实验六 分枝杆菌属的鉴定
微生物检验学之分枝杆菌属及检验
分枝杆菌属及检验分枝杆菌属是一类细长或略带弯曲、为数众多（包括54个种）呈分支状生长的需氧杆菌。
因其繁殖时呈分支状生长故称分枝杆菌。
本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂类，可占其干重的60%，这与其染色性、抵抗力、致病性等密切相关。
耐受酸和抗乙醇，一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后，能抵抗3%盐酸乙醇的脱色作用，故又称抗酸杆菌。
需氧生长，无鞭毛，无芽胞和荚膜。
引起的疾病均为慢性，有肉芽肿病变的炎症特点。
分枝杆菌的种类较多，包括结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌和麻风分枝杆菌。
非典型分枝杆菌是一大群分枝杆菌的总称，与人类有关的非典型分枝杆菌主要有堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈分枝杆菌、鸟分枝杆菌、蟾分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌和耻垢分枝杆菌等。
本属细菌无内外毒素，其致病性与菌体某些成分如索状因子、蜡质D及分枝菌酸有关。
根据国际分枝杆菌分类研究组（IWGMT）的方案将本属细菌分为三类，即缓慢生长菌、迅速生长菌和不能培养菌。
一、结核分枝杆菌在我国引起人类结核病的主要有人型和牛型结核分枝杆菌。
（一）生物学特性1.形态与染色结核分枝杆菌为细长或略带弯曲的杆菌。
在培养基中可呈球状或丝状，陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可见到分枝状。
抗酸染色时因菌体含有大量脂类而不易着色，无论是否经碘液处理，着色后均不易被盐酸乙醇脱色，所以使菌体呈红色。
本菌无芽胞、无鞭毛，近年发现有荚膜。
2.培养特性本菌专性需氧，在无氧条件下迅速死亡，在5%～10%CO2环境中可刺激其生长。
烛缸不适合本菌培养，需用二氧化碳培养箱。
培养温度适应范围较大，35～40℃均可生长，最适温度为35～37℃。
最适pH为6.5～6.8。
兼性胞内寄生菌，在细胞内外均可发育繁殖，强毒株可长期生存于巨噬细胞内。
生长时还需适当的湿度。
本菌生长缓慢，最快的分裂速度为18小时一代。
在固体培养基上，一般需2～6周才能长出菌落。
菌落呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄色，表面呈皱纹状，形似菜花。
分枝杆菌菌种鉴定1
分枝杆菌菌种鉴定1 检测范围用于定性检测来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株样本中的核酸,检测指标包括临床常见分枝杆菌的17个种或群,包括:结核分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、耻垢分枝杆菌。
可用于结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病的辅助诊断,也可用于流行病学调查等领域。
2 方法原理基因芯片( genechip)也称为DNA芯片、DNA微陈列、寡核苷酸陈列,是指采用原位合成(或显微打印手段),将DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针陈列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。
基因芯片对分枝杆菌的菌种鉴定通过在芯片上设计种属特异性寡核苷酸探针,将标记有荧光分子的PCR扩增产物与芯片上的探针在一定的条件下进行杂交反应,根据碱基互补配对原则,序列匹配的PCR扩增产物与探针形成稳定的二级结构。
根据探针在芯片上的特定位置排布,就可以推断出相应被测细菌的相关信息,鉴定出被测细菌的种类采用基因芯片微量点样技术,将检测上述基因的特异探针与各种对照探针固定在基片上,检测探针和对照探针各重复5个点,形成12行×10列的微阵列，每张芯片上有4个同样的微阵列,每一个微阵列可以检测一份样品。
3 检测样本检测适用的标本类型为来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non- tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株。
存在于固体培养基上的待测分离株样本不可冷冻储存，因为冷冻会对后续操作造成影响；存在于液体培养基中的待测分离株样本在-70℃储存不超过5年。
分枝杆菌(检验)
3、蛋白质：有抗原性，与蜡质D结合引起超 敏反应，引起组织坏死和中毒症状，无保 护性。
4、多糖：中性粒细胞增多，致局部细胞浸润
5、核酸：具有感染性
所致疾病
结核病（痨病、慢性消耗性疾病、富贵病） 传染方式：以呼吸道为主的多途径 易感人群：易感率高，发病率低
一、临床意义
（一）致病物质 致病性------菌体成分、毒性代谢产物、炎症 菌体成分： ▪ 荚膜 ▪ 脂质 ▪ 蛋白质 ▪ 多糖、核酸等
1、荚膜： 荚膜的主要成分为多糖，部分为脂质和蛋 白质。 荚膜功能: ①能与吞噬细胞表面补体受体结合，有助 于此菌对吞噬细胞的粘附和侵入；
②荚膜中有多种酶，可降解宿主大分子物质， 作为细菌的营养；
全球结核病疫情现状
据世界卫生组织报道，目前全球有近1/3的 人已感染结核杆菌，也就是20亿人口感染了结核 菌。全球有活动性肺结核病人约2000万，每年新 发结核病人约800-1000万，每年约有300万人死于 结核病。结核病已成为全世界成人因传染病而死 亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高负 担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。
（3）结核病耐药率高：肺结核病人结核菌初始耐 药率为18.6/10万, 继发耐药率为46.5/10万。按照 全国菌阳肺结核病人200万计算，全国有耐药病 人55.5万。 （4）结核病死亡率高：全国结核病死亡专率为 9.8/10万,每年因结核病死亡13万人，为各种其他 传染病和寄生虫病死亡总和的2倍。
第15章 分枝杆菌属
分枝杆菌是一类细长略带弯曲的杆菌， 含有分枝菌酸，有分枝生长的趋势 而得名。因具有抗酸性，故又称抗酸杆菌。
第一节 结核分枝杆菌
微生物检验实验室分枝杆菌属检验标准操作规程
微生物检验实验室分枝杆菌属检验标准操作规程微生物检验实验室分枝杆菌属检验标准操作规程1. 概述分枝杆菌属是一类细长的、具有分枝生长趋势的需氧杆菌，因具有耐受或抵抗酸和乙醇脱色的特点，又称为耐酸或抗酸菌。
分枝杆菌属至今已发现80多个种，除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌外，其他分枝杆菌，如堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等，统称为非结核分枝杆菌。
2. 标本类型痰液、体液（包括脑脊液、腹水、胸水）组织，粪便等标本。
3. 鉴定3.1 形态与染色：菌体细长，或稍弯曲，两端钝圆，大小为（0.2~0.5um）×（1~5um）。
革兰染色不易着色，抗酸染色呈红色。
以痰液直接涂片，结核分枝杆菌多为单个存在，有时呈V、Y、人字形排列，痰菌量多时可排列为束状或集聚成团。
荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下观察呈金黄色荧光。
3.2 培养特性：结核分枝杆菌生长缓慢，繁殖一代约需18h，因此在罗氏固体培养基上需要培养2~6星期方可见到菌落。
菌落多为粗糙型，不透明，乳白为米黄色，呈干燥颗粒状，形似菜花。
液体培养基中结核分枝杆菌生长较快，可形成表面菌膜或沉于管底。
3.3 生化反应：不发酵糖类，耐热触酶、耐热磷酸酶和吐温80水解试验均阴性，尿素酶、中性红、结核分枝杆菌烟酸、烟酰胺酶和硝酸盐还原试验均阳性。
3.4鉴别要点：3.4.1 本菌特征：菌体细长，抗酸染色呈红色；生长缓慢，菌落乳白或米黄色，呈干燥颗粒状，形似菜花状；不发酵糖类，尿素酶、中性红试验阳性。
3.4.2 与牛分枝杆菌的鉴别：结核分枝杆菌菌体细长，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阳性；牛分枝杆菌菌体较短、较粗，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阴性。
3.5 操作步骤3.5.1 中性培养基3.5.1.1 标本的处理痰液：挑取约5ml痰液至已标记的50ml离心试管中，加等量的2%N-乙酰半胱胺-氢氧化钠前处理液（去污染）；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.体液（包括脑脊液、腹水、胸水）：无菌体液直接接种；标本量>10ml,离心3000r/min，15分钟，取沉淀物接种；污染标本，须同痰液处理方法后再接种。
分枝杆菌属及检验
• 全球性卫生问题
– 是艾滋病高发区人群的首要死因
• 世界防治结核病日
– 3月24日
结核分枝杆菌 －－形态染色
• 细长略弯，丝状或分 枝生长
• 无芽孢，无鞭毛，无 荚膜,无菌毛
• 革兰染色阳性，不易 着色
• 抗酸染色阳性,菌体被 染成红色
• 结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1～ 4X0.4μm。牛分枝杆菌则比较粗短。分枝杆菌属的 细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特 别是有大量分枝菌酸(mycolic acid)包围在肽聚糖层
※液体培养基：形成菌膜， 有毒株呈索状生长
• 初次分离需要营养丰富的培养基。常用的有罗氏 （Lowenstein-Jensen）固体培养基，内含蛋黄、 甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑
制杂菌生长，便于分离和长期培养。蛋黄含脂质
生长因子，能刺激生长。根据接种菌多少，一般 2～4周可见菌落生长。菌落呈颗粒、结节或花菜 状，乳白色或米黄色，不透明。在液体培养基中
教学大纲
• 掌握内容
– 结核分枝杆菌主要生物学性状；致病物质及 致病机制；结核菌素试验原理及应用；微生 物学检查法
• 了解内容
– 麻风分枝杆菌的形态染色特性、致病性及微 生物学检查法
• 全世界有1/3人口，19亿人已感染结核分枝杆 菌，15岁以下儿童感染者达1.8亿，每秒种就有一 人感染，全球有2 000万活动性患者，新发病例 1 000万人，每年有300万人死于结核，死于结核的 人数超过AIDS疾病、腹泻及热带病死亡人数的总 和，是传染病死亡最多的。近年来AIDS的发病率 上升，伴随结核病上升。我国解放前结核严重流 行，发病率大于1%，有十痨九死之称，建国后人 民生活水平提高，卫生条件的改善，抗痨药物的 发现，特别是积极开展防痨工作，接种BCG，发 病率和死亡率大大降低，但近年来有抬头趋势。
分枝杆菌属及检验考点总结
分枝杆菌属及检验考点总结一、结核分枝杆菌引起人和动物结核病的病原菌。
目前已知在我国引起人类结核病的主要有人型和牛型结核分枝杆菌。
（一）生物学特性1.形态与染色G+，细长或略带弯曲的杆菌，在培养基中可呈球状或丝状，陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可见到分枝状。
抗酸菌。
既往在组织中曾发现革兰阳性的非抗酸颗粒，接种动物可产生典型的结核病变，后被称为Much颗粒。
2.培养特性◆专性需氧，在无氧条件下迅速死亡，在5%～10%C02环境中可刺激其生长。
需适当的湿度。
本菌生长缓慢，最快的分裂速度为18h一代。
◆固体培养基：2～6周才能长出菌落，呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄色，表面呈皱纹状，形似菜花。
◆液体培养基中生长较快，多为表面生长，形成菌膜，且干燥易碎而沉于管底。
有毒力菌株在液体培养基中可呈索状生长，无毒株则无此现象。
◆营养要求较高，必须在血清、卵黄、马铃薯、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基上才能生长。
3.生化反应◆不发酵糖类，能产生过氧化氢酶，耐热触酶试验、聚山梨酯-80水解试验和耐热磷酸酶试验均为阴性，脲酶试验和中性红试验均为阳性。
◆人型结核分枝杆菌：烟酸试验、硝酸盐还原和烟酰胺酶试验均为阳性；牛型结核分枝杆菌均阴性。
4.抵抗力：对酒精敏感。
5.变异性：形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。
毒力变异：卡介苗（BCG）——将有毒的牛型结核分枝杆菌培养。
于含有甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年传种230代，获得减毒菌株，再接种动物，不能致病而使其获得免疫力。
用于预防结核病。
（二）临床意义1.致病性◆不产生内毒素和外毒素，也无荚膜和侵袭性酶。
◆主要致病物质：脂质。
索状因子（破坏细胞，引起肉芽肿）、磷脂（形成结核结节）、硫酸脑苷脂（抑制吞噬体与溶酶体结合）、蜡质D（引起迟发性过敏反应）。
◆主要通过呼吸道、消化道和受损伤的皮肤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起的肺结核最多见。
◆肺外感染可发生在脑、肾、肠及腹膜。
分枝杆菌检测方法总结
分枝杆菌检测方法总结分枝杆菌检测方法主要有以下几种：1. 痰涂片：这是最常用的方法，优点是快速、低廉、操作简便，但无法区分死活菌，尤其是无法区分结核分枝杆菌（MTB）和非结核分枝杆菌（NTM），而且受制于痰液中分枝杆菌数量，敏感性较低，漏检率很高。
2. 结核培养：与痰涂片相比，培养法灵敏度增加了不少，结核培养阳性是诊断抗酸杆菌的金标准，但缺点在于培养时间周期过长，一般需要8周左右时间，这样很耽误医生用药和患者及时治疗。
3. 结核杆菌IgG抗体检测：感染结核分枝杆菌后，体内可产生特异性抗体。
将结核分枝杆菌抗原包被在固相载体上，与待测血清反应，血清中相应的抗体可结合于其上，再以胶体金（或酶）标记，显示反应，可检出血清中结核分枝杆菌抗体。
结核杆菌IgG抗体检测特异性较好，对于排除结核阳性有利，但无法确诊活动性结核。
4. Xpert MTB/RIF：通过检测MTB基因组中的rpoB基因及其突变情况，实现MTB核酸和利福平耐药检测的全自动实时荧光定量核酸扩增技术。
具有以下优势：特异性好，能准确区分MTB和NTM；灵敏度高，检测快速，仅需要两个小时就完成检查了；适用于各种标本，痰液、肺泡灌洗液、肺组织、脑脊液、淋巴结、关节液以及尿液等均可用于检测；同时可以检测利福平耐药，检测对一线抗结核药物利福平的耐药情况，敏感性特异性极高，可及时为临床用药提供有效参考。
5. IGRA：γ-干扰素释放试验（IGRA）是检测结核分枝杆菌（MTB）特异性抗原刺激T细胞产生的γ-干扰素（IFN-γ），以判断是否存在MTB感染。
IGRA适应证主要包括结核潜伏感染（LTBI）的诊断和活动性结核（ATB）的辅助诊断。
与结核菌素皮肤试验（TST）相比具有明显优势：特异度高，不受卡介苗接种及大多数非结核分枝杆菌（NTM）的干扰；使用单一阈值作为阳性判断标准；作为体外诊断方法，更适用于疫情检测和流行病学调查。
IGRA是世界卫生组织（WHO）推荐的用于诊断MTB感染的体外免疫学方法。
实验6 厌氧菌、棒状杆菌、分枝杆菌等
蛋黄琼脂平板：Nagler反应 牛奶培养基：“汹涌发酵”
Nagler反应
产气荚膜梭菌产生 卵磷脂酶分解卵黄
中卵磷脂所致
汹涌发酵
将产气杆菌 接种于紫牛 奶培养基中
在牛奶中分解乳糖， 使其中酪蛋白凝固
细菌产生大量H2和CO2
白喉棒状杆菌生物学特性
蛋黄, 马铃薯, 甘油， 孔雀绿
麻风分枝杆菌
•形态、染色与结核分枝杆菌相似 •麻风分枝杆菌是一种典型胞内菌 (麻风细胞) •体外人工培养至今仍未成功
Albert 染色法
•制片同革兰染色 •甲液染5分钟→水洗→再以乙液（碘液）染1分钟 →水洗→印干→油镜检
抗酸染色法
抗酸染色法(acid-fast stain) ：以5％石炭酸复红
Albert染色(异染颗粒)
Elek平板试验结果
白喉杆菌菌苔 沉淀线(阳性) 含白喉抗毒素滤纸片
Elek Test
结核杆菌
形态与染色
细长略带弯曲 细胞壁脂质含量高，肽聚糖外大量分
枝菌酸 齐－尼抗酸染色阳性
培养特点
专性需氧 • 液体培养基 ： 表面生长 ( 菌膜) • 固体培养基： 粗糙型菌落 (菜花状) 生长缓慢,营养要求高,常用罗氏培养基
实验六
厌氧性细菌、棒状杆菌、分枝杆菌等
Content
示教 破伤风梭菌及产气荚膜梭菌的形态、染色性及培养特性 Nagler反应、汹涌发酵 结核分枝杆菌：抗酸染色法，液体、固体培养 麻风分枝杆菌：抗酸染色 白喉棒状杆菌： Albert染色法、吕氏血清斜面、 亚碲酸盐 平板
操作 产气荚膜梭菌致病性实验 病人痰液（结核分枝杆菌）抗酸染色法 口腔螺旋体的检查 肠道致病菌粪便标本的分离与鉴定（续）——血清学反应
分枝杆菌属细菌检验ppt课件
（3）结果 48h-72h ,根据注射部位是否出现红肿判5mm为强阳性
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18
第一节 分枝杆菌属
一、结核分枝菌
（4）结核菌素试验意义 选择卡介苗接种对象、测定卡介苗接种后的免疫效果 了解人群结核菌的自然感染率 作为婴幼儿结核病的辅助诊断 测定肿瘤患者的细胞免疫功能
第一节 分枝杆菌属
检验程 序
涂片抗酸 染色镜检
标本 标本前处理
核酸 检测
抗体 检测
接种液体 培养基
接种固体培养基 可疑菌落
慢性生长菌
快速生长菌
接种小白鼠 豚鼠
脏器涂片 镜检
菌种鉴定
抗酸染色
鉴定试验
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12
第一节 分枝杆菌属
一、结核分枝菌
4.形态学检查 （高压灭菌后进行）
（1）直接涂片染色镜检 （2）浓缩集菌涂片检查法 （3）荧光染色：观察形态 黄绿色、橙色荧光 （4）初步报告：检出抗酸分枝杆菌（结核杆菌？）
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16
第一节 分枝杆菌属
一、结核分枝菌
（2）蛋白质 诱发超敏反应 （3）糖类 抵抗吞噬作用 2.所致疾病 （1）经多途径感染，引起全身各组织结核病，以肺结核最多见 （2）类型 原发感染和继发感染 3.免疫性 抗结核免疫以细胞免疫为主
※抗结核免疫属带菌免疫或称传染性免疫 ※抗结核免疫与Ⅳ型超敏反应同时出现
微生物学检验
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1
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2
分枝杆菌属、诺 卡菌属、放线菌属鉴定
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3
本章内容
1 第一节 分枝杆菌属 2 第二节 诺卡菌属 3 第三节 放线菌属
PPT学习交流
(优选)致病菌的检验分支杆菌属及相似属
6、致病性
结核杆菌的致病作用可能是细菌在组织细胞内顽 强增殖引起的炎症反应，以及诱导机体产生的迟 发型变态反应有关。
结核杆菌可通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘 膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官 的结核病，其中以肺结核最常见。动物则常见内 脏（如肠道等）结核。
2、蛋白质（Protein） 结核杆菌菌体内含数种蛋白质，重要的是结核菌素 (tuberculin)，其与蜡质D结合后，能引起较强的迟发型 变态反应。蛋白质具免疫原性，但无保护作用。
3、多糖（Polysuccharides） 多糖常与脂质结合存在于胞壁中，主要有半乳糖，甘露 醇、阿拉拍糖等。多糖可使中性粒细胞增多，引起病灶 局部细胞浸润。
4µm，单个或分枝状排列， 无荚膜、无鞭毛、无芽胞。 在陈旧的病灶和培养物中形 态不典型，呈颗粒，串球， 短棒，长丝形等。
一 结核分支杆菌（M.tuberculosis）
——结核杆菌常用萎-钠氏(ZiehlNeelsen)抗酸染色法染色，菌染 成红色，其他非抗酸细菌及细胞 等呈蓝色。
2、培养特性
4、变异性
对链霉素、利福平、异烟肼等抗结核药物易产生耐药 性。耐药菌株常伴随活力和毒力减弱，如异烟肼耐药 菌株对豚鼠的毒力消失，但对人仍有一定致病性。
卡介菌(Bacilli Calmette-Giierin, BCG)：卡-介 （Calmette-Gerine）二氏将牛型结核杆菌培养于胆汁、 甘油、马铃薯培养基，经230次传代，历时13年，其毒 力发生变异，成为对人无致病性，而仍保持良好免疫 性的菌株，接种人体后可获得对该菌的免疫力。
实验六 分枝杆菌属的鉴定
临床微生物学教研室
实验步骤及注意事项
1.涂片: 痰标本取脓痰部分或离心制成厚膜涂片（10×20 mm)，干燥固定 2.染色：
石碳酸 复红 3%盐 酸酒精 吕氏 美兰
加热至出现蒸汽， 勿干，持续5min
脱色干净
复染充分 1 min
临床微生物学教研室
约3 min
临床微生物学教研室
初染: 在加热条件下，细胞壁通透性增加，细
菌中分枝菌酸与石碳酸复红牢固结合
脱色: 分枝菌酸复合物抵抗盐酸酒精脱色作用 复染: 组织或杂菌被吕氏美兰复染，背景呈蓝
色,结核分枝杆菌仍保持红色
临床微生物学教研室
实验步骤
1.涂片: 痰标本取脓痰部分或离心制成厚膜涂片（10×20 mm)，干燥固定 2.染色：
肉眼可见的菌落。
菌落:菜花样、面包屑样
临床微生物学教பைடு நூலகம்室
固体培养基上：菌落 为干燥、坚硬、表面 呈颗粒状、乳酪色或 黄色，形似菜花样， 为粗糙型。“碎面包 屑样”
液体培养内：表面生 长，形成纹状菌膜
临床微生物学教研室
录像学习 结核分枝杆菌培养与诊断方法新进展（了解）
思考题 1.分枝杆菌培养标本的前处理方法？ 2.分枝杆菌快速培养系统的原理？
3+ ：1-9条/每个视野
分枝杆菌微生物学查验
分枝杆菌1. 分枝杆菌属(Mycobacterium)：（1）一类细长、略带弯曲、呈分枝状生长细菌，革兰染色阳性，无芽胞、无荚膜；（2）抗酸染色阳性，故又称抗酸杆菌；（3）营养要求较高，常常利用罗琴培育基；（4）生长缓慢，2~8周后方可见菌落；（5）G+C mol%为62%~70%；（6）由于结核分枝杆菌的耐药和AIDS发病率呈上升趋势，结核病成为危胁人类健康的一个严峻的全世界性公共卫生问题。
2. 主要致病种类：人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌3. 分枝杆菌属分类（1）典型结核分枝杆菌：人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌（2）非典型分枝杆菌：（3）其他：副结核分枝杆菌、麻风杆菌、鼠麻风杆菌4. 结核分枝杆菌（1）临床意义A. 本菌抵抗力强，可存活6~8月，随着漂浮于空气中的微滴核被吸入呼吸道，植入肺泡发育繁衍致使结核发生；B. 引发结核病，随社区人群生活状况不同发病率有所不同，全世界约有1/3人感染，有人类死亡之首和白色瘟疫之称；C. 免疫性：有菌免疫或称传染性免疫，细胞免疫在抗感染免疫中起重要作用。
D. 细菌可经血、淋巴，在骨、关节、肾、脑膜等处引发相应的结核病（2）致病物质荚膜：抗吞噬；细胞壁脂质；磷脂：刺激单核细胞增生、结核结节形成、干酪样坏死；分枝菌酸：抗酸性；索状因子：破坏线粒体膜；蜡质D：诱发IV型超敏反映；硫酸脑苷脂：抑制吞噬细胞；蛋白质；致病机制：胞内寄生，细胞免疫为主，在巨噬细胞中存活，引发Ⅳ型超敏反映。
（3）结核结节的形成：A. 是单核细胞参与的炎性肉芽肿反映，是细胞免疫和IV型变态反映平衡的结果；B. 细菌的脂质抵抗吞噬，巨噬细胞被破坏，形成原发感染。
3~6周后，细胞变形，IV 型变态反映产生；C. 磷脂刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞融合成多核巨细胞。
抑制蛋白酶对组织溶解，产生干酪样坏死；（4）Koch现象（郭霍现象）和IV型变态反映：有毒结核分枝杆菌被第一次接种豚鼠10－14天，局部产生末节，形成肿块→坏死溃疡侵入周围淋巴结→淋巴血流全身播散，经久不愈→动物死亡。
分枝杆菌菌种鉴定
实验室可鉴定菌种：结核、牛、堪萨斯、海鱼、瘰疬、鸟、胞内、偶然、龟、脓肿等分枝杆菌临床意义为致病菌；
戈登、蟾蜍、次要、耻垢、草分枝杆菌等临床意义为条件致病菌；.
分枝杆菌菌种鉴定常规实验包括：
一、对硝基苯甲酸（PNB）生长实验：鉴别结核分枝杆菌复合群或NTM菌群
二、噻吩-2-羧酸肼（TCH）生长实验：鉴别结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌
三、硝酸还原实验：鉴别结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌
四、5%NaCl培养基实验：
五、谷氨酸纳葡萄糖琼脂培养基生长实验：鉴别胞内、鸟分枝杆菌；
六、麦康凯琼脂培养基生长实验：主要用于快速生长菌的鉴别
七、吐温—80（Tween）水解实验：某些分枝杆菌具有一种酯酶，可分解Tween-80成为油酸等物质
八、尿素酶实验：某些分枝杆菌产生尿素酶，可分解尿素使菌悬液呈红色
九、芳香硫酸酯酶实验：某些分枝杆菌产生芳香硫酸酯酶
十、铁离子吸收实验：某些分枝杆菌具有还原铁盐的能力。
铁离子被吸收后；菌落呈铁锈色。
十一、亚碲酸盐还原实验：某些分枝杆菌可使碲盐还原为金属碲，使培养物呈黑色或深棕色沉降物。
人生中最幸福的就是身体健康
痰、胸腔积液、气管镜洗刷物等涂片脱落细胞检查的临床意义：是肺癌病理学诊断和临床鉴别诊断的依据。
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实验步骤及注意事项
1.涂片: 痰标本取脓痰部分或离心制成厚膜涂片（10×20 mm)，干燥固定 2.染色：
石碳酸 复红 3%盐 酸酒精 吕氏 美兰
加热至出现蒸汽， 勿干，持续5min
脱色干净
复染充分 1 min
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约3 min
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初染: 在加热条件下，细胞壁通透性增加，细
菌中分枝菌酸与石碳酸复红牢固结合
脱色: 分枝菌酸复合物抵抗盐酸酒精脱色作用 复染: 组织或杂菌被吕氏美兰复染，背景呈蓝
色,结核分枝杆菌仍保持红色
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实验步骤
1.涂片: 痰标本取脓痰部分或离心制成厚膜涂片（10×20 mm)，干燥固定 2.染色：
3+ ：1-9条/每个视野
4+ ：9条以上/每个视野
找到结核分枝杆菌
未找到结核分枝杆菌
找到抗酸杆菌 未找到抗酸杆菌
×
√
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二、结核分枝杆菌培养及诊断方法新进展 培养
营养要求高，在含有蛋黄、马钤薯、甘 馋 油和天门冬氨酸等的固体培养基上才能
生长。
懒 丑 生长缓慢，接种后培养4～6周才出现
模拟痰液标本
试剂 其他
抗酸染色液 显微镜、载玻片等
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实验内容
抗酸染色的方法与结果报告
结核分枝杆菌培养与诊断方法新进展 （录像）
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一、抗酸染色
原理
分枝杆菌的染色性与其细菌结构密切相关
结核分枝杆菌细胞壁含有大量脂质和分枝菌酸
不易着色，需加热 或延长染色时间
抵抗盐酸 酒精脱色
石碳酸 复红 3%盐 酸酒精 吕氏 美兰
加热至出现蒸汽， 勿干，持续5min
脱色干净
复染充分 1 min
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约3 min
3. 镜检
结核分枝杆菌仍保持红色，杂菌或背景呈蓝色
临 条/300个视野
+ ：3-9条/100个视野 2+ ：1-9条/10个视野
实验六 分枝杆菌属的鉴定
临床微生物学教研室 肖斌 753591
验证性实验
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结核分枝杆菌的特性
三耐
耐干燥 、耐酸碱、耐一般消毒剂
四怕
怕乙醇、怕湿热、怕紫外线、怕抗痨药
生长缓慢 抗酸染色
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结核分枝杆菌检验程序
临床标本
涂片
直 接 集 菌
分离培养
固体 培养 基 液体 培养 基
肉眼可见的菌落。
菌落:菜花样、面包屑样
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固体培养基上：菌落 为干燥、坚硬、表面 呈颗粒状、乳酪色或 黄色，形似菜花样， 为粗糙型。“碎面包 屑样”
液体培养内：表面生 长，形成纹状菌膜
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录像学习 结核分枝杆菌培养与诊断方法新进展（了解）
思考题 1.分枝杆菌培养标本的前处理方法？ 2.分枝杆菌快速培养系统的原理？
分子生物学鉴定
其他实验
结 核 菌 素 试 验 免 疫 学 试 验 HPLC
染色
抗 酸 染 色 荧 光 染 色
检 测
快速培养系统
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实验目的
了解：结核分枝杆菌的培养和诊断方法的新进展 理解：抗酸染色的基本原理
难点 掌握：抗酸染色的方法和结果分析
重点
临床微生物学教研室
实验器材
标本