发酵液还原糖的测定方法

中间体化验操作法
发酵液中糖含量的测定：
1．原理：利用还原性糖类的自由配合基在碱性溶液中能将高价铜还原成为
低价铜，过量的高价铜在酸性溶液中与碘化钾作用生成Cu2I2，同时析出碘，析出的碘以标准硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液滴定，同时做一空白对照，从两者之间求出糖的含量。

反应式如下：
酸△
(C6H10O6)n n(C6H10O6)
水解
CuSO4+2NaOH
Cu(OH)2＋Na2SO4
CHOH—COONa O—CH--COONa
Cu(OH)2＋Cu ＋2H2O
CHOH—COOK O—CH--COOK
O-CHCOOK CHO
Cu ＋CHOHO4
O-CHCOOK CHOH
O--CHCOOK COONa HO--CHCOOK
2Cu ＋NaOH＋H2O (CHOH)4＋Cu2O＋
O--CHCOOK CH2OH HO--CHCOONa
O—CHCOOK CHOHOOK
过量的Cu ＋2H2SO4
O—CHCOOK CHOHOONa
＋CuSO4＋Na＋＋K＋＋SO42-
2CuSO4＋4KI＋2Cu↓2K2SO4＋I2（在酸化条件下）
I2＋2Na2S2O32NaI＋Na2S4O6
2．试剂：
1）斐林试剂直接配制法：将酒石酸钾钠800g溶于水中，再溶入硫酸铜160g，加入1N的NaOH溶液1318ml （或固体氢氧化钠580g），最后加入KI400g溶后，加入纯化水至总体积为10000ml，摇匀即得。

2）斐林试剂贮备液的制备
a．硫酸铜贮备液：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）800g加纯化水溶解（如
浊可用玻璃棉过滤），使总体积成10000ml，摇匀即可。

b．酒石酸钾钠贮备液：称取酒石酸钾钠400g，加纯化水使总体积为1000ml
摇匀即得。

c．斐林试剂混合液：取硫酸铜贮备液1000ml，加酒石酸钾钠贮备液1000ml，
摇匀加11mol/L氢氧化钠（NaOH）659.5ml或固体NaOH290g，最后加入碘化钾（KI）200g，溶后加入水，使总体积为5000ml。

3）8N的硫酸：取36mol/ml 的试剂H2SO4（密度为1.84g/ml）222ml，缓缓注入778ml水中，放冷摇匀，即得。

4）0.5%淀粉指示剂：
a．称取可溶性淀粉5g，溶于约50ml纯化水中。

b．量取950ml纯化水于烧杯中，加热煮沸，将1）液倒入搅拌，使其溶解，冷却至室温倒入1000ml试剂瓶中，置冰箱备用。

5）20%碘化钾溶液：称取c．p碘化钾（KI）100克，用纯化水溶解至500ml，
摇匀即得。

6）4N盐酸（HCl）：量取12N的C．P盐酸（比重1.19）334ml，加纯化水
至1000ml，摇匀即得。

7）2N盐酸（HCl）：量取上述4N盐酸500ml，加纯化水500ml，摇匀即得。

8）0.4N碘酸钾（KIO3）基准溶液：精确称取经研细，并在105℃干燥至恒重的KIO3（AR）基准试剂3.5670g，用纯化水溶入250ml容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀即得0.4N的碘酸钾溶液，称量时误差不得超0.02‰。

W
KIO3的当量浓度=
250×0.0367（E/1000）
3.5670
= =0.4N
250×0.03567
214.02 35.67
E =
=35.67，=0.03567（KIO3的毫克当量）
6 1000
9）1N硫代硫酸钠（Na2S2O3）贮备液：
称取碳酸钠（Na2CO3）20g，溶于约6000ml 水中，加入五水亚硫酸钠(Na2SO3·5H2O)2000g，溶解完全后，稀释至1000ml，摇匀过滤继续放置一周后标化备用。

标化原理：
KIO3＋5KI＋6HCl 3I2＋6KC l＋3H2O
I2＋2Na2S2O32NaI＋Na2S2O6
标化操作：精确吸取已配制1mol/L的硫代硫酸钠溶液100ml于1000ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，注入已洗净并用待标定溶液冲2～3次的25ml一等滴定管中，另精确吸取5ml0.4N碘酸钾（HIO3）标准溶液于250ml碘瓶中，加5ml20%碘化钾（KI）溶液，加纯化水10ml，再加2mol/L盐酸（HCl）10ml，立即加盖并用纯化水水封在暗处放置3分钟，然后用上述硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液滴定，用淀粉做指示剂至兰色刚刚消失为终点。

要求：0.1mol/ml硫代硫酸钠（Na2S2O3）的结果允许误差在0.0002之间。

10）0.1mol/ml硫代硫酸钠（Na2S2O3）：经计算后，量取约1mol/ml的硫代硫酸钠贮备液一定量，稀释至
0.1mol/L，摇匀即可。

标化操作与1mol/L的Na2S2O3相同。

3．测定方法：
1）溶糖测定法：吸取发酵滤液2.5ml于50ml具塞刻度试管中，加5ml4mol/L盐酸（HCl）在沸水中水解10分钟，取出后冷却，用纯化水稀释至25ml，
取5ml稀释于150ml三角瓶中，加入斐林试剂25ml，摇匀后在电炉上加热沸腾3分钟，用冷水冷却后加入8N硫酸（H2SO4）10ml，摇匀立即以0.1mol/L硫代硫酸钠（Na2S2O3）的滴定液滴定，以淀粉做指示剂，滴定至指示剂由兰变白为止，记下消耗的滴定液数。

空白：直接取斐林试剂25ml于150ml三角瓶中，在电炉上沸腾3分钟，其他操作同上。

计算：
（V空白消耗Na2S2O3-V样品消耗Na2S2O3）×N Na2S2O3
V 0.1 Na2S2O3
0.1
由0.1mol/ml的硫代硫酸钠（Na2S2O3）的体积即可计算出溶糖的百分含量。

注：如所用的标准Na2S2O3的摩尔浓度正好是0.1mol/ml，则不需要再计算。

以空白所消耗的Na2S2O3体积减去样品Na2S2O3的体积即为0. 1000mol/ml硫代硫酸钠（Na2S2O3）的体
积，用此数直接查表即可。

2）还原糖测定法：取发酵滤液1ml（如含量在0.4%以上取0.5ml）于150ml
三角瓶中，加斐林试剂25ml，其它操作同溶糖做法。

空白操作同溶糖测定。

计算：以新消耗的Na2S2O3体积数查还原糖表。

4．标准曲线的制作：
精确称取（先60℃烤1小时，80℃烤1小时，105℃再烤2小时）烤过恒重的基准葡萄糖（AR含量在99%以上）0.5g于100ml容量瓶中，加
纯化水稀释至刻度，摇匀，分别吸取0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、5ml、10ml，按糖法测之，以糖的百分含量为横坐标，以0.1mol/L 硫代硫酸钠（Na2S2O3）滴定数为纵坐标，做一曲线，再将滴定体积数与糖含量关系列表备用。

1）操作注意事项：斐林溶液加量要准确，因铜量是计算的依据。

2）要保证电炉上加热沸腾3分钟的准确性，加热后必须冷却才能加8mol/L硫酸（H2SO4），以免碘挥发。

3）加入8mol/L硫酸（H2SO4）后开始滴定时要振摇，以免I2挥发。

淀粉指示剂在滴定将近终点时加入为宜，否则I2和淀粉形成复合物，碘淀粉影响滴定的准确度。

4）Na2S2O3的水溶液遇酸和空气中的氧及水中细菌极易起分解反应。

Na2S2O3＋H2CO3NaHCO3＋S2↓＋NaHSO3
Na2S2O3＋H2SO4Na2SO4+＋SO2＋H2O
Na2S2O3＋1/2O2Na2SO4+S↓
水中如含铜离子也能促其分解。

2Cu2+＋2S2O32-2Cu+＋S4O62-
由此在配制时要用煮沸冷却的纯化水，同时加入少量的碳酸钠，放置数日后，使其稳定，使用溶液时间不可太长，否则浓度易变化。

5）KIO3标准液应放在冰箱内，新配制的标准液与旧标准液要核对。

消耗Na2S2O3体积的差应在±0.02ml 以内。

6）标定硫代硫酸钠时个人平行两个结果之差应该小于0.03ml，二人核对结果之差小于0.05ml，否则均应重作。