摇瓶发酵优化——正交实验实验方案

摇瓶发酵优化——正交实验实验方案
实验内容：运用实验室摇瓶发酵技术，研究不同的镁盐、钾盐、钠盐及碳源用量对铜绿
假单胞菌摇瓶发酵的影响。

实验材料：铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa
仪器设备：超净工作台；高压蒸汽灭菌锅；旋转式摇床；磁力搅拌器；纯水机；三角摇
瓶；三角瓶封口膜；塑料培养瓶；1mL和5mL移液枪；酒精灯；电子天平；药匙；1000mL 烧杯；玻璃棒等。

试剂耗材：蛋白胨；牛肉膏；NaCl；NaNO3；K2HPO4;KH2PO4；MgSO4;CaCl2;KCl；NaCl；酵母粉；大豆油。

实验因素和水平：本实验研究镁盐、钾盐、钠盐及碳源用量四个因素及不同用量三个水平。

MgSO4(g/L) KCl(g/L) NaCl(g/L) 大豆油（mL）因素
水平
1 0.1 1 1 0
2 0.2 2 5 0.3
3 0.3 3 10 0.9
L9（3 4）正交表
实验数因素
MgSO4 KCl NaCl 大豆油实验结果
1 0.1 1 1 0
2 0.1 2 5 0.3
3 0.1 3 10 0.9
4 0.2 1
5 0.9
5 0.2 2 10 0
6 0.2 3 1 0.3
7 0.3 1 10 0.3
8 0.3 2 1 0.9
9 0.3 3 5 0
均值1
均值2
均值3
极差
具体实验方法：
1、种子培养基及母液的配制
种子培养基（g/L）:蛋白胨10 , 牛肉膏10 , NaCl 5, pH7.0
按种子培养基配方配制100mL培养基装入250mL三角烧瓶，塞上瓶塞。

（50mL/瓶，2瓶）
母液：各1000mL，于试剂瓶中。

K2HPO4 40g/L
KH2PO4 40g/L
MgSO4 20h/L
CaCl2 1g//L
KCl 10g/L
共9个实验，为简便起见，只做2个平行，共18个摇瓶，每个摇瓶装液量30mL，共540mL，考虑到分装时的损耗，可以配600mL含共有成分的培养基。

2、器具及种子培养基高压蒸汽灭菌
培养皿、接种针和移液管用报纸包好，和配好的种子培养基一起高压蒸汽灭菌，121℃，20min.
3、菌种的活化
将种子培养基分装于塑料培养瓶中，将铜绿假单胞菌从冰箱中取出，在超净工作台上，用接种针接种于种子培养基中，使其活化。

4、按预定方案配制培养基
发酵培养基（g/L）:NaNO3 2.5, K2HPO4 4, KH2PO4 4, MgSO4 0.2, CaCl2 0.1 ,KCl 1, NaCl 1, 酵母粉1，炸货油5%，pH6.5
按发酵培养基的配方，结合正交表，配制相应的发酵培养基各200mL，然后分装于150mL
三角瓶中，每瓶30mL。

5、发酵培养基的灭菌
将三角摇瓶用三角瓶封口膜封好，于121℃灭菌20min。

6、接种
于超净工作台上用移液枪各接种2mL活化的铜绿假单胞菌于各三角瓶中。

7、培养
将接种好的三角瓶放在旋转式摇床上培养，设定好温度与转速。

8、测定
发酵3天后，进行排油圈和表面张力的测试。

测定剩下的发酵液收集起来置4 ℃冰箱保存备用。

9、数据整理和分析
用正交设计助手整理数据和作图，得出结论。

疑问：
1、哪种用量的镁盐、钾盐、钠盐及碳源最适宜于铜绿假单胞菌摇瓶发酵？
2、铜绿假单胞菌菌种怎样保存？。