吉大生化实验课件

的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。
（7）自溶法（本实验）： 将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下， 细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶 等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。
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本实验采用自溶法进行破壁
干酵母粉
溶于蒸馏水
乙酸钠 乙酸乙酯
35℃恒温 搅拌40分钟
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（3）离子交换层析

离子交换层析基本原理 ：
以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相，利用
离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同
离子进行分离的层的离子交换剂。
平衡离子 决定树脂正负
离子交换剂
不溶性载体:
惰性的 高分子固定骨架
功能基团:

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离子交换分离的基本步骤---装柱-平衡-上样-洗柱-洗脱-再生
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DEAE52 离子交换层析（本实验）

装柱：本实验使用DEAE52离子交换树脂。柱内的DEAE52离
子交换树脂应非常均匀地分布，防止出现截面和气泡，床面要
平整。用起始缓冲液洗柱，控制好流速（防止流干）；

平衡：用5mmol/L pH6.0的磷酸起始缓冲液平衡过夜。 上样：注意控制流速，使流出液的流出速度为1.5ml/min左右。 洗柱：样品全部进入床面后，在柱面加入2cm的缓冲液，在储 液瓶中加入5mmol/L pH6.0的磷酸缓冲液，连接紫外检测器、
低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。

亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质
分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。

亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了 表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。

乙醇、丙酮是最常用的沉淀溶剂。
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有机溶剂分级沉淀操作条件的控制
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用于去除大分子溶液中的小分子物质，称为脱盐。 用于去除大分子溶液中的溶剂，此称为浓缩。
新透析袋可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗
净。使用时，一端用橡皮筋或透析袋夹扎紧，由另一 端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透
析液，通常要留 1/3-1/2 的空间，以防透析过程中，
透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入 袋内将袋涨破。 保存：0.05%-0.1%叠氮钠，1mMEDTA或50%甘油。
子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。

凝胶层析（gel chromatography）：
常出现多种名称如凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶
渗透层析等。
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凝胶层析的基本原理
凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，
其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小
啤酒酵母蔗糖酶
提取、分离纯化、性质鉴定
及反应动力学实验
(必修、综合性大实验)
指导教师：滕利荣、郑良玉、吕绍武、王智
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最适条件（温度、 pH、离子浓度）
正交试验法
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一、目的要求
1、熟悉工作曲线的制作方法及使用注意事项； 2、学习掌握 3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色 定糖的原理和方法； 3、学习掌握 Folin-酚法测定蛋白质含量的原 理和方法； 4、学习酶蛋白分离提纯的原理；
搅拌均匀，成糊状
补加蒸馏水 35℃恒温过夜
记录生产厂家和批号 用硫酸纸封严（过夜）
离心
E1
弃沉淀及脂层
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2、蔗糖酶的纯化
（1）有机溶剂分级沉淀 （2）透析 （3）离子交换层析
（4）凝胶层析
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E1
用稀 HAC 调 pH
乙醇分级 (32%乙醇饱和度)Ι 离心，取上清
乙醇分级 (47.5%乙醇饱和度) Ⅱ
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离子交换纤维素（本实验）

树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳
离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类；

特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量 大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高。
★
DEAE52离子交换树脂，别名 DEAE纤维素52。
为已经泡胀的二乙氨基乙基纤维素，是弱阴离子交换剂。
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细胞破壁的方法
（1）高速组织捣碎 （2）玻璃匀浆器匀浆 （3）超声波处理法
（4）反复冻融法
（5）化学处理法 （6）溶胞作用 (酶溶解法) （7）自溶法
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（1）高速组织捣碎： 将材料配成稀糊状液，放臵于筒内约 1/3 体积，盖紧
筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至
所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 （2）玻璃匀浆器匀浆： 先将剪碎的组织臵于管中，再套入研杆来回研磨，上 下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织
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名称
MW
亚基
Km
pI
最适pH
最适温度
(底物为蔗糖) (等电点)
膜外酶 27万 (22万) 膜内酶 13.5万 双 25mM 4.5 双 26mM 5.0 4.9 (3.5～5.5) 4.5 60℃ 60℃
(3.5～5.5)
这两种酶组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性 质仍十分相似，故本实验未区分膜内酶与膜外酶。
与载体共价结合 的固定的活性基团
平衡离子:
与功能基团 以离子键联结 可移动的活性离子
流动相：具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。 常采用柱层析。 洗脱方法：增加离子强度、改变pH值。
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离子交换树脂种类
阳离子交换树脂：带负电荷，与阳离子交换
① 强酸性树脂：主要是磺酸型树脂，功能基团为磺酸根及

溶剂选择
常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基
亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作 用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。

温度
使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。

样品浓度的控制
一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5%-2% 为好，粘多糖
则以1%-2% 较合适。
功能基团是-OCH2CH2N(C2H5)2 属预膨胀树脂，可用于蛋白、多肽、核酸等。
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离子交换纤维素的预处理

适量水浸泡，漂洗，使之充分溶涨； 数十倍的0.5mol/L氢氧化钠液反复浸泡0.5～1h， 每次换液皆须用水洗至近中性； 按交换的需要用平衡离子处理； 最后以交换用缓冲液平衡备用。
蔗糖酶在食品工业中，常用来转化蔗糖增加甜味，制
造人造蜂蜜，还用来制造果糖和巧克力的软心糖等。
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该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧；
在细胞膜外细胞壁中的称之为膜外蔗糖酶 (external
yeast invertase), 其活力占总酶活力的大部分，是含 有50%糖成分的糖蛋白； 在细胞膜内侧细胞质中的称之为膜内蔗糖酶 (internal yeast invertase)，含有少量的糖；
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5、学习掌握酶的比活力测定及其计算方法； 6、运用正交试验法确定温度、pH值、离子 浓度的最适条件 ； 7、学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测 定Km 的方法；
8、学习掌握SDS-PAGE电泳原理和操作技术
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二、实验对象
啤酒酵母蔗糖酶
蔗糖酶 是一种古老的酶，主要存在于酵母中，如啤 酒酵母、面包酵母、曲霉、青霉等霉菌和细菌中，工 业上通常从酵母中制取；
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（2）透析
利用具有一定孔径的亲水膜，在常压下依靠小分子物 质的扩散运动，将含有高分子和其他小分子的溶液与纯水
或缓冲溶液分隔的一种方法.
透析的动力是由膜两边的浓度梯度形成扩散压。其速 度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。常用温度：4℃。 保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”， 袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。
的不同得以彼此分开。
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凝胶层析的应用范围：
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、 多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通 过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性， 可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。
凝胶层析的优点：
凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响生 物学活性等优点。目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和
纯化。
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凝胶层析的特点

凝胶层析操作简便，所需设备简单； 分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率 高，接近100％；

分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及 化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响；

应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、 蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以
强碱Ⅱ型。
② 中强碱性树脂：兼有以上两类活性基团。 ③ 弱碱性树脂：弱碱性阴离子交换树脂的活性基团是伯、 仲、叔胺基，即-NH2，-NHR，-NR2，吡啶基等。
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如何选择离子交换介质
对pI=5的某酸性蛋白质，

当蛋白质为阴离子时，在 pH5.5-9.0 的范围内应选阴离子交换剂； 当蛋白质为阳离子时，在 pH3.5-4.5 的范围内应首选阳离子交换剂
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三、实验步骤及原理
1、蔗糖酶的提取 2、蔗糖酶的纯化
3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定
4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定
5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响
6、蔗糖酶酶促反应动力学研究
7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量
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1、蔗糖酶的提取
(细胞破壁)
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酵母菌
基本特征：单细胞，椭圆形、圆形或柱形。 酵母菌细胞壁具三层结构——外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，都 是复杂的分枝状聚合物，其间夹有一层蛋白质分子。