广州大学微生物学期末实验报告《土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选》

广州大学综合性实验报告实验课题：土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定学院生命科学学院年级：14级专业班级：生物技术142班姓名陈子禧学号1414300004实验地点：广州大学生化楼指导教师熊文婷老师、陈琼华老师一．实验目的及任务（1）了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术。

（2）掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法。

【包括物理上的温度筛选和生化上的培养基筛选】（3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法。

【检测淀粉酶活性】（4）从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌【包括取样、筛选及培养方法】（5）对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练【包括糖发酵试验、IMViC试验、淀粉水解试验等，且学习新的鉴定方法如柠檬酸盐利用试验、酪素、酪氨酸的水解试验等】（6）培养自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力。

（7）作为一个四人团队，且作为组长，掌握进度把握和根据个人长处和时间进行调配分工，培养团队合作能力，集思广益，将4个人的思路进行整合从而应用到实验中。

( 8 )实事求是，对失误和实验数据进行准确真实记载，对自己的错误进行分析。

二．摘要：本次实验的目的是为了从土壤样品中筛选出2株产淀粉酶芽胞杆菌随后进行纯化培养和菌种保藏，并进行17项生化鉴定实验得到参数后与伯杰氏细菌鉴定手册对比后确认菌种的种名。

我们组在个不同环境中（河边和树下）分别采取2个土壤样品制取土壤悬液并进行挑取菌种并培养，最终筛选出2个菌种后经过4次划线纯化后各取一个菌种进行细菌鉴定试验，并进行了17项细菌生化鉴定试验后（包括接触酶试验、糖发酵试验、V.P试验、MR试验、吲哚试验、耐盐试验、柠檬酸盐利用试验、明胶试验、硝酸盐还原试验、酪素水解试验、酪氨酸水解试验、运动性试验、温度试验、PH试验、卵黄反应试验、淀粉水解试验、0.001%溶菌酶试验）经过对伯杰氏细菌鉴定手册比对后，初步鉴定出树下土壤所取菌种为凝结芽孢杆菌及河边土壤所取菌种为蜡状芽孢杆菌，其中河边的蜡状芽孢杆菌可以产淀粉酶但树下的芽孢杆菌并不能分解淀粉，这是我们组因为实验顺序编排不当造成的大失误，但最后仍得到1株产淀粉酶能力较强的蜡状芽孢杆菌。

进而对该2株菌种进行斜面保存并上交，对实验过程的各种现象进行记录并分析，并以该实验报告作为载体对我们本次的试验作总结及进行成果汇报。

关键词：芽孢杆菌、细菌鉴定生化试验、装片、培养基、伯杰氏手册三．前言芽孢杆菌在土壤中分布广泛，是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。

这类细菌多数为腐生菌,主要分布于土壤、植物体表面及水体中,由于它们能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性的芽孢,因此能忍受多种不良环境并在环境适宜时芽孢萌发。

【本次实验由于条件限制，故所筛选的芽孢杆菌均为好氧菌，兼性厌氧型可能因环境不适已遭淘汰】土壤中蕴含着丰富的微生物资源,芽孢杆菌是其中具有重要应用价值的微生物类群。

有些菌种可以分泌多种酶,可应用于工业生产;有些菌种产生对昆虫毒性较强的蛋白,可生产微生物农药;有些菌种可作为多种分泌蛋白基因表达受体,在基因工程领域中有较高应用价值。

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称,是用于酿酒、食品、医药、纺织、饲料等具有商业价值的重要酶类。

所以分离出产淀粉酶的芽孢杆菌有重要意义。

四、实验原理我们的取样点位于广州大学，处于广州大学城四面环江，地处南亚热带,其气候属南亚热带典型的季风海洋气候。

可初步判断芽孢杆菌资源丰富。

本方案用五点取样法釆集土壤样品,采用纯培养的方法,分离获得芽孢杆菌。

对菌株进行形态学观察及生理生化分析,以挑选出可产淀粉酶的菌株并进行镜检制片并进行细菌生化鉴定试验，与伯杰氏细菌鉴定手册进行比对，从而鉴定出产淀粉酶芽胞杆菌的种。

五．实验材料试剂与配方：试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、葡萄糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水等配方：（1）牛肉膏蛋白胨培养基：营养琼脂3.3%、蒸馏水100mL、pH7.2-7.4。

（2）营养肉汤:牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、蒸馏水100ml、pH（5.7、7.2→对照）。

（3）半固体培养基(运动性试验）：琼脂0.5%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、蒸馏水100ml、pH7.2-7.4。

（4）淀粉水解培养基:营养琼脂3.3%、可溶性淀粉2%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4（5）卵黄反应培养基：无菌条件下去卵黄加等量的生理盐水，摇匀后，取5ml加入到融化的约50-55℃的100ml的营养琼脂中（内含1g葡萄糖)，混匀后倒入培养皿内。

制成的卵黄平板过夜后即可使用。

（6）硝酸盐还原实验培养基:胰蛋白胨1.0%,酵母浸粉0.5%,NaCl 1.0%, KN03 0.1%,蒸馏水1OOmL,调节pH7.0。

（7）明胶培养基：NaCl 0.5%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.3%、明胶12%、蒸馏100mL，调pH 7.2-7.4。

（8）西蒙斯氏柠檬酸钠盐培养液：柠檬酸钠0.2%、NaCl 0.5%、MgSO40.02%、磷酸二氢钾0.1%、磷酸氢氨0.1%、溴麝香草酚蓝水溶液1ml、琼脂2%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4。

（9）耐盐试验培养基（2%、5%、7%、10%）：营养琼脂3.3%、NaCl（0.2%、0.5%、0.7%、1.0%）、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4。

（10）糖发酵培养基（110℃灭菌-切记重设温度绝不能破坏糖成分，且需用漏斗移入试管）Ⅰ.葡萄糖发酵培养基：葡萄糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、0.2%溴钾酚紫（最后加入）、PH7.2-7.4。

Ⅱ.乳糖发酵培养基：乳糖1.5%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾酚紫0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。

Ⅲ.木糖发酵培养基：木糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾酚紫0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。

Ⅳ.阿拉伯糖培养基：阿拉伯糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾酚紫0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。

Ⅴ.甘露醇发酵培养基：甘露醇1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾酚紫0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。

（11）葡萄糖蛋白胨培养基(VP、MR试验）（110℃灭菌）：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、NaCl 0.5%、PH7.2-7.4。

（12）蛋白胨水培养基（吲哚试验）：蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、PH7.2-7.4。

(13)酪氨酸培养基（酪氨酸水解试验）：L-酪氨酸0.5g悬浮于10ml蒸馏水中，20min 110℃灭菌，与100ml无菌营养琼脂混合，即成酪氨酸水解平板。

(14)酪素水解培养基（酪素水解试验):取5g脱脂奶粉与一号三角瓶中，加入50ml蒸馏水，110℃灭菌。

另称1.5g琼脂置于含50mL蒸馏水的二号三角瓶中,120℃灭菌,待冷至45-50°C时,将两液混匀倒成平板,即为牛奶平板。

将平板倒置过夜,使表面水分干燥(15)0.9%无菌生理盐水称取0.85g NaCl于100ml蒸馏水中，摇匀，120℃灭菌。

工具:取样：铁锹、尺子、塑料袋等培养：接种环（针）、培养皿、棉塞、试管、试管架、锥形瓶、标签纸、打火机、酒精灯、报纸、橡皮筋、无菌棉签、滤纸片、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、精密pH试纸、吸水纸、培养基平板，无菌水，试管架，酒精灯，酒精瓶，记号笔等其他工具：无菌操作台、恒温振荡培养箱、恒温培养、光学显微镜、高压灭菌锅、干热空气灭菌箱等六．实验步骤及记录①．土壤取样通过实地考察，以土壤肥沃程度优先，确定采样点。

采集5-20㎝深度的土壤，五点采样，样品装在2个无菌纸袋中编号为“河边”和“树下”两个组名。

记录采样时间、地点、环境、土壤类型等。

样品存于4℃冰箱保存备用。

②．土壤悬浊液的制备已配好0.9%的生理盐水并加入玻璃珠于锥形瓶，高压灭菌后，将已采集的泥土样品（河边、树下）摇匀后各取10.0g于100ml生理盐水的锥形瓶中，随后我们将其放置水浴摇床进行保温并摇匀，并在85°C~90°C区间保持了20min（目的为了杀死不能产生芽孢的细菌），取出并将该两组土壤悬浊液放置入冰箱冷藏。

③分离纯化【菌种的挑选】用一支新的无菌枪头从各浓度土壤稀释液中分别吸取0.2 mL涂布于已标记好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基上,每个浓度梯梯度取两个重复,标记日期、时间、组别，置于37℃培养箱中培养24h。

经过24h后从树下的（1:100、1:1000、1:10000）3个培养基中挑选出3个单菌落，并在河边的（1:100、1:1000、1:10000）3个培养基中挑选出7个单菌落；将10个已灭菌的培养皿标好采样地点及提取液浓度，并在皿底画十字分为1、2、3、4区域，以便其后进行划线纯化。

划线时先在已经平板培养基的一边作第1次平行划线3~4条，再转动培养皿约60°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线。

划线完毕，在培养皿底部和顶部写上菌落编号和对应的纯化次数如“树1-1、河1-1”将以上10个已接种培养皿倒置于28~29℃恒温培养箱中培养约20h（倒置培养以免冷凝水滴落污染培养基）。

【菌种的纯化】纯化三次后进行镜检，挑取纯化的菌种进行单染色，观察细菌是否为杆状，以及细菌的大小、两端形态、粗细、着色深浅等是否一致。

若不全为杆状，则弃用，若个体形态不一致，且形态不一致的两种或多种细菌数量相当，则再次纯化，直至个体形态一致。

我们组在纯化第四次时已得到满意结果，并保留2号和9号菌种进行后续实验舍去其余组别并重新编号为T （tree代表采集地）、R（riverside代表采集地），将T、R两组进行斜面接种（6支试管三组，其中一组为了明天实验活化，一组为了菌种保藏，另一组进行备用）④.产淀粉酶芽孢杆菌的筛选（我组操作顺序错误）利用接种环挑取纯化的菌落分别点种到含淀粉培养基的无菌平板上，并标记菌落编号、日期、时间、组别，放置在37℃恒温培养箱中培养48h。

取出平板滴加路哥氏碘液，缓慢摇晃至碘液将平板覆盖均匀，静置，产生透明圈的菌株初步定为淀粉酶产生菌株。

【我们的筛选环节定位错误，已将部分菌种筛去，余下的T、R两组仅有R能够产生透明圈】从活化后的斜面中沾取备份菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养12h进行革兰氏染色，培养24h进行芽孢染色。