毕赤酵母的摇瓶发酵方法
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选【范本模板】
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1。
挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250—300r/min 培养过夜；2. 取100-500µl （≤1：100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250—300r/min培养过夜(约20h）,至OD600 达到1.3～1。
5;3。
将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4。
按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5。
按步骤3 离心,用2—5ml,1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6。
按步骤3 离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul；备注:可将其分装为80 µl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。
对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。
一般对于甲醇诱导菌株,摇瓶一天左右后开始补加甲醇,就类似BMMY的功能了。
✓KM71比GS115生长的要慢。
毕赤酵母都应该是白色菌落的✓对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性？菌种保存：挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1：1加入30％灭菌甘油，—80o C ul/管冻存（一般用10ug以上质粒用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O 重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下：1)酶切体系（80ul)中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC,混匀2)—20℃20分钟沉淀3）13200rpm,20min，离心后弃上清4)75％乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清5)37 度烘箱至无乙醇气味(或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。
2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。
3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。
一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。
将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。
4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。
5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。
6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。
7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。
7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。
8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。
毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。
2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。
3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。
4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。
5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。
6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。
要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。
同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。
毕赤酵母发酵工艺手册
毕赤酵母发酵工艺手册1. 引言欢迎使用毕赤酵母发酵工艺手册。
本手册旨在介绍毕赤酵母发酵的基本原理、工艺步骤以及相关注意事项。
通过遵循本手册，您可以更好地理解和掌握毕赤酵母的发酵过程，从而在生产中取得更好的效果。
2. 毕赤酵母发酵基本原理- 毕赤酵母是一种常见的酵母菌，其发酵能力强，适用于多种发酵产品的生产。
- 发酵是指通过酵母菌对底物中的糖类进行代谢，产生酒精和二氧化碳的过程。
- 毕赤酵母在发酵过程中需要适宜的温度、pH值和营养物质等条件。
3. 毕赤酵母发酵工艺步骤1. 发酵前准备：- 准备好所需的发酵基质，包括糖类、氮源和维生素等。
- 对基质进行消毒处理，确保无害菌的存在。
2. 接种毕赤酵母：- 选择合适的毕赤酵母培养液进行接种，注意接种量的控制。
- 将毕赤酵母培养液均匀加入发酵基质中。
3. 发酵条件控制：- 控制发酵温度在合适的范围内，一般为25-30摄氏度。
- 监测发酵基质的pH值，保持在适宜的范围内。
- 提供足够的氧气供给，促进酵母的生长和代谢。
4. 发酵过程监测：- 定期对发酵过程中的温度、pH值和酵母数量等进行监测和记录。
- 根据监测结果及时调整发酵条件，确保发酵过程稳定进行。
5. 发酵结束：- 当发酵基质中的糖类被完全代谢，产物达到预期时，发酵过程结束。
- 将发酵产物经过处理和提取，得到最终的产品。
4. 注意事项- 在发酵过程中，应注意卫生和消毒，以防止杂菌的污染。
- 严格控制发酵条件，避免过高或过低的温度、pH值对发酵效果产生不利影响。
- 根据不同的发酵产品，可能需要调整发酵步骤和条件，建议根据具体要求进行调整。
- 在使用本工艺手册时，请参考其他文献和专业意见，确保准确性和可靠性。
以上是关于毕赤酵母发酵工艺手册的简要介绍。
希望本手册能对您在毕赤酵母的发酵工艺中提供帮助和指导。
如有任何问题，请随时与我们联系。
谢谢！。
常用试剂培养基 毕赤酵母实验技术
主要培养基：10×YNB（13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）：溶解13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。
500×B（0.02%生物素）：溶解20mg生物素于100mL 水中，过滤除菌，放于4℃。
100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃。
10×D（20%葡萄糖）：溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1年。
500×生物素(0.02%)：溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃，可放1年。
100×H（0.4%组氨酸）：溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50 度加热以促溶解，过滤除菌，可放1年。
10×M（5%甲醇）：混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4℃，可放2个月。
10×GY（10%甘油）：混合100mL甘油与900mL 水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上。
100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃，可放1年。
1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0：32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为6.0±0.1（如果需调pH值，用磷酸或KOH）。
过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。
100mg/mL遗传霉素：用无菌水制备30mL 100mg/mL 遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20℃。
用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0。
LB培养基：5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH7.0；高压灭菌后4℃保存。
毕赤酵母摇瓶产木聚糖酶发酵条件的优化
70
江 西 化 工
2009 年第 1 期
表 2 不同氮源对产酶的影响
氮源 种类
牛肉膏
酵母 浸膏
蛋白胨酵蛋母白膏胨+
尿素
硫酸铵
酶活
(IU·ml - 1) 796 978 528
510
217 284
从实验结果可以看出 ,有机氮源明显优于无机氮 源 ,其中酵母浸膏可使酶活接近 1000 IU/ ml ,加之牛肉 膏价格因素 ,因此选用酵母浸膏作为氮源进行发酵 。 2. 3 正交试验
表 4 正交实验结果及分析
实验号 温度 接种量 pH
甲醇 实验 浓度 结果
1
1
1
1
1
1086
2
1
2
2
2
1509
3
1
3
3
3
1004
4
2
1
2
3
1410
5
2
2
3
1
1133
6
2
3
1
2
1308
7
3
1
3
2
1154
8
3
2
1
3
1085
9
3
3
2
1
1256
ห้องสมุดไป่ตู้
均值 1 1199. 667 1216. 667 1159. 667 1158. 333
2009 年 3 月
毕赤酵母摇瓶产木聚糖酶发酵条件的优化
71
3 小结 本研究通过对毕赤酵母菌株产木聚糖酶发酵条件
进行了研究 ,得到该工程菌最佳碳源为麸皮 ,最佳氮源 为酵母膏 ,通过正交实验得到工程菌的最佳摇瓶培养 条件为 30 ℃、接种量 10 %、初始 pH5. 5 、初始甲醇含量 1. 0 % ,并确定了甲醇最佳诱导时间为 18h。该酶的耐 热稳定最高为 70 ℃。
毕赤酵母发酵罐发酵
微生物发酵罐发酵（毕赤酵母）灭菌前：室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母发酵）用6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵pH很长时间是碱性的（如某些细菌发酵）用6.86校正零点，9.18校正斜率）；室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定，100%点接上溶氧电极，放置在空气中较定；或2.0点在灭菌过程中，温度达到121度左右压力0.12mpa左右时候标定，100%在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定，转速在发酵初始转速，通气量在发酵初始通气量时候标定灭菌：1.灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80~90℃，将排气阀逐渐关小。
接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。
2.保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。
（注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。
）灭菌后:A.消耗甘油阶段1.灭菌后冷却30℃时：2.冷却至30℃时，开启搅拌(转速最大)和通气(0.1-1.0vvm),接通28%氨水(未稀释)调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐；3.从摇瓶中接种种子液，DO值为100%，开始培养后会消耗，导致DO值下降，通氧气以确保DO值超过20％，速率先为0.1vvm。
4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。
【每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。
】5.这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。
毕赤酵母发酵手册
毕赤酵母发酵手册毕赤酵母发酵手册总览简介：毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。
毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度，我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。
因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。
下面+s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃所给出的指导是基于MutMut和发酵罐中发酵而成。
请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。
下面所给出的表就是整个发酵参数：在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。
下面的表格描述了这些参数和※设备推荐：下面是所推荐设备的清单：·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。
你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。
这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。
·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。
·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。
·添加甘油和甲醇的补料泵。
·pH的自动控制。
培养基的准备：你需要准确配置下列溶液：·发酵所需的基本盐类（第11页）·PTM补充盐类（第11页）1·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM补充盐每升甘油。
1·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM补充盐每升甲醇。
1毕赤酵母生长的测定：在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。
培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。
溶氧的测定：简介：溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。
毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。
毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。
然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。
毕赤酵母转化方法
毕赤酵母转化方法
实验概要
本实验介绍了毕赤酵母电转化方法。
该方法无需产生去壁细胞，是产生毕赤酵母重组子的简便方法。
与去壁细胞效率相似。
实验步骤
1. 细胞准备：
1) 在含5mlYPD 的50ml 离心管中，培养毕赤酵母，30 度过夜。
2) 取0.1-0.5ml 过夜培养物，接种含500ml 新鲜培养基的2L 摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5。
3) 在4 度，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞。
4) 如上离心，用250 ml预冷的灭菌水悬浮细胞。
5) 如上离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞。
6) 如上离心，用1 ml 预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml。
注意：可冻存80ul 等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多。
2. 转化：
1) 取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA(溶于5-10ulTE)混合，转入预冷的0.2cm 电转杯中。
2) 在冰上放置5min。
3) 根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击。
4) 立即加入1ml 预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中。
5) 分成200-600ul等份，涂于MD 或RDB平板上。
6) 在30 度孵育平板至克隆产生，筛选Mut /Muts表型。
毕赤酵母转化方案
毕赤酵母转化方案引言毕赤酵母（Baker’s Yeast）是一种常见的酵母菌，广泛用于食品加工和发酵过程中。
毕赤酵母可以将碳源转化为二氧化碳和乙醇，从而实现食品发酵和面团膨胀。
本文将介绍毕赤酵母的转化方案，包括酵母培养、酵母转化条件以及转化效果的评价。
酵母培养在进行毕赤酵母的转化实验之前，首先需要进行酵母的培养。
以下是酵母培养的步骤：1.将酵母菌存活液取出适量转移到含有酵母培养基的培养皿中。
2.用无菌棉签在培养皿上划线，以便观察酵母生长情况。
3.将培养皿封闭并置于恒温摇床中，在适当的温度下培养酵母。
酵母转化条件酵母的转化条件对于转化效果具有重要影响。
以下是常见的酵母转化条件：温度酵母转化的温度是一个重要的参数，常用的温度范围为25-40摄氏度。
不同温度下酵母的代谢和生长速率不同，因此选择合适的转化温度可以提高转化效率。
pH值pH值是影响酵母生长和代谢的另一个重要参数。
酵母转化的pH范围通常为4-7，在这个范围内酵母的生长和代谢能力较强。
溶氧量溶氧量是影响酵母转化效果的另一个因素。
较高的溶氧量可以促进酵母的生长和代谢，提高转化效率。
因此，在实验过程中应保证适当的氧气供应，通过搅拌或通气的方式提高溶氧量。
传质条件传质条件（如搅拌速度、传质面积等）也会对酵母转化效果产生影响。
适当的搅拌可以保证培养液中养分的均匀分布，提高转化效率。
同时，增加传质面积（如使用气泡或转子发酵罐）可以增加酵母与培养基之间的接触面积，促进转化反应进行。
转化效果评价转化效果通常通过酵母的生长情况、代谢产物的生成以及发酵过程的监测来进行评价。
1.酵母的生长情况可以通过观察培养液中的酵母颗粒的数量和大小以及液体的浑浊度来判断。
较好的转化效果应该能够促使酵母迅速生长和繁殖。
2.代谢产物的生成是评价转化效果的重要指标之一。
对于毕赤酵母来说，主要的代谢产物是二氧化碳和乙醇。
可以通过气体检测仪或化学分析方法来测定其生成量，以评估转化的效果。
毕赤酵母产木聚糖酶实验方案(最终)
重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验一、实验目的1)熟练摇瓶发酵的操作流程和无菌操作技术。
2)掌握细胞浓度、产物浓度的表征和测定方法。
3)熟悉测定生长曲线和产物生成曲线的方法。
二、毕赤酵母简介甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。
40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。
随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。
在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。
70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。
在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。
成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。
1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。
毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。
而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。
AOX的合成是在转录水平调控的。
其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。
此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。
外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。
毕赤酵母感受态细胞制备
毕赤酵母感受态细胞制备
1.毕赤氏酵母GS115感受态细胞制备
(1)从YPD平板上挑取单菌落2~3个于含25mL YPD的250mL 三角瓶中，220r/min，30o C过夜（下午5点接，到第二天9点转接）;
(2)取1mL 过夜培养物，接种含50mL 新鲜培养基（YPD）的250mL 摇瓶（接种两瓶，共100mL培养液），生长至OD600~1.3-1.5(4h左右）；
(3)将100mL培养液分装于3个50mL离心管中，4o C，5000g 离心5min，用少许预冷的灭菌水悬浮细胞后并于1管中，加预冷的灭菌水至20mL；
(4)如上离心，用10mL 预冷的灭菌水悬浮细胞；
(5)如上离心，用10mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞；
(6)如上离心，用0.5mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞。
2.转化（电击转化）
(1)取80μL上述细胞与10μL 线性化DNA混合，转入预冷的0.2cm电转杯中；
(2)在冰上放置5min；
(3)根据所使用电转仪制造商推荐的酿酒酵母参数进行电击细胞（1.5KV，6ms）；
(4)立即加入0.9 mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；
(5) 5000g离心5min，剩余200μL菌液吹吸重悬细胞，涂布1块MD平板；
(6)在30o C孵育平板至菌落明显形成（大约3~4天）。
摇瓶发酵实验的步骤
摇瓶发酵实验的步骤
嘿，朋友们！今天咱来唠唠摇瓶发酵实验的那些事儿。
你想想啊，这摇瓶发酵就好比是一场微生物的大派对！咱就是那个派对组织者，得把一切都安排得妥妥当当的。
首先呢，咱得准备好摇瓶，这就像是给微生物们准备好的豪华房间。
摇瓶得干净、无杂质，不然微生物们可不乐意住呢！然后就是培养基啦，这可是微生物们的美食大餐呀，得精心调配，各种营养成分都不能少，就像咱做饭得有肉有菜有调料一样。
把培养基加到摇瓶里，这就相当于给房间摆上了美味佳肴。
接下来，就是接种啦！把咱精心挑选的微生物种子小心翼翼地放进去，就好像是邀请贵宾入场一样。
然后呢，把摇瓶放到摇床上，让它开始欢快地摇晃起来。
这摇床就像是微生物们的游乐场，它们在里面尽情地玩耍、生长。
在这个过程中，咱可不能掉以轻心啊！得时刻关注着微生物们的状态，看看它们是不是吃得饱饱的，玩得开开心心的。
要是发现有啥不对劲，咱可得赶紧想办法解决呀，不然这场派对可就搞砸了。
你说这微生物多神奇呀，就那么小小的一点，在咱给它们创造的环境里就能茁壮成长。
咱就像是它们的守护天使，看着它们一点点长大，心里是不是特有成就感？
有时候我就想，这微生物的世界咱人类还真得多研究研究。
它们虽然小，可作用大着呢！说不定哪天就能给咱带来大惊喜。
等发酵结束了，咱就可以收获成果啦！看看那些微生物们给咱带来了什么好东西。
这就像是打开一份神秘的礼物，充满了期待和惊喜。
总之呢，摇瓶发酵实验可有意思啦！只要咱用心去做，肯定能收获满满。
大家都来试试吧，让我们一起在微生物的世界里尽情探索！。
毕赤酵母的摇瓶发酵方法
毕赤酵母的摇瓶发酵方法：一、摇瓶发酵方法:毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，1、酵母菌株生长阶段；2、脂肪酶诱导表达阶段。
1、酵母生长阶段。
准备试剂：1000ml BMGY培养基，1000ml BMMY培养基，10X的甲醇，摇瓶1L（灭菌），温控摇床，50ml离心管（灭菌）。
紫外分光光度计，石英比色皿。
以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
（1）往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMGY培养基，然后加入约1ml 脂肪酶菌株（培养基：菌液=100：1），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过）。
置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母生长，OD600=2.0-6.0，时间约为15-24小时。
（2）将发酵液转入50ml离心管，1500g-3000g离心5min。
去掉上清，用BMMY培养基将菌体浓度稀释至OD600=1.0，约有500ml左右。
将稀释后的发酵液分别加入到1L的药瓶中，每个摇瓶150ml 发酵液（绝不能超过200ml）。
（3）将摇瓶置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母表达脂肪酶，每24小时加入一次5%的甲醇，使甲醇的终浓度为0.5%。
连续诱导表达48小时。
（4）将发酵液进行12000rpm/min离心5min，取上清（若上清仍混浊，可反复离心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMGY培养基的配制（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物（Yeast Extract）,加水至700ml；1210C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml，10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甘油 100ml。
毕赤酵母发酵罐发酵资料讲解
毕赤酵母发酵罐发酵微生物发酵罐发酵（毕赤酵母）灭菌前：室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母发酵）用6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵pH很长时间是碱性的（如某些细菌发酵）用6.86校正零点，9.18校正斜率）；室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定，100%点接上溶氧电极，放置在空气中较定；或2.0点在灭菌过程中，温度达到121度左右压力0.12mpa左右时候标定，100%在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定，转速在发酵初始转速，通气量在发酵初始通气量时候标定灭菌：1.灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80~90℃，将排气阀逐渐关小。
接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。
2.保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。
（注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。
）灭菌后:A.消耗甘油阶段1.灭菌后冷却30℃时：2.冷却至30℃时，开启搅拌(转速最大)和通气(0.1-1.0vvm),接通28%氨水(未稀释)调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐；3.从摇瓶中接种种子液，DO值为100%，开始培养后会消耗，导致DO值下降，通氧气以确保DO值超过20％，速率先为0.1vvm。
4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。
【每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察. 将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。
】5. 这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。
毕赤酵母菌种培养手册
毕赤酵母菌种培养手册1. 引言本手册旨在提供毕赤酵母菌种培养的详细步骤和注意事项。
毕赤酵母（Saccharomyces cerevisiae）被广泛应用于食品工业、酿酒业和生物学研究等领域。
通过正确的菌种培养技术，可以确保毕赤酵母的活力和纯度，从而保证实验和应用的可靠性和准确性。
2. 材料和方法2.1 培养基选择适合的培养基是培养毕赤酵母的关键。
常用的培养基包括YPD培养基、SD培养基和SC培养基等。
根据具体实验需求选择合适的培养基配方，并按照相应操作说明制备。
2.2 菌种的制备和传代1. 从冰冻保存的毕赤酵母菌种中取出适量菌种转移到无菌培养基中。
2. 在适当的温度（通常为30°C）下培养菌种至对数生长期。
3. 取适量无菌培养基转移菌种，传代培养。
2.3 菌种培养1. 取适量菌种转移到含有适量无菌培养基的培养瓶中。
2. 控制培养瓶中的菌液浓度，通常为OD600=0.5。
3. 在适当的温度（通常为30°C）下培养菌种至对数生长期或其他实验所需生长期。
2.4 菌种保存菌种的保存有助于长期维持活力和纯度。
常用的保存方法包括冷冻保存和制备冻干菌种等。
3. 结果和讨论通过本手册提供的方法，可以成功培养并维持毕赤酵母菌种的活力和纯度。
在培养过程中，应注意操作的无菌性和培养条件的合适性。
此外，根据具体实验需求，可适当调整菌液的浓度和培养温度等参数。
4. 总结本手册详细介绍了毕赤酵母菌种培养的步骤和注意事项。
正确的菌种培养技术对于保证实验和应用的可靠性和准确性至关重要。
通过遵循本手册的指南和方法，可以有效地培养毕赤酵母菌种，并取得可靠的实验结果。
请注意，本手册仅提供参考，并且在使用过程中应遵守相关的实验室安全操作和法律法规要求。
毕赤酵母产木聚糖酶实验方案
重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验毕赤酵母简介甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。
40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。
随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。
在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。
70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。
在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。
成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。
1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。
毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX ——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。
而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。
AOX的合成是在转录水平调控的。
其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。
此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。
外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。
巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。
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毕赤酵母的摇瓶发酵方法：
一、摇瓶发酵方法: 毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，1、酵母菌株生长阶段；
2、脂肪酶诱导表达阶段。
1、酵母生长阶段。
准备试剂：1000ml BMGY培养基，1000ml BMM培养基，10X的甲醇，摇瓶1L （灭菌），温控摇床，50ml 离心管（灭菌）。
紫外分光光度计，石英比色皿。
以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
（1）往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMG培养基，然后加入约1ml脂肪酶菌株（培养基：菌液=100：1），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过）。
置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母生长，
OD600=2.0-6.0 ，时间约为15-24 小时。
（2）将发酵液转入50ml离心管，1500g-3000g离心5min。
去掉上清，用BMMY 培养基将菌体浓度稀释至OD0°=1.0，约有500ml左右。
将稀释后的发酵液分别
加入到1L的药瓶中，每个摇瓶150ml发酵液（绝不能超过200ml）。
（3）将摇瓶置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母表达脂肪酶，每24小时加入一次5%的甲醇，使甲醇的终浓度为0.5%。
连续
诱导表达48 小时。
（4）将发酵液进行12000rpm/min离心5min，取上清（若上清仍混浊，可反复离心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMG培养基的配制（1000ml）: 20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物（Yeast Extract）,加水至700ml; 121°C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml, 10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甘油100ml。
BMM培养基的配制方法（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物，加水至700ml；1210C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10XYNB100ml, 10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X 甲醇100ml。
10X的甲醇的配制：取甲醇（AR上海医药集团有限公司）5ml，加入无菌水95ml，配置成5%勺甲醇溶液，用0.22卩M的微孔滤膜（millipore 公司）过滤除菌，该溶液在常温下的保质期为两个月。
10X的YNE配制方法（1000ml）:称取YNB（生化试剂，上海生物工程公司，不含
硫酸铵）34g，加入100g硫酸铵，待完全溶解后，用0.22卩M的微孔滤膜（millipore 公司）过滤除菌。
该溶液在常温下的保质期可以达1 年。
10X的磷酸缓冲液的配制方法：分别配制1M的&HPO和KHPQ,然后将132ml
的K2HPQ和868ml的KHPQ混合，调节PH至6.0 ;调PH用磷酸或者KQH然后1210C高温灭菌20min。
该溶液在常温下的保质期可以达1年以上。
10X的甘油的配制方法（1000ml）：取100ml的甘油加水至1000ml，然后1210C 高温灭菌20min。
该溶液在常温下的保质期可以达1年以上。
5．问：在下是初学者，关于毕赤酵母的诱导表达有些问题：
每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5〜1.0%”这里的甲醇浓度如何控
制？
还有，关于BMMY 的甲醇浓度有些材料里的是0.5% ，有的是1 .0% ，应该是哪个？“每
24h 向培养基中添加100 %甲醇至终浓度为0.5 〜1.0%”这里的甲醇浓度和BMMY 中的甲醇浓度是要一致的吗？
另外一个小问题，配10%甘油时，移入量筒的 1 00%甘油一部分会粘在管壁上，难免
最后配成的10%甘油会有所偏差，这样要不要紧？操作上是否有问题？
参考见解1 ：k4N*vx1 ~
“每24h 向培养基中添加100 %甲醇至终浓度为0.5 〜1.0%” 我可以给你解释一下：#qbk! 40Vh5o*UF
1 、它的意思是每隔24 小时，不断的添加纯甲醇（指的是甲醇试剂含有100 %甲醇，
不含有其他的成分）至终浓度为0.5 〜1.0%，指的是添加的甲醇占总体积的0.5 〜1.0%（即每100 升培养基含有甲醇0.5 〜1.0 升，如果是质量体积比则是每100 毫升培养基含有甲醇
0.5 〜1.0克）
2、只要你添加的量在以上的这个范围就可以，
当然可以根据实验的实际情况进行调整，
但是一般要在此范围内。
&m9~5k&&b@* 8w
3、配10%甘油时，注意先加入部分水后在称取甘油加入，然后在定容到所需要的体积，这样就可以避免甘油粘在管壁上，甘油易溶于水，配好后，再粘在管壁上就不会影响了。
4、建议你对实验的基础知识多多学习，你会又很大进步的！！&Gh*1AM8
参考见解2：5 44LbP9
1 、如何确保加入后甲醇浓度在此范围内？你可以进行检测啊！只要检测你的培养基中剩余的甲醇含量即可，可以计算出你应该加多少甲醇，24 小时可以检测一次。
wM7Eq&W&6RM7 0Q8M
2、至于为什么24 小时加一次，具体原因我不是很清楚，但是我觉得应该是发酵中（尤其是发酵瓶）培养基的体积太小，不能太多的取样，取样太多会影响体积、蒸发量、无菌等指标的。
而且在这个时间内酵母在甲醇终浓度为0.5 〜1.0%中生长在其许可范围内，其甲醇消耗不会超过这个范围的，时间安排也比较合理，所以可能是个经验值吧！！其实不需要考虑甲醇的消耗，只要检测它的剩余即可，根据剩余可以计算出你需要加入的甲醇体积或者
3、另外你不一定一次就加入，可以连续的在24 小时加入，不过操作就非常麻烦了，
发酵罐还可以，摇瓶怎么办呢！！2w“
4、至于一定时间从中取出1ml,这个变化应该不需要要计算进去的吧，你取样的浓度和你培养基里面的是一样的，如果这考虑进去的话，那么蒸发量、两种液体混合的体积变化、湿度等等你也要考虑，就太繁了，他们的影响很小的，没有必要计算在内。