摇瓶发酵生产阿卡波糖工艺优化

摇瓶发酵生产阿卡波糖工艺优化摘要：由于阿卡波糖在降血糖方面有着良好的效果，自从其问世以来，便广受诸多Ⅱ型糖尿病人及其家属的欢迎。

最近，随着我国生活水平的增加，糖尿病人数目的扩大也在拓宽阿卡波糖的需求市场，然而由于我国在发酵生产阿卡波糖工艺方面有着较低的工业化水平，因此就要求我国相关研究成员研究如何通过工业菌株发酵生产阿卡波糖的相关工艺，提高阿卡波糖的生物合成水平及发酵产量，满足诸多糖尿病患者的需求。

因此本文优化了摇瓶发酵生产阿卡波糖的工艺，具体如下。

关键词：摇瓶发酵；阿卡波糖；工艺；优化摇瓶发酵生产阿尔卡波糖工艺优化就是依据实验步骤，灵活运用实验方法，并依据结果及相关因素，优化微生物发酵培养基的温度、pH、微生物的接种量、接种方法、通气量及培养时间等对发酵有相当影响的多个因素，注意到各因素需同时存在的特点，了解实验所进行的微生物接种及其产物的生成是否能够在摇瓶发酵时促进阿卡波糖的生物合成作用。

同时，还可探讨培养基各影响因素对阿卡波糖产量所起的作用，从而依据实验结果，逐步优化包括碳源、氮源及其余培养基成分对于阿卡波糖合成有关键作用的高产菌株的影响。

因此，本章节围绕着工艺优化试验材料在内的菌种、实验摇瓶、仪器设备及培养基品种展开。

一、工艺优化实验材料此次工艺优化实验所用的菌种来自于华东医药股份有限公司所生产的A.utahensis GNSR-9，所使用的摇瓶及试剂主要包括葡萄糖、阿卡波糖、蔗糖、谷氨酸钠、琼脂、硫酸镁、碳酸钙、无水氯化钙以及氢氧化钠等摇瓶及试剂，应用了敞开式回转窑床、高效液相色谱、隔膜真空泵、色谱柱、显微镜、电热隔水式培养箱、立式压力蒸汽灭菌锅等实验所需仪器设备，制备出经121℃高温灭菌处理所得的种子培养基、发酵培养基以及CPC培养基(不含琼脂的液体培养基)等实验所需发酵培养基。

二、实验方法发酵培养基中内含有的原料及营养物质能够促使阿卡波糖生物合成所需菌株。

很好地生长并生产出阿卡波糖产物合成所需的目标代谢产物，因此本章节中为优化培养基应用单因素实验方法，探讨培养基中碳源、氮源、无机盐离子及其他成分的实际含量，并在适宜含量结果的前提条件下，选取菌株对阿卡波糖合成目标代谢产物有积极影响的因素，应用均匀设计方法进行优化，以获得发酵培养基的最优含量组成成分，从而通过摇瓶发酵，获得更优更好的阿卡波糖。

本实验所应用的单因素实验方法就是假定发酵培养基中各个组成因素之间互不关联，每次实验只更改其中某一因素，并保持其余的成分因素始终不变，探讨每次更改的成分因素的含量区别对最终结果的影响，再通过多次试验的结果考察，获得所需结果，此种优化方法往往被应用于实验研究中。

但在实际实验中，发酵培养基中各成分含量彼此关联，而若需考察多个影响因素，还需多次进行实验并占据较长时间，所以此种单因素实验方法更适用于选取培养基中碳源、氮源、无机盐及其他离子等营养成分的最佳含量，之后，实验人员再通过正交设计、均匀设计或是响应面设计等方法考察其余因素，尽可能地减少各种因素导致的实验误差，而在摇瓶生产阿卡波糖工艺优化试验过程中，由于阿卡波糖菌株在一整个生长及代谢生成所需产物时，很容易会随外在的诸如种子呢品种质量，发酵培养基的pH、温度、融氧条件及渗透压等因素的变化发生变化，所以通过优化培养基的培养条件，使阿卡波糖生产所需菌株有更加优良的生产合成能力。

三、摇瓶培养条件的工艺优化1 .菌种生长状况的影响实验人员在摇瓶发酵生产实验过程中，为获得所需的阿卡波糖生产所需菌种的最优发酵条件，每日两次，在相同的时间间隔内，对所培养的菌种进行取样，探讨菌种的实际状况是否影响阿卡波糖生物合成作用，同时在每次取样后，记录菌种生物量，并进行10%的接种量发酵实验，再记录相关发酵产量。

根据所记录的数据，绘出图一所示种子生长曲线及种龄的影响，发现在第3次取样也即种子生长36h时，种子进入生长期；在60h时,种子有最为旺盛的生命活力；到84h,种子逐渐衰亡。

依据发酵结果随种龄的变化情况可见，在60h及84h这一时间范围内进行接种并不会。

导致阿卡波糖生物合成产量有较大波动。

此时考虑摇瓶的发酵周期及成本限制等相关因素，在之后进行的发酵实验中选定实验样本为第60h时的生长最为旺盛的种子。

探讨阿卡波糖的生物合成成量随菌种接种数量变化所发生的变化，最终发现当菌种有10%的接种量时，发现阿卡波糖的生物合成量最高气温发酵培养基中接种的种子在较长时间内无法生长繁殖，对最终产物产量有消极影响。

而如果接种量远高于10%，那么在实验早期，菌体会由于发酵培养基中过于丰富的营养物质含量而较快生长，导致培养基中营养缺乏，降低了阿卡波糖的生物合成能力。

图一种子生长曲线及种龄的影响2 .培养基中pH的影响为探讨发酵培养基中pH条件不同的状况下阿卡波糖的生物合成状况，实验人员分别选择了 pH值位于6.0~8.0之间的发酵培养基，结果如图二所示，在发酵培养基在完成发酵时，液体的pH值保持在5.8~6.9范围内， pH值并无明显变化。

发酵培养基中pH值的差别会导致阿卡波糖有着不同的生物合成能力，在pH 值位于7.0~7.2范围内的培养基中，这一能力并不发生明显变化，在pH值为7.0的培养基中，阿卡波糖有最为优良的发酵产量。

图二 PH的影响3 .培养基中溶氧量的影响发酵培养基中溶氧量会在一定程度对阿卡波糖生物合成及所需菌种繁殖及代谢有一定的促进或抑制作用。

如果培养基融氧量不够充分，将会抑制菌体繁殖，原因在于如果发酵培养基中缺少一定氧气，那么菌体将进行无氧呼吸，并代谢出某些酸性物质，这会导致培养基的发酵环境发生变化。

如果培养基有较高溶氧量，将会促进菌体细胞的代谢生长，并促进菌体生成次级代谢产物。

在实验中主要探讨的是阿卡波糖生物合成能力在250毫升摇瓶中装有不同含量液体时的变化，实验结果表明阿卡波糖发酵产量并不会由于装液量变化而有较大波动，但在摇瓶装液量为30毫升时，发酵产量相对较高，这也表明如果摇瓶有较高溶氧量时，阿卡波糖的生物合成及所需菌种的繁殖要求基本能够得到满足。

但在车间的生产过程中，分别应用持续搅拌通气的发酵罐及不通气搅拌的摇瓶，结果表明，后者的菌种产出更多的阿卡波糖，从而推测出如果培养基含氧量较低，那么菌种的刺激代谢产物也即阿卡波糖的生长量可能会因此得到鼓舞，最终提高了阿卡波糖的产量。

在外界温度为28℃的情况下，将250毫升摇瓶放置在敞开式回转摇床上进行发酵培养时，摇瓶中的液体大量蒸发，主要表现在7天的时间内进行发酵培养后，摇瓶中仅于22毫升的液体，达到了24.24%的损失量。

图三摇瓶装液量的影响四、发酵培养基的工艺优化一般而言，培养基准往往含有碳源、氮源水及无机盐等营养物质，以供其中的微生物生长繁殖，发酵培养基也同样如此。

而在探讨发酵培养基的工艺优化，提高阿卡波糖的生物合成量及产量的过程中，也主要通过以上营养物质含量的控制探讨具体工艺优化措施。

1 碳源的影响作为培养基所必需的成分之一，碳源的基本功能是提供能量及碳素，以备培养基中各菌种的生命繁殖及细胞成分及代谢产物所需。

本文所选用的碳源包括麦芽糖、蔗糖、玉米淀粉、乳糖、葡萄糖、柠檬酸及甘露醇等多种原料，以上原料的物质浓度均为80g/l。

在实验中探讨阿卡波糖生物合成能力随碳源所发生变化的结果表明阿卡波糖的生物合成能力在碳源为单一的麦芽糖及麦芽糖糖化液时有较大影响，如果以麦芽糖及其糖化液作为唯一碳源，阿卡波糖有处于最高水平的发酵产量，因此其被视为最为理想的阿卡波糖的生产碳源；如果以葡萄糖作为培养基的碳源，此时阿卡波糖的产量及其菌种生物量也明显较高，此种现象可解释为理论层面上，生产出一分子的阿卡波糖需要的麦芽糖及葡萄糖的量分别为一分子以及二分子，因此葡萄糖也可作为最优的阿卡波糖的碳源之一。

除了碳源的种类外，其浓度也会对阿卡波糖的生物合成能力有着相当的影响，比如在发酵培养基以葡萄糖为碳源时，碳源的初始浓度也会影响到阿卡波糖的合成及其产量。

如果碳源浓度低于某一标准值，那么培养基中缺乏营养物质，将会遏制菌种正常的繁殖，而如果碳源有过高浓度。

那么太多的营养物质将会促进菌体生长，降低阿卡波糖的生物合成能力，根据研究结果可见。

发酵培养基的碳源的最佳浓度为50g/l。

图四不同碳源(葡萄糖)浓度的影响2.无机盐的影响在发酵培养基中所存在的无机盐不要为金属离子，其基本用途是作为激活剂或酶的辅基而存在。

在此次实验中培养基中含有的金属离子包括铁离子、亚铁离子、钡离子、钾离子、铜离子、锌离子、氯离子及镁离子等。

研究结果显示铁离子、亚铁离子、钾离子、镁离子以及锰离子在一定程度上能够促进阿卡波糖的生物合成作用，其中有最显著作用的是铁离子，主要表现为阿卡波糖的产量在铁离子含量增大的过程中逐渐增大，最佳浓度范围为0.9~1.5g/l，最佳浓度为1.2g/l，超过这一浓度范围，阿卡波糖的产量显著下降；而培养基中的钙离子以及碳酸钙在一定程度上能够通过调节pH，使细胞更具通透性。

因此，在培养基中添加一定含量的碳酸钙能够促使胞体向外分泌刺激代谢产物。

研究发现，培养基中含有2g/l的碳酸钙时阿卡波糖有最高产量。

五、结束语综上所述，本文围绕着阿卡波糖的摇瓶发酵生产以及培养基组成成分的优化，根据微生物发酵培养基的温度、pH、微生物的接种量、接种方法、通气量及培养时间等对发酵有相当影响的多个因素，寻求更为高效的发酵生产策略，了解实验摇瓶发酵及培养基组分构成配方如何能够促进阿卡波糖的生物合成作用，得到最佳培养基成分表，提高阿卡波糖生产发酵量及生物合成能力。

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