5.免疫组化技术-实用篇
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是现代生物学研究领域中一项重要的实验技术，它通过利用抗体与特定抗原的高亲和力结合特异性标记，可以准确地检测和定位分子在细胞和组织中的分布，并在这一基础上进行生物学功能的研究。
本文将对免疫组化技术的原理、应用以及发展趋势进行详细介绍。
一、免疫组化技术的原理免疫组化技术基于生物体对抗原与抗体的免疫反应，利用抗体与抗原的特异性结合来标记和检测感兴趣的分子。
免疫组化技术的关键步骤包括：抗原的固定、抗原的暴露、与抗原的特异性结合和信号检测等。
在免疫组化技术中，抗原通常需要进行固定，以保持其在组织中的形态和位置不变。
一般来说，抗原可通过形成固定化复合物或被共价结合到载玻片或膜上。
随后，我们需要将抗原从组织中溶出，以使其暴露于抗体。
这一步骤通常涉及脱水、脱脂和脱钙等处理。
暴露后的抗原可以与特异抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
为了标记抗原-抗体复合物，我们需要选择适当的检测系统。
目前常用的检测方法包括荧光染色、酶学染色和放射性标记等。
其中，荧光染色技术具有高灵敏度和分辨率，能够利用荧光显微镜直接观察标记物的分布。
二、免疫组化技术的应用免疫组化技术在许多研究领域中广泛应用。
在医学领域，它常用于研究肿瘤形成机制、诊断和预后判断。
通过免疫组化技术，我们可以检测和定位许多肿瘤标志物，如癌胚抗原（CEA）和肿瘤相关抗原（CA）等，从而帮助医生进行早期诊断和治疗。
在神经科学领域，免疫组化技术被广泛用于研究神经元发育、突触形成和神经退行性疾病。
通过标记神经元特异性蛋白质，如神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经纤维酸性蛋白（NF）等，可以清晰地观察和研究神经元的结构和功能。
此外，免疫组化技术在细胞和分子生物学研究中也具有广泛的应用。
通过对细胞内蛋白质、DNA和RNA等分子的定位和检测，我们可以研究细胞的生物学功能和基因调控机制。
例如，通过检测特定蛋白质的表达和定位，可以研究调节细胞周期和细胞分化的信号通路。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种常用的实验诊断技术，它通过检测细胞或组织中的特定蛋白质来帮助诊断疾病。
免疫组化的完整步骤包括抗原制备、抗体制备、预处理、染色和结果分析等几个环节。
下面我将详细介绍每个环节的原理及操作步骤。
首先是抗原制备。
抗原是指能够与特异性抗体结合的物质，常见的抗原有蛋白质、多肽和核酸等。
在免疫组化中，我们需要选择一种合适的抗原，并将其制备成适合免疫反应的浓度和形式。
一般来说，抗原可以采用化学合成法、生物来源法或基因工程技术等方法进行制备。
接下来是抗体制备。
抗体是指能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白，它是免疫组化的核心成分。
在抗体制备过程中，我们需要先确定需要检测的抗原类型和数量，然后选择合适的动物或植物源材料，进行细胞融合或表达纯化等步骤，最终得到高纯度的单克隆抗体。
第三步是预处理。
在进行免疫组化之前，我们需要对样品进行一系列的预处理操作，以去除杂质和干扰物质的影响。
预处理包括样品稀释、缓冲液调整、基质效应消除等步骤。
还需要根据具体的实验设计选择合适的预处理方法和条件。
第四步是染色。
染色是免疫组化的核心步骤之一，它可以将标记有抗体的二抗与待测样本中的抗原结合，形成可视化的斑点分布。
常用的染色方法包括直接荧光法、间接荧光法、免疫印迹法等。
在染色过程中，需要注意染料的选择、浓度和作用时间等因素，以保证染色效果的质量和稳定性。
最后一步是结果分析。
免疫组化的结果分析需要综合考虑多个因素，如阳性对照品的比较、背景值的控制、图像处理和统计分析等。
常用的结果分析方法包括图像分析软件(如ImageJ)和统计分析软件(如SPSS)。
在结果分析过程中，需要注意数据的可靠性和准确性，避免误判和漏判的情况发生。
免疫组化是一项复杂而精细的技术，它需要综合运用多种知识和技能才能完成高质量的实验诊断任务。
希望以上的介绍能对您有所帮助！。
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的重要技术手段。
它通过利用抗体与其特异性抗原相互作用的特性，实现对细胞、组织和分子的检测和定位。
本文将从免疫组化技术的原理、应用、优缺点等方面进行介绍。
首先，免疫组化技术的原理主要基于抗原与抗体的高度特异性反应。
抗原一般是指能够被免疫系统识别并引发抗体产生的物质，它可以是细胞膜上的蛋白质、细胞核中的核酸、胞浆中的酶等。
而抗体是机体免疫系统产生的一类蛋白质，具有高度特异性与抗原结合。
在免疫组化技术中，通常选择一种与目标物高度特异性结合的抗体，通过与目标物反应形成抗原-抗体复合物，再利用染色、荧光等方法对其进行检测和定位。
免疫组化技术广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
首先，在生物医学研究领域，免疫组化技术可以用于检测和定位特定蛋白质或细胞标志物。
例如，科研人员可以利用特异性抗体对肿瘤标志物进行检测，从而实现早期肿瘤的筛查和诊断。
此外，免疫组化技术还可以用于研究免疫反应、细胞分化和分子信号传递等生物学过程。
其次，在临床诊断中，免疫组化技术可用于肿瘤诊断、感染病的检测和诊断，以及免疫性疾病的诊断等。
临床医生可以利用免疫组化技术对病理切片进行染色，帮助判断疾病类型和严重程度。
免疫组化技术具有多种优点。
首先，它具有高度特异性和敏感性。
由于抗体与特定抗原的结合是高度特异性的，因此免疫组化技术可以实现对目标物的准确检测和定位。
其次，它可以同时对多个目标进行检测。
通过同时使用多个不同特异性的抗体，可以对多个目标分子进行检测，从而提高检测效率。
此外，免疫组化技术还可以实现对细胞或组织的形态学和功能的研究，有助于揭示生物学过程的机制。
然而，免疫组化技术也存在一些限制和不足之处。
首先，技术操作复杂。
免疫组化技术需要对抗体的选择、染色剂的选择和实验条件等进行严格控制，技术操作要求较高。
其次，需要合适的阳性和阴性对照。
在使用免疫组化技术时，需要合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
病理学中的免疫组化技术
病理学中的免疫组化技术病理学是临床医学的重要分支之一，其主要研究疾病的发生、发展和变化规律，以及疾病对人体的影响和治疗方法等。
在病理学研究中，免疫组化技术被广泛应用于疾病诊断、治疗和预防。
本文将详细介绍病理学中的免疫组化技术，包括其原理、应用范围、标记物及其特点、实验步骤、优点和局限性等方面。
一、原理免疫组化技术是利用免疫学原理和化学标记方法，将抗原与抗体相互作用标记，通过显微镜观察细胞或组织内部的形态、结构、组织类型等信息。
具体来说，免疫组化技术的过程包括以下几个步骤：制备标本，抗原提取、分离和纯化，制备特异性抗体，选择合适的标记物，进行免疫反应，显色和观察等。
二、应用范围免疫组化技术在病理学研究中应用广泛，包括疾病的诊断、治疗和预防方面。
例如，免疫组化技术可用于诊断肿瘤、感染性疾病、免疫系统疾病、神经系统疾病、心血管疾病等。
此外，免疫组化技术也可用于药物研发、新药筛选和药物治疗监测。
三、标记物及其特点在免疫组化技术中常用的标记物包括荧光标记、辣根过氧化物酶标记、碱性磷酸酶标记、生物素标记等。
不同的标记物具有不同的特点。
荧光标记具有较好的定量性、灵敏度和多标记能力；辣根过氧化物酶标记具有高灵敏度和尺寸较小的优点；碱性磷酸酶标记具有高灵敏度和较小的背景信号；生物素标记具有灵敏度和多标记能力等。
四、实验步骤免疫组化技术的实验步骤包括标本制备、抗原提取、制备抗体、标记试剂制备、免疫反应、显色和观察等。
其中，标本制备是一个非常重要的步骤，直接影响实验结果。
通常标本制备需根据不同的组织类型进行不同的处理，如切片、染色、脱水、透明、封片等。
五、优点与局限性免疫组化技术具有以下优点：（1）高灵敏度和特异性，可用于检测极微量的抗原。
（2）定量性好，可用于确定抗原的浓度和分布情况。
（3）成本较低，设备简单，易于掌握。
（4）样品来源广泛，不受细胞和组织来源限制。
然而，免疫组化技术也存在着一些局限性。
如抗原存在交叉反应，标本制备不当会造成影响实验结果的问题，而且实验过程需要操作技能较高的人员。
免疫组化技术简介及相关临床应用
＋－－ ＋
淋巴结边缘区Ｂ细胞淋巴瘤 － － － －
结外边缘区Ｂ细胞淋巴瘤
－－－
－
（黏膜相关淋巴组织淋巴瘤）
垂体腺瘤的免疫组化鉴别诊断
泌乳素细胞腺瘤
LTH GH ACTH PSH/LH FSH CgA
＋－ －
－
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NSE KER
＋
＋
生长激素细胞腺瘤
－＋ －
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促皮质激素细胞腺瘤 － － ＋
－
－－
－
＋
－－
20世纪80年代该项技术在国外开始应用 于诊断疾病，国内比国外约晚10年，即90 年代开始运用于疾病的病理诊断。
最近20多年来，该项技术得到飞速发展，特别 是绝大多数抗体能够应用在福尔马林固定的石蜡 切片上，因而大大促进了它在临床病理学上的应 用。
从开始发展至今，该项技术一直在基础医学和 临床研究中发挥重要作用,为疾病尤其是肿瘤性疾 病的诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了强 有力的手段。
原暴露有一定的影响，但可进行抗原修 复，是免疫组化中首选的组织标本制作 方法。
常用染色方法
免疫组织化学技术按照标记物的种类不 同可分为： 1，免疫荧光法，标记物为荧光素，通 过荧光显微镜观察； 2，免疫酶法，以酶标记抗体，抗原抗 体反应后显色，通过光镜或电镜观察，目前 最常用； 3，其它如亲和组织化学法、免疫铁蛋 白法、免疫胶体金法及放射免疫自显影法等。
有如下基本特点：
1、特异性强 2、敏感性高 3、定位准确 4、形态与功能相结合
所用抗体及标本类型
所用抗体类型
常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗 体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分 泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免 疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的 抗原直接免疫动物后，从动物血中所获 得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所 产生的抗体混合物。
免疫组化技术实用篇教学课件
2023免疫组化技术实用篇教学课件pptcontents •免疫组化技术简介•免疫组化技术实验流程•免疫组化技术实验数据分析和解读•免疫组化技术实验优化和提升•免疫组化技术前沿进展和发展趋势目录01免疫组化技术简介免疫组化技术是一种用于研究生物组织中蛋白质表达和分布的生物学技术。
定义免疫组化技术分为直接法和间接法两大类，其中间接法应用最为广泛。
分类定义与分类直接法利用特异性抗体直接与组织切片中的目标抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，再用标记物进行显色，以检测抗原的存在。
间接法利用特异性抗体与组织切片中的目标抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，再用标记物进行显色，以检测抗原的存在。
免疫组化技术的原理1免疫组化技术的应用23免疫组化技术可用于疾病诊断，如癌症、自身免疫性疾病等。
疾病诊断免疫组化技术可用于科学研究，如在细胞和分子水平上研究生物大分子的相互作用和功能。
科学研究免疫组化技术可用于药物研发，如检测药物在组织中的分布和作用。
药物研发02免疫组化技术实验流程包括组织样本、抗体、抗原等；实验准备实验材料准备如显微镜、染色机等；实验仪器准备熟悉实验操作流程和注意事项。
实验操作准备切片制作将组织样本制作成切片，并进行脱蜡、水化等处理；加一抗将抗体稀释后加入切片中，孵育适宜时间；抗原修复使用抗原修复液对切片进行修复，以暴露出抗原；加二抗将标记有荧光素的二抗加入切片中，孵育适宜时间；阻断加入阻断液，以抑制内源性过氧化物酶活性；观察与拍照用荧光显微镜观察染色结果，并进行拍照记录。
实验步骤及操作流程实验注意事项实验前务必熟悉操作流程和注意事项；对于不同的组织类型和抗体，应根据具体情况调整实验条件和操作步骤；实验过程中要注意安全，避免受伤和感染；在实验过程中要保持实验室的清洁和整洁，遵守实验室规范。
03免疫组化技术实验数据分析和解读03定量PCR使用荧光定量PCR技术，检测样本中特定基因的表达水平，分析免疫组化染色的结果。
免疫组化实验方法
免疫组化实验方法免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用特异性抗体与组织或细胞特定抗原结合的方法，以此可以检测细胞或组织中蛋白质的表达和分布情况。
IHC技术已广泛应用于病理学、癌症诊断、生物医学研究等领域。
以下是免疫组化实验的常用方法：1.样本处理：通常以石蜡包埋切片作为实验样本。
首先，从固定的组织或细胞中取得标本，然后进行脱水、透明化和浸蜡等处理。
接下来，使用切片机将组织或细胞切割成厚度为3-5μm的切片。
2.抗原恢复：由于样本的固定和包埋可能导致抗原的损伤，因此需要对切片进行抗原恢复处理。
常见的抗原恢复方法包括热处理、酶解法和酸性水解法。
热处理是将切片置于缓冲液中，在高温下进行退火。
酶解法是使用胰蛋白酶等酶对切片进行消化。
酸性水解法则使用盐酸或酶进行酸性处理。
3.抗体结合：选择特异性的一抗体与目标抗原结合。
一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以经商业采购或自家制备。
将一抗体加入待检测切片上，让其与目标抗原结合。
4. 第二抗体结合：待检测切片上结合了一抗体的抗原后，需要添加第二抗体与一抗体结合。
第二抗体通常是反相应物免疫球蛋白（Secondary Antibody），如反人IgG，反兔IgG等。
第二抗体上常会标记有发光物质、酶标记物或荧光染料，用于可视化结果。
5.可视化和显色：根据选择的第二抗体，可以选择显色方法。
例如，辣根过氧化物酶（HRP）结合的第二抗体可以使用3,3'-二氨基联苯思（DAB）作为底物，呈棕色或棕黄色；荧光标记的第二抗体可以用荧光显微镜进行观察。
6.伪染色：为了辅助观察和识别目标组织或细胞，可以进行伪染色。
常见的伪染色方法有对比染色、核染色和细胞质染色等。
7.阴性对照和阳性对照：为了确保实验结果的准确性和可靠性，同时进行阴性对照和阳性对照实验。
阴性对照是在实验中将第一抗体替换为非特异性抗体或缺少抗体的处理组织或细胞组织；阳性对照是在实验中使用已知表达目标蛋白的组织或细胞进行处理。
免疫组化技术简介
➢ 一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体
或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物质。
抗体（Antibody, Ab）
➢ 机体受抗原刺激后由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生反应的球蛋
白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。
没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的！
结果判读 抗原表达必须在特定部位 阳性标记细胞学特征可分为①胞膜型；②胞核型；③胞质(浆)型；④微绒毛型；⑤复合型（胞 膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞质兼有）等五种阳性细胞类型。 这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合 型图像。
不限于单个细胞，而是累及一片细胞，均匀显色
原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自： ①内源性干扰(自发荧光、内源酶、内源性
生物素等)；②试剂污染(质量差，交叉反应，Fc受体干扰等)；③组织处理不当(组织固定不及 阳不性一与时阴或性固细定胞不相良互所交导杂致，的同抗一原切弥片散上移显位色、强洗度涤不细充胞分和所周导围致的的结游缔离组试织剂均残无留区等别)。的着色
甲醛固定后，抗原容易被掩盖，形成醛键或羧甲基，使蛋白交联封闭部分抗原表位。
技术要点 石蜡切片 优点：对组织结构形态保存好，对组织的定位很准确，是观察组织和细胞结构的理想方法， 可以用于回顾性研究。 缺点：抗原常被封闭和破坏。对抗原的保存不如冰冻切片。 冰冻切片 优点：能避免石蜡切片因固定，脱水，浸蜡等对抗原的损失，较好的保存组织抗原的免疫活 性，适用于不稳定的抗原。 缺点：不易保存（-80℃）；细胞内易形成冰晶而破坏抗原结构，造成抗原的弥散使定位不准 确。
不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。
免疫组化技术
3 未标记抗体酶法：所用抗体均未标记，利用第二抗体作为桥 将第一抗体和终抗体连接起来，而终抗体作为抗酶抗体，产生于 第一抗体来源相同的动物种属。由于所用抗体未标记，避免了共 价结合，较好的保护了抗体和酶的活性，敏感性增加。 目前常用的未标记抗体酶法 是用桥抗体将第一抗体和标记的检 测试剂复合物连接起来。包括：过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP） 复合物； 硷性磷酸酶-抗硷性磷酸酶（APAAP）复合物；抗生物素 蛋白-生物素-过氧化物酶（ABC）复合物等
优点 敏感性高，应用广泛 可用于双标染色
方法：1）石蜡切片脱蜡到水或者冰冻切片PBS洗10分钟。 2）0.2-1%TritonX-100 30min 3) 3-10%二抗动物的正常血清 30 min, 37oC ，不 洗入下一步 4)滴加适当稀释的一抗，4oC过夜或37oC 12h。 5) TBS洗 3 次，每次5-10 min 6)荧光标记的二抗。 1-2 h, 37oC
四
染色方法
免疫组织化学染色方法的类型
1、直接法：用抗原免疫动物制备的抗血清，
称特异性抗体即第一抗体。将标记物与一抗结合。 反应：组织的抗原 + 带标记物的一抗
抗原抗体复合物
+ 检测标记物
在组织原位 形成可视的 沉淀物
2 间接法：第一抗体未标记，而第二抗体以荧光素、酶或胶体
金等标记
（1）二抗制备：用产生第一抗体动物的血清免疫另一种属动物，获
IgM分子结构
抗体的种类：有多克隆抗体和单克隆抗体。
多克隆抗体Polyclonal antibody ：用含多种 抗原决定基的抗原免疫动物，刺激多个B细胞克隆产 生针对多种抗原决定基的不同抗体，为多克隆抗体， 其免疫血清是含有多种抗体的混合物。特异性不高，
免疫组化技术
B B B B
①标记抗生物素-生物素法
抗生物素蛋 标记物
生物素
物素，与生物素结合，然后进
行酶呈色反应。 • 间接法：用生物素标记二抗，
特异性抗体 组织抗原
E A E E B B
酶标记抗生物素，先用第一抗
体与组织抗原结合，再将第二 抗体与第一抗体相连结，最后
特异性抗体进行染色（常用于二抗），结果明显减弱Байду номын сангаас转为阴性。如
先加未标记的非免疫血清或正常血清，则不能抑制染色反应。
免疫组织化学技术应用 注意事项
一、无信号
染色结果对照/标本均无染色。
1、原因：
（1）真阴性结果： 组织或细胞不表达抗原，无法检测到相关信号； 或表达抗原太低，所使用检测系统不足以达到检 测所需要的灵敏度。
结果应为阴性，说明染色方法可靠。若出现假阳性，应考虑二
抗、内源酶等。
４．替代对照 用一抗来源的同种动物的非免疫血清代替一抗，染色
结果应为阴性，可证明待检组织切片的阳性结果不是抗体以外混杂血
清成分所致，而是抗体的特异性反应。 ５．吸收试验 用过量的已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体 结合点全部与抗原结合，这种被抗原吸收后的抗体不能再与组织内的 抗原反应，组化结果应为阴性，可证明抗体的特异性。若组化结果为 阳性，说明抗体不纯，阳性染色反应不是待检抗原与抗体特异性反应 形成的。用不相关的抗原吸收第一抗体应不影响染色结果。 ６．抑制实验 待检标本先与未标记的特异性抗体反应后再与标记的
统。
亲和组织化学法
①标记抗生物素-生物素法（labelled avidin-biotin method，LA） ②抗生物素-生物素法( bridge avidin-biotin method， BRA) ③生物素-生物素-过氧化物酶法（ABC法）
免疫组化技术
7、SP反应 SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min） ，由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避 光）（1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制 。 :50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，20 ℃保存。
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、 ，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷 受体、 激素、 脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等 都可用相应的特异性抗体进行检测。 都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组化的特点
特异性强 敏感性高 定位准确、 定位准确、形态与功能相结合
结果分析： 结果分析：每张切片选择5个高倍镜视野 （400X），应用图像分析系统进行定量 灰度扫描后进行分析
设备
恒温箱（水浴锅）、冰箱、切片 机、载玻片和盖玻片、高压锅或 微波炉、染色缸、显微镜、计算 机图像分析系统
所用试剂
· 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加双蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH2PO4·2H2O＋58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O（重蒸水 ）；B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O（蒸 馏水 ））。 • Citrate Buffered Saline（0.01 M柠檬酸缓冲液， PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O（ A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至 1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g加双蒸水至1000 ml）。
免疫组化原理和步骤(精)
免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质 (如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 :9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;1000 ml 0.2M PB (pH 7.4=5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O+58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O:15.6 g in 500 ml ddH 2 O; B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O:71.632 g in1000 ml dH 2 O。
2. Citrate Buffered Saline(0.01 M 柠檬酸缓冲液, PH6.0:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A.Citrate acid (柠檬酸 :10.5 g 加双蒸水至 1000 ml ; B.Citrate sodium(柠檬酸钠:29.41 g 加双蒸水至 1000 ml。
3. 细胞通透液:由终浓度分别为 0.3%双氧水和 0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS, 再接着加 120 ul TritonX-100,并加热一儿,冷却至临用前加 0.4 ml30%H 2 O 2 。
免疫组化技术的原理及方法
免疫组化技术的原理及方法免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的高灵敏度和高特异性的实验技术。
它通过特异性抗体与目标分子间的特异性结合来检测目标分子的存在和表达水平。
在该技术中，抗体作为探针，能够识别和结合目标分子的特定表位，从而可定量或定性地检测分子的存在或表达水平。
免疫组化技术的原理基于生物体自然产生的免疫应答机制。
当有外来物质（抗原）进入机体时，机体的免疫系统会产生抗体来与其特异性结合。
抗体与抗原结合后会激活一系列免疫反应，包括免疫效应细胞的激活和分泌抗体的B细胞的增殖和分化。
在免疫组化技术中，我们可以利用这一特性，使用高亲和力的特异性抗体来实现对目标分子的检测。
直接法是利用已标记的特异性抗体直接与目标分子结合。
这种方法在实验操作上比较简单，但需要对每种目标分子都有特异性标记的抗体。
直接法适用于目标分子丰度较高（>100 ng/mL）的情况。
间接法是通过两步反应实现对目标分子的检测。
第一步，使用未标记的特异性抗体与目标分子结合；第二步，使用标记抗体与先前结合的抗体结合。
标记抗体可以是酶、荧光染料、放射性同位素等。
这种方法的优势是只需要使用少量的少数几个标记抗体即可覆盖多种目标分子的检测，同时具有更高的灵敏度。
免疫组化技术的方法还包括免疫组化染色、免疫印迹和流式细胞术等。
其中，免疫组化染色是一种常见的方法，它通过对标本中特定目标分子的特异性染色来实现对其定位和定量的研究。
该方法适用于形态学研究和病理诊断。
免疫印迹是一种能够定性和定量地检测蛋白质表达的方法，通过将不同大小的蛋白质分子分离，并使用特异性抗体来检测目标蛋白质。
流式细胞术则是一种通过细胞表面的特异性抗体标记来分析和分离细胞的技术，它可以实现对细胞表型、蛋白质表达水平和细胞数量的检测。
总之，免疫组化技术是一种依赖于特异性抗体与目标分子结合的实验技术。
通过选择合适的检测方法和抗体，免疫组化技术可以应用于各种生物医学领域，如基础研究、临床诊断和药物研发。
免疫组化法
免疫组化法免疫组化法是一种利用特异性抗体与细胞内实体形成特异性结合来研究细胞上特定分子的分布方法。
这种技术比其他技术更具灵敏度、准确度和可靠性。
它可用于研究细胞内分子的表达和组织，广泛应用于生物学、医学等多个科学领域。
本文旨在对免疫组化法的基本原理、操作步骤、应用范围以及可能存在的问题进行系统的介绍。
1.疫组化法的基本原理免疫组化法是利用特异性抗体与细胞内实体形成特异性结合来研究细胞上特定分子的分布。
它的基本原理是，抗体首先结合细胞内的抗原，而后这种特异性结合将被放大以便显微镜下观察。
抗体可以是免疫动物免疫产生的单克隆特异性抗体，也可以是合成的多克隆抗体。
一旦抗体与目标抗原结合，它们便可以被以多种方式检测出来，可以在细胞或组织中就地检测，也可以把细胞拆散后重新检测。
2.疫组化法的操作步骤免疫组化法首先要确定目标抗原，然后根据抗原特性选择抗体。
接下来，将抗体和细胞或组织结合起来，通常需要表面活化物，如胶原、硅胶等材料。
接下来可以引入环境因子，如氧化剂、衰老因子等，调控动物细胞的生长和代谢。
随后可以根据需要采用细胞固定、免疫丝切片技术等方法来分析细胞结构和分子的分布。
最后，可以采用活性染色法、免疫荧光技术、共沉淀反应等技术来定量检测抗原的表达和结构分布。
3.疫组化法的应用范围免疫组化法可以用来定量衡量细胞内有毒物质的积累和分布，可检测细胞内蛋白质、脂质、DNA等物质，也可以用来比较不同细胞或不同组织、不同器官之间的分子表达量和组织分布，以及细胞成分的变化情况。
它可以用来研究物质的重组、修饰及转移方向，也可用来研究突变基因在细胞或组织上的表达情况，以及对不同病症的发病机制等。
4.能存在的问题免疫组化法具有良好的特异性和灵敏性，能够检测细胞和组织中的分子表达及结构分布，但不同抗体之间存在特异性差异，可能存在抗体偏聚、抗原取代等问题，需要进行抗体验证才能确保试验结果的可靠性。
此外，固定细胞的方法也是一个可能的问题，一般来说，固定的细胞很难保留原始的细胞结构和分子分布，或者可能存在过度固定的情况，可能会影响结果可靠性。
免疫组化步骤范文
免疫组化步骤范文免疫组化（immunohistochemistry, IHC）是通过对组织切片进行染色，利用免疫反应性的抗原抗体反应，以检测和定位组织切片中的特定抗原或蛋白质的技术。
免疫组化在临床病理学和研究中被广泛应用，可以提供有关疾病诊断、病理机制研究、分子分型和药物靶向治疗等方面的信息。
1. 抗原修复（antigen retrieval）：抗原修复是为了使组织样本中的目标抗原或蛋白质恢复到免疫表位充分暴露的状态。
组织切片有可能存在形态学变化、组织化学改变、酸碱性改变或氧化还原状态的变化，这些变化导致了抗原稀释或失活。
抗原修复的方法通常包括热敏抗原恢复和酶消化抗原恢复。
热敏抗原恢复是将组织切片放置在高温缓冲液中，以恢复抗原的形态和免疫活性。
酶消化抗原恢复是通过酶的消化作用，破坏组织切片中的蛋白质交联结构，使抗原恢复活性。
2. 阻断（blocking）：阻断是为了防止非特异性背景信号的产生。
在进入下一步的抗体孵育之前，使用非特异性的蛋白质来覆盖未被抗体结合的区域，防止后续过程中非特异性背景信号的形成。
通常使用的非特异性蛋白质包括牛血清蛋白、羊血清蛋白、鱼胶蛋白等。
3. 一抗孵育（primary antibody incubation）：在这一步骤中，使用特异性抗体与目标抗原或蛋白质结合。
抗原抗体反应是免疫组化的核心步骤，这一步骤的可靠性和特异性对结果的准确性和解释性起着至关重要的作用。
选择合适的一抗对研究目的至关重要，一抗通常通过免疫荧光标记、酶标标记或生物素标记等方式来实现。
4. 二抗孵育（secondary antibody incubation）：在这一步骤中，使用抗一抗体结合免疫球蛋白和抗体复合物。
一抗与目标抗原结合后，二抗与一抗的Fc区结合，从而形成一个抗原-一抗-二抗复合物。
二抗通常标记有酶（如辣根过氧化物酶-HRP）、荧光物质（如荧光素酶）或生物素等。
5. 显色反应（color development）：根据标记的二抗的性质，选择合适的显色方法。
免疫组化原理及应用
免疫组化原理及应用
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和定位细胞或组织中特定蛋白质的存在和表达情况。
其原理基于特异性抗体与特定抗原结合的免疫反应。
免疫组化的基本步骤包括抗原固定、抗体结合、信号放大和检测。
抗原固定：将待检测的组织样本固定在载玻片上，通常使用甲醛或冰醋酸进行固定。
抗体结合：向固定的组织样本中加入目标蛋白质特异性的原抗体，允许原抗体与目标蛋白质结合。
原抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
信号放大：在原抗体与目标蛋白质结合后，进行信号放大以增强检测的敏感性。
常见的信号放大方法包括二抗法和酶联免疫法。
二抗法指的是将与原抗体结合的二级抗体标记，通常是荧光染料或酶。
酶联免疫法是指将酶标记到二级抗体上，通过对酶底物进行着色或荧光染色来检测信号。
检测：根据不同的信号放大方法选择相应的检测方法，例如荧光显微镜观察、酶标仪测定或其他光学检测方法。
免疫组化广泛应用于医学研究和临床诊断等领域。
它可以用来检测肿瘤标志物、分析细胞蛋白表达和定位以及研究免疫系统等。
在临床上，免疫组化可以用于肿瘤诊断、评估治疗效果、
预测预后等。
在科研领域，免疫组化可以用来研究蛋白质相互作用、研究蛋白质功能和分子机制等。
免疫组化科普
免疫组化科普
免疫组化是一种用于检测组织切片中特定蛋白质表达的技术。
通过免疫组化技术，我们可以了解到组织切片中特定蛋白质的表达情况，从而帮助我们进行疾病的诊断和治疗。
在免疫组化中，我们常用的是抗体。
抗体是一种能够特异性地结合到目标蛋白质的分子。
在免疫组化中，我们通常会选择与目标蛋白质结构相似的抗体，将其标记上荧光素或酶等物质，再加入到组织切片中，经过反应后用显微镜观察标记物的分布情况。
免疫组化技术有着广泛的应用，例如在癌症诊断中，我们可以通过检测肿瘤组织中特定蛋白质的表达情况来判断病情的严重程度和预后。
在药物研发中，我们可以通过检测药物对特定蛋白质的影响来评估药物的疗效和毒性。
在病理学研究中，我们可以通过检测疾病组织中特定蛋白质的表达情况来了解疾病的发生机制和病理变化。
但是，在进行免疫组化检测时，我们也需要注意一些问题。
首先，抗体的选择非常重要，必须选择与目标蛋白质结构相似的抗体，否则可能会出现假阳性或假阴性的情况。
其次，免疫组化的结果受到许多因素的影响，例如组织处理的方法、抗体的浓度和反应时间等，因此需要进行严格的控制实验。
最后，免疫组化检测结果还需要结合临床病史和其他检测结果进行综合分析，才能得出准确的诊断和治疗方案。
总的来说，免疫组化是一种非常重要的检测技术，在医学研究和临床应用中都有着广泛的应用。
我们需要注意抗体的选择和实验的严格控制，以获得准确的检测结果，为疾病的诊断和治疗提供科学依据。
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免疫组织化学（实用篇）
immunohistochemistry 临床病理诊断中常用的抗体简介人体组织细胞分类上皮细胞：包括鳞状上皮，腺上皮，尿<a name=baidusnap0></a>路上</B>皮。
间叶组织：包括脂肪，肌肉，血管，纤维结缔组织，骨和软骨组织，间皮。
神经组织：神经元，胶质细胞，神经纤维。
淋巴造血：淋巴细胞，粒细胞，浆细胞，单核细胞。
内分泌和神经内分泌组织：甲状腺，肾上腺，垂体，胰腺的内分泌腺，各器官的神经内分泌细胞等其他：黑色素细胞，性腺常用上皮性标记物
细胞角蛋白（cytokeratin,CK）上皮膜抗原（epithelial membrane antigen, EMA）癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）其他：villin，Moc-31，MUC（粘蛋白）系列等 Cytokeratin（keratin或CK）
上皮细胞的骨架形成蛋白（中间丝），维持上皮细胞的结构和功能分为I型和II型酸性和碱性或中性），编码基因分别位于，共54个基因表达方式与组织类型和细胞分化程度有关，具有高度的特异性蛋白具有不同的分子量和等电点细胞中keratin常成对出现（酸性和碱性配对出现）根据氨基酸序列，将Keratin按分子量和等电点进行二维分类 CK抗体常用的CK 抗体 AE1/AE3:（CK pan）最常用，胞浆呈细丝状阳性正常上皮细胞阳性表达，肝细胞阴性。
在其他肿瘤，如小细胞癌，尿路上</B>皮癌，室管膜瘤，胸腺瘤，间皮瘤，上皮样肉瘤，上皮样血管内皮瘤，平滑肌肉瘤，滑膜肉瘤等常呈阳性表达常用的CK抗体 CK7和CK20：分子量为54KD,正常乳腺，肺，尿路上</B>皮阳性表达，胃肠道，肝细胞，前列腺阴性表达主要用于乳腺癌，肺腺癌与胃肠道癌的诊断与鉴别诊断胰腺癌，胆管癌，卵巢和子宫内膜腺癌，尿路上</B>皮癌阳性表达。
卵巢粘液性癌，前列腺癌，肝癌阴性表达与CK20和其他抗体合用对判断腺癌的来源具有重要价值。
常用的CK抗体 CK7和CK20：分子量46KD，正常胃肠道，尿路上</B>皮，Merkel细胞阳性表达，肝细胞，乳腺，肺阴性表达主要用于胃肠道腺癌，卵巢粘液性癌，Merkel细胞癌的诊断鳞癌，甲状腺肿瘤，胸腺瘤阴性表达胆道和胰管的腺癌，小肠类癌，前列腺和间皮阳性表达与CK7和其他抗体合用对判断腺癌的来源具有重要价值。
常用的CK抗体 CK5/CK6：分子量为58KD和56KD的角蛋白，存在于鳞状上皮、导管上皮的基底细胞、肌上
皮细胞和间皮细胞，腺上皮不表达用于鳞癌和腺癌别，间皮瘤和腺癌的鉴别导管上皮良恶性增生的鉴别常用的CK抗体 34BE12（CKH）: 高分子量细胞角蛋白，前列腺基底细胞标记，用于前列腺癌的诊断。
CK19: 40KD的角蛋白，在单层上皮和间皮中表达，在肝细胞不表达，用于鉴别肝细胞癌和胆管细胞癌；甲状腺肿瘤中，甲状腺乳头状癌常阳性表达，良性和其他癌很少表达。
CK14：50KD 的角蛋白，在复层上皮表达，是鳞状上皮的主要标记物。
间叶组织的标记物波形蛋白（vimentin， VIM）肌组织标记物：Desmin（结蛋白）, actin （肌动蛋白）, myogenin（肌浆蛋白），MyoD1（肌调节蛋白）等脉管标记：血管内内皮细胞的标记物：CD34,CD31,淋巴管D2-40 组织细胞的标记物：CD68, CD163,等间皮细胞的标记物：calretinin，mesothelial等用于鉴别软组织肿瘤的来源淋巴造血系统的标记淋巴造血组织，尤其淋巴细胞在其发育和分化过程中能形成许多分化性抗原，应用这些分化性抗原的特异性单克隆抗体能区分出免疫表型不同的细胞系，而且还能区分出同一细胞系的不同亚型和不同分化阶段的细胞群，因此可以利用此特性来诊断和分类恶性淋巴瘤和白血病。
淋巴造血系统的标记白细胞共同抗原（leucocyte common antigen,LCA,CD45）免疫球蛋白 immunoglobulin Ig 全B细胞标记物:CD20, CD79a, PAX5, Bob1等全T细胞标记物：CD3, CD43, CD5, CD7,CD2等 T淋巴细胞亚群标记物：CD4,CD8 粒细胞和单核―巨噬细胞相关标记物:MPO, CD34,CD68等浆细胞标记：CD38，CD138 其他：CD30,TDT,CD15，CD56，ALK，MUM1 神经组织标记物胶质纤维酸性蛋白glial fibrillary acidic protein GFAP S-lOO蛋白 S―100 Protein 神经元特异性烯醇酶 Neuron Specific Enolase，NSE 髓磷脂碱性蛋白 myelin basic protein，MBP 神经内分泌系统标记物 NSE Neuron Specific Enolase,神经元特异性烯醇酶 CgA chromogranin A 嗜铬颗粒蛋白 A Syn synaptophysin 突触囊泡蛋白 CD56 器官或组织特异性抗原标记物前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A 和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠：CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16 病原体的标记 EBV HPV HBsAg 和HBCAg MCV 与肿瘤预后相关的标记物 Ki67：核阳性，与肿瘤增殖相关，细胞周期中除G0期细
胞外，其余细胞均表达。
肿瘤阳性细胞数越高，预后越差。
P53：核阳性，肿瘤抑制基因，突变型P53蛋白稳定表达，P53蛋白阳性表明肿瘤预后差。
nm23：胞浆阳性，抗转移基因，其表达降低与肿瘤的高转移能力，复发相关。
与肿瘤多药耐药相关的标记物与肿瘤多药耐药相关的标记物与肿瘤靶向药物有关的免疫标记物免疫组织化学在外科病理诊断中的应用免疫组织化学在外科病理诊断中的应用恶性肿瘤性质? 癌组织的起源? 良性还是恶性? 肿瘤是原位还是侵袭性? 肿瘤分类? 癌的预后（包括分期）决定治疗的靶向其它方面…….. 未分化恶性肿瘤的性质? 最佳首选的抗体组合方案： CK-pan（如MNF-116），或鸡尾酒调制的CK抗体（上皮性肿瘤） LCA（淋巴瘤） S100蛋白（恶性黑色素瘤，虽然一些癌会阳性表达）恶性肿瘤的性质儿童小圆细胞肿瘤的性质淋巴瘤/白血病: LCA+, CD99+/。