抗人DR5单链抗体噬菌体展示文库的建立和筛选

入 50 μl 甘氨酸-盐酸（pH2.2）室温孵育 10 min，吸 出后加 3 μl Tris（2 mol/L）中和。加入 2 ml 新鲜制备 的 XL1-Blue，37 ℃震荡培养 20 min，取 1 μl 铺板测 定库容。剩余的转入 200 ml 2×YT 培养基中，进行第 2 轮筛选，如此“吸附-洗脱-感染扩增”共筛选 5 轮。 1.5 单链抗体的 ELISA 检测 将第 5 轮富集的噬菌 体感染新鲜的 XL1-Blue 菌，37 ℃培养 1 h 后涂板过 夜，随机挑选 20 个单菌落，分别接种于 1 ml 2×YT 培养基中，37 ℃培养至 A600 nm=1 时加入辅助噬菌体， 37 ℃培养 1 h，4 000 r/min 离心，重悬沉淀于 4 ml 2×YT（氯霉素+卡那霉素）培养基中，37 ℃培养过夜。 离心取上清做免疫学鉴定：各取上清抗体库 100 μl 加入到 DR5 抗原（1 μg/ml）包被的 ELISA 板中反 应 1 h，用 PAK100 做阴性对照。用 TBST 洗 5 遍，加 入 1 ∶5 000 稀 释 HRP -M13 抗 体 ，37 ℃ 孵 育 1 h， TBST 洗 5 遍后，加显色剂，酶标仪测定 A450 nm 值，高 于阴性对照 2.1 倍以上视为阳性。 1.6 抗体基因序列测定 选择表达高亲和力抗体的 噬菌粒，送上海英骏生物公司测序。
scFv 基因，以 SfiⅠ位点定向插入 PAK100 噬菌粒载体，转化 E. coli XL1-Blue，构建了库容为 1×106 的抗 DR5 单链抗体库。对抗
体库进行 5 轮富集筛选后，phage-ELISA 检测阳性克隆的抗原特异性，取 1 株阳性克隆进行测序分析。结果 抗 DR5 scFv 基因
LIU Ruimin, JI Zejun, SUN Yingchuan, ZHANG Aihong, BAI Huiling, MA Yuanfang Key Laboratory of Cellular and Molecular Immunology, Institute of Immunology, Henan University, Kaifeng 475000, China
[摘 要] 目的 应用噬菌体展示技术构建抗人 DR5 (death receptor 5，DR5) 单链抗体( si方法 利用重组人 DR5 抗原免疫小鼠，分别扩增小鼠 VH 和 VL 基因，经重叠延伸 PCR 将 VH 和 VL 基因拼接成
单链抗体片段 scFv 具有相对分子质量小、免疫 原性低、穿透力强等优点，克服了鼠源性单抗免疫原 性强、相对分子质量、不易穿过血管壁的缺陷，使得 抗 DR5 scFv 在临床免疫治疗中具有良好的应用前 景[4]。此外，噬菌体展示技术的出现为制备小分子抗
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免疫学杂志 2011 年 11 月 第 27 卷 第 11 期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 27 No. 11 Nov. 2011
细胞有毒性作用，限制了其在临床上的应用。一些抗 TRAIL 死亡受体的单克隆抗体具有死亡受体配体的 功能活性，能模拟 TRAIL 的作用，诱导肿瘤细胞凋 亡，而且对正常人的肝细胞等没有毒副作用[3]。但是 单克隆抗体在进入临床中受到了很大限制，原因之 一是动物源性抗பைடு நூலகம்在人体应用时容易诱发人抗鼠抗 体（HAMA）反应，产生不良反应。
免疫学杂志 2011 年 11 月 第 27 卷 第 11 期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 27 No.11 Nov. 2011
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·论 著·
[ 文章编号 ]1000-8861（2011）11-0945-04川，张爱红，朱诗白，白慧玲 *，马远方 *
基 金 项 目 ： 传 染 病 预 防 控 制 国 家 重 点 实 验 室 开 放 课 题 (2008S KLID308); 河南省重点科技攻关资助项目( 0224630174) 作者单位：475004 开封，河南大学医学免疫学研究所院 细胞与分子 免疫学重点实验室（刘瑞敏，季泽俊，孙颖川，张爱红，朱诗白，白慧 玲，马远方）；473000，南阳医学高等专科学校第一附属医院药剂科 （季泽俊） * 通信作者：白慧玲，Tel：0378-3880398；E-mail：kfbaihuiling@yahoo. ；马远方，Tel：0378-3880398；E-mail：mayf@
[Key words] Phage display technique; Death receptor 5; Single-chain antibody
肿 瘤 坏 死 因 子 (TNF) 相 关 的 凋 亡 诱 导 配 体 (TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL) 能够 诱 导 多 种 肿 瘤 细 胞 和 转 化 细 胞 发 生 凋 亡 。 TRAIL 诱 导肿瘤细胞凋亡是通过其受体 TRAIL-R1(death receptor 4，DR4) 及 TRAIL -R2 (death receptor 5， DR5)[1-2]介导的，但一些研究发现 TRAIL 对正常的肝
体提供了有效手段。本研究利用噬菌体展示技术构建 抗 DR5 单链抗体库，筛选针对 DR5 高亲和力 scFv， 为今后 DR5 抗体的研究和应用提供实验基础。
1 材料与方法
1. 1 实验材料 AMV-Reverse Transcriptase ( Promega 公 司 )，WizardPlus SV Minipreps DNA Purification System，HRP 标记抗 M13 抗体购自 Promega 公司，限 制性内切酶 Sfi I，T4 连接酶购自 NEB 公司。
序列长 747 bp，编码 249 个氨基酸，具有和 DR5 结合的特异性。结论 本文利用噬菌体抗体库筛选到了抗 DR5 scFv，为研制临
床免疫治疗的新型抗体奠定了实验基础。
[关键词] 噬菌体展示技术；死亡受体 5；单链抗体
[中图分类号] R392.1
[文献标识码] A
Construction and panning of single chain Fv phage display library against anti-DR5
2 结果
2.1 单链抗体基因扩增 从免疫小鼠脾细胞中提取 总 RNA，逆转录合成 cDNA 第一链，以此链为模板， 经 PCR 扩增得到全套 VH 和 VL 基因。电泳结果显 示，VH 和 VL 片段约为 350 bp，VH 和 VL 基因拼接 后的 scFv 片段长度约为 750 bp (图 1)，与预期片段 大小相符。
[Abstrac t] The study aim to construct single chain Fv (scFv) library against human death receptor 5 by phage display technique and to obtain the anti -DR5 scFv clones selected from the library. Total RNA was extracted from splenocytes of the Balb/c mice immunized with recombinant human DR5. Complementary DNA fragments of variable heavy (VH) and variable light (VL) chains of antibodies were prepared by RT-PCR and assembled into scFv. Then the scFv fragment was inserted into the phagemid vector PAK100 through SfiⅠsites. The phagemids containing scFv cDNA were transformed into E. coli XL1 -Blue bacterial cells to generate scFv antibody library with a diversity of approximately 1×106. Five rounds of enrichment and panning were performed to select specific anti -DR5 scFv from the library. The antigen binding activity was evaluated via ELISA assay. Sequencing analysis of one positive clone showed that the anti -DR5 scFv was 747 bp, and coded 249 amino acids. The results mean an anti-DR5 scFv is obtained from scFv antibody library, which set a base for seeking novel antibodies of using in immunotherapy.
质粒 PAK100、E. coli XL1-Blue、辅助噬菌 体 VSCM13 为本实验室保存，重组人 DR5 由本实验室 制备。根据文献[5]设计引物，由上海英骏生物公司合 成引物。6～8 周龄雌性 Balb／c 小鼠购自上海西普尔 一必凯实验动物有限公司。 1.2 动物免疫 以 DR5 抗原 100 μl (100 μg)与等体 积弗氏完全佐剂乳化后，初次免疫 Balb/c 小鼠。15 d 后，腹腔注射与不完全弗氏佐剂乳化的 DR5 加强免 疫。1 周后取小鼠血清，常规 ELISA 法检测抗体滴 度。滴度达 1∶105 后，进行再次免疫，剂量同前，3 d 后 处死小鼠取脾脏。 1.3 抗体库的构建 取抗体效价最高的小鼠脾脏， Trizol 试剂提取总 RNA，RT-PCR Kit 逆转录合成 cDNA。按照参考文献[5]以 cDNA 为模板扩增全套 VH 和 VL 基因，将扩增得到的重、轻 链产物 进 行 重叠延伸 PCR 扩增出 ScFv 片段。PCR 反应参数为: 预变性，92 ℃ 3 min；92 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 个 循 环 ；92 ℃ 1 min，63 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，25 个循环；延伸 72 ℃ 10 min，回收 scFv 片 段。ScFv 片段和载体 PAK100 经 SfiⅠ酶切后，T4 连 接酶连接，电转化入 E. coli XL1-Blue 感受态细胞， 转入含有 5 ml 培养基（2×YT+2%G）的摇菌管中， 37 ℃，培养 1 h 后取 10 μl 涂布含有氯霉素抗性的 培养皿并培养过夜，其余的加入 20 ml 2×YT 培养液 （氯霉素+2%G）30 ℃，培养 4 h，加入辅助噬菌体 VSCM13，37 ℃，培养 1 h，4 000 r/min 离心 10 min， 将沉淀重悬于 200 ml 2×YT 培养液（氯霉素，卡那霉 素）中，30 ℃培养过夜。4 000 r/min 离心 10 min 取上 清，加入 1/5 体积的 PEG/NaCl 浓缩沉淀，用 2 ml PBS 重悬即为噬菌体抗体库。随机挑取 10 个克隆，培养 后提取质粒用 SfiⅠ酶切，检测 ScFv 基因插入效率。 1. 4 单链抗体的富集筛选 用 DR5 抗原包被 96 孔 板（第 1 轮 100 μg/ml，第 2 轮 30 μg/ml，第 3 轮 10 μg/ml，第 4 轮 1 μg/ml，第 5 轮 0.5 μg/ml），1% BSA 封闭后每孔加 50 μl 噬菌体库，37 ℃ 2 h，用 TBST 洗 5 遍（第 2 轮 10 遍，后几轮 20 遍），每孔加