白藜芦醇抗骨肉瘤细胞增殖及增强其免疫原性的研究

doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2019.19.007㊃中医中药与免疫㊃白藜芦醇抗骨肉瘤细胞增殖及增强其免疫原性的研究①童晨曦　姜晓玲　刘　美　陈昌蓉　曾　艳　宋银宏(三峡大学医学院病原与免疫学系,三峡大学感染与炎症损伤研究所,宜昌443002) 中图分类号　R738　R392.9 文献标志码　A 文章编号　1000⁃484X (2019)19⁃2337⁃06①本文受国家自然科学基金(81671397)资助㊂作者简介:童晨曦,男,硕士,主要从事肿瘤免疫方面的研究,E⁃mail:doctongchenxi@㊂通讯作者及指导教师:宋银宏,女,博士,副教授,主要从事免疫器官的发育及肿瘤免疫方面研究,E⁃mail:syh728@㊂[摘　要]　目的:探讨白藜芦醇(RES)对骨肉瘤K7M2细胞增殖的抑制作用和增强其免疫原性的潜力㊂方法:RES 处理细胞,MTT 法检测细胞增殖;流式检测细胞凋亡和细胞周期;RT⁃qPCR 检测细胞Mcl⁃1㊁Xiap㊁Kras㊁Bcl⁃2㊁CyclinE1㊁Bax 和Caspase⁃3mRNA 表达水平;Western blot 检测细胞Mcl⁃1㊁Xiap㊁Kras㊁Bcl⁃2㊁CyclinE1㊁Bax 和Caspase⁃3的蛋白表达情况;流式检测体内外K7M2细胞MHC 分子表达情况㊂结果:RES 能抑制K7M2细胞增殖;诱导细胞凋亡;阻滞细胞周期进程;降低K7M2细胞中Mcl⁃1㊁Xiap㊁Kras 和Bcl⁃2的mRNA 和蛋白表达水平,增强CyclinE1㊁Bax 和Caspase⁃3的mRNA 和蛋白表达水平;另外,RES 在体内外均能增强K7M2细胞系MHC 分子的表达水平㊂结论:RES 对骨肉瘤K7M2细胞有显著的增殖抑制作用,且在体内外均显著增强K7M2细胞的免疫原性,RES 具有治疗骨肉瘤的潜力㊂[关键词]　白藜芦醇;骨肉瘤;免疫应答;K7M2细胞Anti⁃proliferation and enhance immunogenicity capacity of resveratrol on osteo⁃sarcoma cellsTONG Chen⁃Xi ,JIANG Xiao⁃Ling ,LIU Mei ,CHEN Chang⁃Rong ,ZENG Yan ,SONG Yin⁃Hong .Department of Etiology and Immunology ,Medical College of China Three Gorges University ,Institute of Infection and Inflammation ,China Three Gorges University ,Yichang 443002,China[Abstract ]　Objective :To investigate anti⁃proliferation and enhance immunogenicity capacity of resveratrol (RES )onosteosarcoma K7M2cells.Methods :K7M2cells was treated with RES.Cell proliferation was detected by MTT assay.Apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry.The mRNA expression of Mcl⁃1,Xiap,Kras,Bcl⁃2,CyclinE1,Bax and Caspase⁃3of K7M2cells were detected by RT⁃qPCR.The protein expression of Mcl⁃1,Xiap,Kras,Bcl⁃2,CyclinE1,Bax and Caspase⁃3of K7M2cells were detected by Western blot analysis.The expression of MHC molecules was detected by flow cytometry.Results :RES inhibited K7M2cell proliferation,induced apoptosis and cell cycle arrest.RES treatment decreased mRNA and protein expression levels of Mcl⁃1,Xiap,Kras and Bcl⁃2,and enhanced the mRNA and protein expression levels of CyclinE1,Bax and Caspase⁃3in K7M2cells.In addition,RES enhanced the expression levels of MHC molecules of K7M2cell in vitro and in vivo.Conclusion :RES is able to significantly inhibitedthe proliferation and enhance the immunogenicity of osteosarcoma K7M2cells.RES has the potential to treat osteosarcoma.[Key words ]　Resveratrol;Osteosarcoma;Immune response;K7M2cells 骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一种多发生于儿童和青少年的骨恶性肿瘤,其恶性程度极高㊂目前,骨肉瘤的主要治疗方案是手术和放化疗㊂多种治疗手段的发展使患者的5年生存率提高到60%,但发生转移的患者5年生存率小于20%[1]㊂对抗癌疗法产生抗性是造成肿瘤转移和患者死亡的主要原因,其发生机制与免疫系统的应答反应也息息相关[2]㊂因此,研究具有选择性细胞毒性的药物对治疗骨肉瘤具有实际意义㊂白藜芦醇(Resveratrol,RES)是一种来自葡萄㊁桑葚㊁花生和其他植物的天然植物多酚化合物,作用十分广泛,其对抗炎㊁抗氧化等都有一定功效[3]㊂而白藜芦醇的抗癌特性更是引起了很大关注㊂有文献报道白藜芦醇对多种肿瘤细胞有抑制作用,如卵巢癌㊁皮肤癌[4⁃6]㊂对于骨肉瘤,也有研究组开展了白藜芦醇对骨肉瘤抑制作用的实验研究㊂但是对其是否能增强骨肉瘤细胞的免疫原性和体内的免疫应答并不是十分清楚㊂本研究进一步探讨了白藜芦醇对骨肉瘤K7M2细胞系的抗增殖作用,并对白藜芦醇增强骨肉瘤细胞的免疫原性进行了探讨㊂1　材料与方法1.1　材料1.1.1　细胞株和实验动物　小鼠骨肉瘤细胞株K7M2购自上海中科院细胞库㊂BALB/c小鼠(雌性,6~8周龄,体重约16~18g)购于三峡大学实验动物中心,动物质量合格证号:42010200001767㊂1.1.2　主要试剂和仪器　白藜芦醇(成都克洛玛生物科技有限公司);DMEM高糖培养基㊁胎牛血清(Gibco);细胞凋亡试剂盒(BD公司);MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒㊁细胞周期试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司);TRIzol Reagent (Invitrogen);PCR逆转录试剂盒和PowerUpTM SYBR Green Master Mix(Thermo Scientific);蛋白提取试剂盒(索莱宝科技有限公司);BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Scientific);β⁃actin兔抗鼠单克隆抗体㊁CyclinE1兔抗鼠单克隆抗体和XIAP兔抗鼠单克隆抗体(Ruiying Biological);Mcl⁃1兔抗鼠单克隆抗体㊁Bcl⁃2兔抗鼠单克隆抗体,Bax兔抗鼠单克隆抗体和Caspase⁃3兔抗鼠单克隆抗体(Cell signaling technology);Kras兔抗鼠单克隆抗体(Abcam);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(谷歌生物科技有限公司);H⁃2Kd⁃FITC(MHCⅠ),I⁃A/I⁃E⁃PE(MHC Ⅱ)(BD公司);CD45⁃APC荧光单克隆抗体(Biolegend);BD FACSVerse流式细胞仪(BD公司);Multiskan Spectrum全波长酶标仪(Thermo Scientific);StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司);GelX凝胶成像系统(上海欧翔科学仪器有限公司)㊂1.2　方法1.2.1　细胞培养　K7M2细胞用含10%胎牛血清㊁1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素的高糖DMEM培养,置于37℃㊁5%CO2培养箱中㊂隔天换液,每隔2d传代一次㊂1.2.2　MTT检测细胞增殖　将细胞接种在96孔平底板中(6000个/孔)㊂分不同浓度组(80㊁40㊁20㊁10㊁5μmol/L)的RES处理细胞24h㊁48h和72h,每组设置6个复孔,同时设置阴性对照组和空白对照组,阴性对照组用与药物相同体积的DMSO处理㊂相应时间点用含有10%MTT(5mg/ml)溶液的150μl新鲜培养基替换旧培养基㊂在37℃温育4h 后,除去MTT溶液,并用150μl DMSO溶解细胞内甲瓒晶体㊂酶标仪在570nm处的测定每孔吸光度(A)值㊂实验组和阴性对照组均减去空白对照组(A)值后,计算细胞抑制率,细胞抑制率=(阴性对照组-实验组)/阴性对照组×100%㊂1.2.3　细胞凋亡实验　K7M2细胞用20μmol/L和40μmol/L的RES孵育48h㊂设置单染组和对照组,对照组用与药物相同体积的DMSO处理㊂用不含EDTA的消化酶消化后收集细胞并调整细胞浓度至1×106个/ml,PBS洗涤2次,用100μl的1×Binding buffer重悬,然后加入2.5μl PE和5μl 7⁃AAD染液在25℃避光环境下孵育15min㊂然后上流式细胞仪检测不同处理组细胞凋亡变化㊂1.2.4　细胞周期实验　K7M2细胞用20μmol/L和40μmol/L的RES培养48h,对照组加入与药物相同体积的DMSO㊂收集细胞PBS洗涤两次,用70%乙醇于4℃固定一夜,用PI和RNase A溶液染色,流式细胞术分析不同处理组细胞周期比例㊂1.2.5　实时定量多聚酶链聚合反应(RT⁃qPCR)检测细胞凋亡和细胞周期相关基因的表达量　K7M2细胞用20μmol/L和40μmol/L的RES培养48h,对照组加入与药物相同体积的DMSO㊂用TRIzol从K7M2细胞中提取RNA,将RNA逆转录成cDNA㊂使用SYBR Green Master Mix在StepOnePlus Real⁃Time PCR System仪器上进行RT⁃qPCR反应㊂β⁃actin作为内参,用2-ΔΔCt法计算Xiap㊁Kras㊁Bcl⁃2㊁Mcl⁃1㊁CyclinE1㊁Bax和Caspase⁃3相对表达量㊂RT⁃qPCR反应条件:95℃45s,56℃30s,72℃3min,40个循环㊂所有引物序列及相关信息见表1㊂1.2.6　蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞凋亡和细胞周期相关蛋白的表达量　K7M2细胞用20μmol/L和40μmol/L的RES培养48h,对照组加入与药物相同体积的DMSO㊂用RIPA裂解液提取K7M2细胞蛋白,BCA法测定蛋白浓度㊂用SDS⁃PAGE凝胶电泳分离蛋白,湿转90min至PVDF膜上,置于5%脱脂牛奶中室温封闭1h,加入相应目的蛋白的一抗于4℃孵育过夜,TBST洗膜3次后二抗室温孵育1h,ECL化学发光试剂显色㊂IPP6.0对显影出来的条带进行分析㊂1.2.7　流式细胞术检测分子1.2.7.1　体外K7M2细胞系MHC分子的检测　K7M2细胞用20μmol/L和40μmol/L的RES处理48h㊂收集细胞并设置对照组和单标记组,对照组加入与药物相同体积的DMSO㊂用荧光单克隆抗体H⁃2Kd⁃FITC(MHCⅠ)㊁I⁃A/I⁃E⁃PE(MHCⅡ)以1∶100稀释比例加入不同处理组,冰上避光孵育60min,流式细胞仪检测各组MHCⅠ类和MHCⅡ类分子表达变化㊂1.2.7.2　荷骨肉瘤小鼠模型肿瘤细胞MHC分子的检测　6~8周龄,体重16~18g雌性BALB/c小鼠按体重随机分为3组㊂高剂量治疗组为100mg/kg,低剂量治疗组为50mg/kg,对照组注射含药物相同体积DMSO的PBS溶液㊂首先构建荷骨肉瘤小鼠模型,体外培养的K7M2细胞制备成单细胞悬液,调整细胞浓度为5×105个/ml,取200μl细胞悬液注射于小鼠右侧腋窝皮下㊂用游标卡尺测量体积,当瘤体体积≥0.3cm×0.3cm×0.3cm,判断荷瘤成功㊂每日称量体重后,将药物用PBS溶液按分组剂量配制好后,每只取200μl于瘤周皮下注射,注射用药16d,颈椎脱臼处死小鼠,无菌取肿瘤组织剪碎㊁研磨挤压成单细胞悬液后,离心㊁弃掉上清㊂300g离心5min后弃上清收集细胞,不同处理组分别加入1∶100稀释的单克隆抗体组合(H⁃2Kd⁃FITC㊁I⁃A/I⁃E⁃PE和CD45⁃APC),4℃避光反应60min,各管加入3ml PBS重悬,300g离心5min后弃上清,表1　PCR引物Tab.1　PCR primersGene Primer sequence(5′⁃3′)β⁃actin F:GTGGATCAGCAAGCAGGAGTR:GTGGATCAGCAAGCAGGAGT Xiap F:TTGGAACATGGACATCCTCAR:TACCACTTCGCATGCTGTTC Kras F:AGAGCGCCTTGACGATACAGR:CCCTCCCCAGTTCTCATGTA Mcl⁃1F:CAAAGATGGCGTAACAACTGGR:CGTTTCGTCCTTACAAGAACA Bcl⁃2F:GATGACTGAGTACCTGAACCGR:CAGAGACAGCCAGGAGAAATC CyclinE1F:GCGAGGATGAGAGCAGTTCR:AAGTCCTGTGCCAAGTAGAAC Bax F:CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAGR:CCAGCCCATGATGGTTCTGA Caspase⁃3F:ACCATGGAGAACACTGAAR:TTAGTGATAAAAATAGAG 重复2次;上流式细胞仪分析不同组肿瘤细胞(CD45⁃)MHC分子表达变化㊂1.3　统计学分析　数据采用GraphPad Prism6.02软件进行统计分析,MTT检测细胞增殖结果用单因素方差分析,其余均采用t检验分析㊂所有数据均用x±s表示,n≥3㊂P<0.05为差异具有统计学意义㊂2　结果2.1　RES对骨肉瘤K7M2细胞增殖的影响　MTT 法检测细胞增殖,结果如图1所示,RES处理细胞24h后,40μmol/L及80μmol/L两个处理组的细胞增殖抑制率分别为38.24%及38.87%㊂处理细胞48h后,20㊁40㊁80μmol/L三个处理组的细胞抑制率均大于30%;处理细胞72h后,5㊁10㊁20㊁40和80μmol/L的RES均可显著抑制K7M2细胞增殖㊂相同浓度RES作用K7M2细胞,抑制率随着药物作用时间的延长而提高,这说明RES抑制骨肉瘤K7M2细胞增殖具有时间依赖性㊂2.2　RES对骨肉瘤K7M2细胞凋亡的影响　用流式细胞术检测细胞凋亡,结果如图2所示,与DMSO 组相比较,RES(20μmol/L和40μmol/L)组的细胞凋亡率显著升高(P<0.01,P<0.001),存活细胞显著减少(P<0.05,P<0.001),表明RES能显著诱导骨肉瘤K7M2细胞凋亡㊂2.3　RES对骨肉瘤K7M2细胞周期的影响　流式细胞术检测细胞周期,发现与DMSO组相比较,RES (20μmol/L和40μmol/L)组S期的K7M2细胞均显著增多(P<0.05,图3)㊂表明RES能诱导骨肉瘤K7M2细胞周期阻滞在S期㊂图1　RES显著抑制K7M2细胞增殖Fig.1　RES significantly inhibited K7M2cell proliferation Note:Cell inhibition rate was determined by MTT assay.***.P<0.001.2.4　RES 对细胞凋亡和细胞周期相关基因和蛋白表达量的影响　用后RT⁃qPCR 检测基因表达,发现与DMSO 组相比较,20μmol /L RES 处理组Xiap㊁Kras㊁Bcl⁃2和Mcl⁃1mRNA 表达水平显著降低(P <0.01㊁P <0.05㊁P <0.01㊁P <0.001,图4A),而Cy⁃clinE1㊁Bax 和Caspase⁃3mRNA表达水平均显著升图2　RES 显著诱导K7M2细胞凋亡Fig.2　RES significantly induced apoptosis in K7M2cellsNote:Cellapoptosisandviabilityweredeterminedbyflowpared with group DMSO,n =3,*.P <0.05.**.P <0.01.***.P <0.001.图3　RES 显著诱导K7M2细胞周期阻滞于S 期Fig.3　RES significantly induced K7M2cell cycle arrestedat S phaseNote:Cell cycle was determined by flow pared with groupDMSO,n =3,*.P <0.05.高(P <0.05,图4B );40μmol /L RES 处理组Xiap㊁Kras㊁Bcl⁃2和Mcl⁃1mRNA 表达水平同样显著降低(P <0.001㊁P <0.05㊁P <0.05㊁P <0.001,图4A),而CyclinE1㊁Bax 和Caspase⁃3mRNA 表达水平显著升高(P <0.01㊁P <0.05㊁P <0.05,图4B)㊂用Western blot 检测蛋白,结果如图4C 所示,与DMSO 组相比较,RES (20μmol /L 和40μmol /L)组Xiap㊁Kras㊁Bcl⁃2和Mcl⁃1的蛋白表达水平显著降低,而CyclinE1㊁Bax 和Caspase⁃3的蛋白水平表达显著升高,同mRNA 水平改变趋势相一致㊂2.5　RES 对体内外骨肉瘤MHC 分子表达的影响　用流式细胞术检测MHC 分子的表达,结果发现,与DMSO 组相比较,RES(20μmol /L 和40μmol /L)在体外处理K7M2细胞后,细胞的MHC Ⅰ类分子(图5A)及MHCⅡ类分子(图5B)的表达量均显著增加(P <0.05㊁P <0.01;P <0.05㊁P <0.01)㊂在体内实验中,与对照组小鼠相比,RES (50mg /kg 和100mg /kg)处理的荷骨肉瘤小鼠的肿瘤细胞MHCⅠ类分子表达量显著增高(P <0.01㊁P <0.001,图5C),同时,MHC Ⅱ类分子表达量也显著增高(P <0.01㊁P <0.001,图5D)㊂表明RES 能显著增强体内外骨肉瘤K7M2细胞的免疫原性㊂图4　RES 对K7M2细胞凋亡和细胞周期相关的基因和蛋白表达量的影响Fig.4　Effect of RES on expression of mRNA and proteinin K7M2cellsNote:A,B.The expression of mRNA was determined by RT⁃pared with group DMSO.n =3,*.P <0.05,**.P <0.01,***.P <0.001.C.The expression of protein wasdetermined by Western blot.图5　RES显著增强体内外K7M2细胞MHC分子表达Fig.5　RES significantly enhanced MHC molecule expression of K7M2cellsNote:The expression of MHC was determined by flow pared with group DMSO.n=3,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.3　讨论肿瘤的发生发展受一系列复杂机制的影响,其中包括原癌基因和肿瘤抑制基因的突变以及凋亡过程的改变,凋亡的累积同样会影响细胞周期的稳态㊂同时也与癌细胞的识别或肿瘤生长同抗肿瘤免疫应答之间的平衡有关[7]㊂那么对于宿主而言,抗肿瘤免疫就起着十分重要的作用㊂此前大量研究表明,化疗药物对肿瘤细胞的作用机制主要是通过诱导细胞同期停滞和细胞凋亡[8,9],而关于白藜芦醇影响骨肉瘤免疫应答的研究较少㊂本研究采用骨肉瘤K7M2细胞,首先体外检测RES对K7M2细胞毒性作用,对细胞凋亡和细胞周期的影响㊂发现用20μmol/L和40μmol/L RES处理K7M2细胞48h 后能够有效诱导细胞凋亡,并使细胞周期阻滞在S 期㊂与此同时,与细胞凋亡和细胞周期相关基因和蛋白的表达水平也发生了改变㊂Bcl⁃2㊁Bax和Mcl⁃1同属于B淋巴细胞瘤⁃2蛋白(B⁃cell lymphoma⁃2,Bcl⁃2)家族,Bcl⁃2和Mcl⁃1发挥着抗凋亡作用,而Bax属于促凋亡基因,共同发挥调节作用[10]㊂X连锁凋亡抑制蛋白(X⁃linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是凋亡蛋白抑制剂(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中的一员,可直接抑制Caspase⁃3,并传递不依赖Caspase的信号㊂这样,作为下游终末剪切酶效应的Caspase⁃3就不能发挥其促进凋亡发生的作用[11,12]㊂K⁃ras编码一种调节增殖㊁分化和细胞存活的膜相关GTP酶信号蛋白,在肿瘤发生和发展中起重要作用,会导致预后不良[13]㊂CyclinE1作为细胞周期从G1期向S进展的重要调节因子,在大多数人类癌症中表达,并与肿瘤发生相关[14]㊂本文发现20μmol/L和40μmol/L RES处理K7M2细胞48h后,Mcl⁃1㊁Xiap㊁K⁃ras和Bcl⁃2mRNA和蛋白水平明显降低,而Bax和Caspase⁃3明显增高,这些基因和蛋白的表达变化都能促使肿瘤细胞凋亡的发生㊂有趣的是,CyclinE1 mRNA和蛋白表达水平也显著增加,这种变化可能也与在多细胞生物中,周期分裂是与外部环境和内部细胞状态相结合,细胞分裂过程中变化的类型也不尽相同有关[15]㊂还可能与其他周期蛋白(如细胞周期中CyclinD1和CyclinE1)表达的高低㊁相互调控以及肿瘤类型相关联[16]㊂还有可能是某些恶性肿瘤本身的发展过程中CyclinE1的扩增很少,药物治疗后会发生其他变化㊂当然,彻底阐明其机制需要开展更多的相关研究工作㊂但事实上,在本研究中CyclinE1的升高导致了G0/G1期细胞减少,细胞周期阻滞在S期,但G2/M期并无显著改变㊂许多研究已经发现,在60%~90%的不同组织学起源的人类癌症如头颈部㊁皮肤㊁乳腺和肺中MHCⅠ类分子表达下调或完全丧失[17,18]㊂具有下调MHC 表达的癌症有更大的转移潜能,对患者预后不良[19,20]㊂本研究发现,在20μmol/L和40μmol/L RES处理K7M2细胞48h后,体外培养的K7M2细胞系中MHCⅠ类㊁MHCⅡ类分子的表达量显著增加㊂同样的结果在体内动物研究也得到了验证㊂通过构建荷骨肉瘤小鼠模型,50mg/kg和100mg/kg的RES 在肿瘤局部注射16d后,发现荷骨肉瘤小鼠肿瘤细胞中MHCⅠ和MHCⅡ类分子的表达都显著增高,有显著的统计学差异㊂肿瘤逃避免疫识别的一个重要机制即是降低递呈肿瘤抗原给细胞毒性T细胞的MHCⅠ类分子的表达[21,22],MHCⅠ类表达增加,表明RES可减弱MHCⅠ类分子低表达而产生的免疫逃逸㊂MHCⅡ类分子在肿瘤细胞中一般并不表达,而在RES处理后,MHCⅡ类分子表达增多则被认为是抗原提呈能力增强的表现,可能会增强免疫反应[23]㊂我们推测,同MHC分子的改变一样,体内会有众多免疫细胞的改变来对抗骨肉瘤㊂综上所述,RES具有抑制骨肉瘤细胞增殖的作用,另外其也具有提高抗肿瘤免疫的潜力㊂本研究在动物模型治疗过程中也初步观察到50mg/kg和100mg/kg的RES对小鼠骨肉瘤体积有抑制效应,未来将在进一步的研究中明确其治疗效果㊂此外,在进一步的研究中,还将检测肿瘤组织中募集的免疫细胞变化,探讨RES对骨肉瘤小鼠肿瘤的抑制作用及对抗肿瘤免疫是否有增强作用,并讨论其可能的机制㊂参考文献:[1]　Luetke A,Meyers PA,Lewis I,et al.Osteosarcoma 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