀粉酶对抑制剂的敏感性 所述方法进行。
［$］ 按张勇为等
2
!"#
结果与分析
甘薯! $淀粉酶 %&’( 的克隆与鉴定 ［#， D］ 根据已报道的甘薯 ! 设计 %淀粉酶基因序列 引物 @!： +’ % JJ::J::ABBJAJJ::AJJJJBBABA