广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室

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大黄对凡纳滨对虾生长和非特异性免疫指标的影响

大黄对凡纳滨对虾生长和非特异性免疫指标的影响李素莹;周歧存【摘要】在凡纳滨对虾饲料中分别添加大黄0、0.5、1.0、5.0、10.0和20.0g/kg,研究大黄对凡纳滨对虾(初始体重为0.34±O.004 g)生长及非特异性免疫指标的影响.结果表明,大黄对凡纳滨对虾成活率、增重率、特定生长率、饲料系数、蛋白质效率和蛋白质累积率的影响不显著(P>0.05),对全虾和尾肌肉的灰分、脂肪和粗蛋白含量影响显著,全虾的粗蛋白和粗脂肪含量以1.0g/kg组最高(P<0.05),对凡纳滨对虾血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶以及血清总蛋白量等的影响显著,溶菌酶活性以1.0 g厂kg组最高(P<0.05);细菌感染实验中以1.0 g/kg组存活率最高(P<0.05).以非特异性免疫反应指标及感染实验存活率为指标,凡纳滨对虾饲料中大黄的适宜添加量为1.0 g/kg.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2009(029)006【总页数】6页(P36-41)【关键词】凡纳滨对虾;生长;非特异性免疫指标;大黄【作者】李素莹;周歧存【作者单位】广东海洋大学水产学院,广东,湛江,524025;广东海洋大学水产学院,广东,湛江,524025【正文语种】中文【中图分类】S963.73+6近年来，随着水产养殖业的发展，高密度集约化养殖、过量投饵等导致养殖环境恶化以及各类细菌病、病毒病频发[1]，若在疾病防治时使用抗生素及化学药物则存在某些病原微生物的耐药性增强及药物残留等问题，可见，提高动物自身的免疫力对解决养殖病害问题极为重要。

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei，Boone）具生长快、繁殖期长、肉质鲜美、出肉率高、抗逆性强、易运输等优点，是高产养殖的优良品种[2]。

中草药具有价格低廉、副作用小、无残留等优点[3] ，研究中草药在凡纳滨对虾养殖中的应用具有重要的经济价值。

五种水产消毒剂对中华哲水蚤的毒性试验

捕捞、观察，成本低等优点。为了避免受到病原菌的影响，培育过程中和投喂时经常需要进行消毒处理；研究还发现桡足类是对虾白斑综合症病毒的宿主
究也较多
的二氧化氯（固体）有效氯为８；，％江门市大光明农化有限公司生产的氯氰菊酯（液体）其有效成，
中华哲水蚤（ＣｌｎｄｅＳｎｃｓ在分类上ａａｉａｉｉ）ｕ
效氯３％；０北京中大安特升华科技有限公司生产
属于节肢动物门甲壳纲桡足亚纲的一类小型、低等的甲壳动物，是鱼类和其它动物良好高，且容易并
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《渔业现代化）０８２０年第３卷第２５期
４３
五种水产消毒剂对中华哲水蚤的毒性试验
孙成波陈荣胜，，范玉阳，施钢超，邓，王平
（１广东海洋大学水产学院广东湛江５４２；２广东省水产经济动物病原生物学及流行病重点实验室２０５
作者简介：孙成波（９０）男，１７一，博士，副教授，硕士生导师，甲壳动物增养殖和病害防治研究和教学。ＥｍｉｓｎｂｄＵｅｕｃ从事 — ａ：ｕｃ＠ｇＯ．ｄ．ｎｌ
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《渔业现代化）０８２０年第３卷第２ ‘ ５期
试验在５０ｍ０Ｌ烧杯中进行；验试
在形态和生态方面
药液为３０ｍＬ２０，４ｈ后更换一半的药液；验用试

溶藻弧菌转运蛋白TolB的免疫原性与免疫保护性

溶藻弧菌转运蛋白TolB的免疫原性与免疫保护性庞欢瑛;周泽军;张燕飞;李静;邱明生;丁燏;简纪常;吴灶和【摘要】旨在研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901转运蛋白TolB作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的全基因组序列,设计特异性引物PCR扩增tolB 的基因全长序列.序列分析显示,该基因(GenBank登录号JQ846501)全长1 353 bp,共编码450个氨基酸残基.BLAST分析发现,溶藻弧菌tolB基因与其他已知弧菌的tolB具有较高的同源性,序列保守,可作为共同抗原候选蛋白.用原核表达的tolB 蛋白免疫SPF级小鼠,制备多克隆抗体,ELISA效价达1∶40000.免疫印迹表明鼠抗tolB血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应.为进一步研究tolB对石斑鱼(Epinephelus awoara)的免疫保护性,用TolB蛋白两次免疫石斑鱼,ELISA检测发现,免疫石斑鱼血清的抗体效价在第4周达到峰值(1∶2048).攻毒实验结果表明TolB对石斑鱼的免疫保护率为76％.结果表明,溶藻弧菌转运蛋白TolB具有较好的免疫原性和免疫保护性,可作为弧菌亚单位疫苗的候选抗原.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(031)007【总页数】7页(P143-149)【关键词】溶藻弧菌;tolB基因;免疫原性;免疫保护【作者】庞欢瑛;周泽军;张燕飞;李静;邱明生;丁燏;简纪常;吴灶和【作者单位】广东海洋大学水产学院,湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,湛江524088;广东海洋大学水产学院,湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,湛江524088;广东海洋大学水产学院,湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,湛江524088;广东海洋大学水产学院,湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,湛江524088;广东海洋大学水产学院,湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,湛江524088;广东海洋大学水产学院,湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,湛江524088;广东海洋大学水产学院,湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,湛江524088;仲恺农业工程学院,广州510225【正文语种】中文溶藻弧菌是一种嗜盐嗜温性、兼性厌氧的革兰氏阴性短杆菌，广泛分布于世界各地，是水生动物弧菌病的主要病原菌之一［1-3］。

广东省重点实验室验收流程

广东省重点实验室验收流程???????? ?1、实验室建设期满，由省科技厅通知各实验室依托单位验收。

??? 2、各实验室依托单位向省科技厅报送验收材料，验收材料主要包括实验室建设情况总结及相关的证明材料和附件。

实验室建设情况总结应对应其批准的实施方案和签定的合同，分别进行阐述和自我评价。

??? 3、省科技厅初审相关材料后，决定验收与否并安排验收时间。

??? 4、验收形式以现场验收为主，验收组专家原则上由5—7人组成。

验收会议议程主要包括实验室建设总体情况汇报、现场考察、答疑和核对相关材料、专家组形成验收意见。

广东省重点实验室立项、验收汇总表?广东省重点实验室-简介二十年来，在省委、省政府的正确领导和相关部门的大力支持下，省重点实验室紧紧围绕我省经济和社会发展需求，实行“开放、流动、竞争、协作”的运行机制，开展应用基础和应用开发研究工作，取得了显着的成效，已成为我省科技自主创新的核心力量；成为拥有自主知识产权科研成果的创新基地；成为聚集、培养高层次科技人才的基地和科技合作与交流的窗口，对推动我省科技进步和科技体制改革，提高自主创新能力和促进社会、经济的发展发挥了重要的作用，作出了重大的贡献。

一、建设基本情况国家重点实验室建设始于1984年，我省则从“七五”期间落实科技体制改革，开展省重点实验室建设。

1986年12月，省科委和省计委共同建设第一家省重点实验室，拉开了广东省重点实验室的建设序幕。

随后，我省重点实验室的建设步伐不断加快，主要体现在三个方面：一是总体规模不断壮大。

经过20年的建设，我省重点实验室不断发展壮大，从“七五”的8家发展到目前的94家，其中70家已建成验收。

与兄弟省市相比，北京有市级重点实验室66家，上海54家，江苏有省级重点实验室19家，浙江40家，我省重点实验室的建设规模走在全国前列。

二是分布领域日益广泛。

我省的重点实验室分布在科研机构的有41家，在高校的有49家，在相关部门和企业的有4家，分别占％、％和％。

广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室(精)

广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室－－2006年度开放基金课题申请指南广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室(Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals)依托于广东海洋大学，主要研究方向包括水产经济动物病原生物学及其致病机理、水产经济动物主要疾病的流行病学、及水产动物免疫学诊断监测技术。

根据“开放、合作、竞争”的运行机制，实验室重视多学科的相互结合渗透，热忱欢迎和邀请相关领域的国内外科研人员来实验室进行合作研究，共同推动我国水产经济动物病原生物学及流行病学研究的发展。

1．实验室概况实验室现有工作人员20名，其中教授或研究员5名，副教授或副研究员9名，中级职称及其他人员6名。

实验室现有在读博士生4名，硕士研究生22名。

有设备较完善的实验室和试验基地，实验室面积达600m2，仪器设备固定资产达600多万元，现有AKTA蛋白纯化系统、超低温冰箱、自动包埋切片机、Biolog 细菌鉴定系统、PCR仪、凝胶成像系统、DNA杂交炉、莱卡组织显微镜、莱卡倒置显微镜、莱卡体视显微镜、莱卡半自动组织切片机及冷冻切片机、电子分析天平、紫外可见分光光度计、紫外成像仪、BIO-RAD蛋白电泳系统、高速冷冻离心机、酶标仪等先进进口仪器设备，可以满足分子生物学、病原及病理学、免疫学、微生物学等学科的研究。

2．说明1）开放基金面向国内外的科技工作者，主要资助对象为具有中级职称，或具有硕士以上学位并具有一定工作经验的科研、教学及技术人员。

中级职称以下的申请者需有2名副高以上技术职称的人员书面推荐。

开放基金鼓励资助学术思想活跃、能独立开展研究工作的青年科学工作者；并鼓励中级职称以上的各类科研人员及硕博研究生来实验室从事短期研究工作。

2）开放基金主要资助与本实验室研究方向相关的课题，具体方向参见本指南第4条。

溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化

溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化陈立明;庞欢瑛;简纪常;吴灶和【摘要】根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温度、诱导时间、诱导IPTG浓度等条件的优化,最后探究其纯化时最佳咪唑洗脱浓度.结果表明:DTD蛋白成功表达,且其以包涵体的形式存在,在诱导温度37C、IPTG浓度0.1 mmol/L条件下诱导5h表达量最高,纯化最佳咪唑洗脱浓度为150 mmol/L.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2014(034)003【总页数】6页(P52-57)【关键词】溶藻弧菌;dtd;基因克隆;原核表达;条件优化【作者】陈立明;庞欢瑛;简纪常;吴灶和【作者单位】广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;仲恺农业工程学院,广东广州510225【正文语种】中文【中图分类】S941溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)属于弧菌科(Vibrionaceae)，弧菌属(Vibrio)，又名藻朊酸弧菌、解藻酸弧菌、解藻朊酸内克氏菌[1]，是一种嗜盐嗜温、兼性厌氧的海生革兰氏阴性短杆细菌。

水生动物病原菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)及其溶血素共调节蛋白研究进展

第39卷第1期大连海洋大学学报Vol.39No.1 2024年2月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Feb.2024DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2023-095文章编号:2095-1388(2024)01-0162-10水生动物病原菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)及其溶血素共调节蛋白研究进展伍水龙1,2,黄瑜1,3,王蓓1,3,汤菊芬1,3,蔡佳1,3∗,简纪常1,3∗(1.广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;2.湛江中心人民医院临床医学研究所,广东湛江524045;3.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088)摘要:Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)是多种革兰氏阴性菌编码的蛋白分泌装置,在毒力因子释放㊁生物被膜形成㊁铁离子摄取㊁囊泡运输㊁环境压力适应性及细菌胞内存活等方面发挥着重要功能,在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)㊁溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)㊁哈维氏弧菌(Vibrio har-veyi)㊁嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)等水生动物病原菌的致病过程中发挥着关键作用㊂然而,有关水生动物病原菌T6SS组分及其功能的报道还比较匮乏㊂本文对几种水生动物病原菌T6SS的生物学功能与调控机理,以及T6SS关键调控因子溶血素共调节蛋白Hcp的系统进化关系与功能等最新研究情况进行了综述,并在水生动物病原菌T6SS的生物学功能㊁T6SS活性调控与环境因素的关联性㊁T6SS与致病菌代谢之间的调控关系等方面提出未来研究建议,以期为进一步开展水生动物致病机制研究及水产养殖细菌病的防控提供新思路㊂关键词:Ⅵ型分泌系统;水生动物病原菌;溶血素共调节蛋白;系统进化树;功能位点中图分类号:S943㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀病原菌致病力与其携带的多种分泌系统密切相关,细菌可通过分泌系统将毒力蛋白或效应因子释放到外界环境中,或者直接作用于原核或真核生物,从而调控细菌与宿主的相互作用㊂在革兰氏阴性细菌中,分泌系统可分为两大类,分别为跨双层细胞膜分泌系统及单跨外膜分泌系统㊂其中有5种跨双层膜分泌系统类型已被鉴定,依次为T1SS㊁T2SS㊁T3SS㊁T4SS和T6SS(typeⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅵsecretion systems)及1种单跨外膜分泌系统T5SS(typeⅤsecretion system)[1]㊂Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)于2006年从非O1和非O139血清型的霍乱弧菌(Vibrio chol-erae)中被鉴定[2],至今依然是细菌分泌系统研究的热点㊂T6SS存在于约1/4的变形菌门细菌中,由15~20个核心组分构成[3]㊂T6SS具有多种生物学功能,包括介导细菌间的竞争㊁杀伤作用[4-5],以及调控毒力基因表达[6]㊁生物被膜形成与运动性[7]㊁胞外金属离子摄取[8]㊁鞭毛基因表达[9]和环境适应性[10]等㊂T6SS活性主要受群体感应系统[11]㊁磷酸化与去磷酸化修饰[12]及组蛋白样核结构蛋白[13]等胞内外信号因子调节㊂作为构成T6SS管状结构的核心蛋白,溶血素共调节蛋白(hemolysin coregulatory protein,Hcp)在效应因子分泌和T6SS装置组装的调控中发挥着关键作用㊂Hcp可为T6SS效应蛋白提供锚定位置,协助效应蛋白的折叠,同时也是一种可分泌到胞外的T6SS 特征性效应蛋白[14]㊂Hcp还作为分子伴侣协助效应因子的折叠,并结合㊁输送相对分子质量为10000~30000的效应蛋白进行转运[15]㊂尽管T6SS及Hcp功能在不同物种之间具有相似性,然而,目前有关T6SS作用及其调控机制方面的研究,仍主要集中在临床环境中分离的各种人类病原菌,对水生动物致病菌T6SS及其核心组分的功能研究和认识还相对不足㊂本文围绕水生动物病原菌㊀收稿日期:2023-04-24㊀基金项目:国家自然科学基金(U20A2065);广东省自然科学基金(2022A1515012203);广东省自然科学基金重大培育项目(2015A030308020)㊀作者简介:伍水龙(1985 ),男,博士研究生,助理研究员㊂E-mail:wslbeijing2008520@㊀通信作者:蔡佳(1982 ),男,博士,博士生导师,副教授㊂E-mail:caijia@简纪常(1964 ),男,博士,博士生导师,教授㊂E-mail:jianjc@(并列通信作者)T6SS的生物学功能及其调节机制㊁溶血素共调节蛋白Hcp系统进化关系及其生物学功能的最新研究进展进行了阐述,以期为了解水生动物致病菌T6SS的研究概况和水生动物病害防控提供科学参考㊂1㊀T6SS的结构与功能冷冻透射电子显微镜分析显示,T6SS是一个噬菌体样注射器结构的复合物,以倒置的形式镶嵌于双层细胞膜上㊂T6SS通常由13个核心蛋白成分组成,包括构成分泌系统的跨膜复合结构和噬菌体样的穿刺结构(图1)㊂1.1㊀T6SS的跨膜复合结构T6SS跨膜复合结构由TssL㊁TagL㊁TssJ和TssM4个膜蛋白形成㊂其中,TagL可穿过3个跨膜组分插入内膜,以类似于锚的结构将装置固定在细胞壁上;TssL是一种以钩状折叠的构象定位于细胞质的内膜蛋白;TagL与TssL可通过一个C端跨膜区域锚定在一起[16]㊂1.2㊀噬菌体样的穿刺结构T6SS基因簇可编码多种噬菌体样蛋白,如溶血素共调节蛋白Hcp(与噬菌体的gp19尾管蛋白同源),可形成内径约为4nm的六元环,长达100nm的管状结构是效应蛋白的转运通道[17];缬-甘氨酸重复蛋白G[valine-glycine repeat protein G (VgrG),与噬菌体的gp5和gp27顶端融合蛋白同源],位于Hcp管道末端,可形成三聚体的细胞穿刺结构,由Hcp管道推向靶细胞[18];TssB和TssC 蛋白(类似于噬菌体的gp18),包围在Hcp尾管结构的外侧,形成一个类似于噬菌体收缩鞘结构[19], TssB/TssC可持续地进行组装㊁拆卸和回收等周期性循环[20];TssE蛋白(与噬菌体gp25基板组件蛋白同源),形成类似于噬菌体基板结构,与噬菌体gp25的功能类似,可能参与Hcp管道和TssB/TssC 鞘结构的组装[21];脯氨酸(Proline)-丙氨酸(Alanine)-丙氨酸(Alanine)-精氨酸(Arginine) (PAAR)重复蛋白家族成员,位于VgrG顶端,形成一个顶端穿刺结构,PAAR与VgrG的相互作用可增加整个分泌装置的稳定性[22]㊂1.3㊀与结构相关的功能作用细菌T6SS跨膜复合结构与穿刺结构是决定其生物学功能的重要基础㊂跨膜复合结构是T6SS的平台基石,这些复合蛋白镶嵌在细菌双层细胞膜上,为T6SS功能发挥提供支撑作用㊂与功能较单一的跨膜复合结构不同,T6SS穿刺结构主要是为分泌系统提供能量和各种效应因子的分泌㊂研究发现,Hcp㊁VgrG和PAAR既是T6SS的结构性效应因子,也是其他效应分子经T6SS分泌至胞外的停泊位点[23]㊂其中,由Hcp形成的同源六聚体的管腔内侧存在不同的表位,可协同各种效应因子的输出,如肽聚糖水解酶Tse1㊁Tse3和RNA降解酶Tse2的分泌[24]㊂VgrG-PAAR复合物根据其功能可进一步分为VgrG-PAAR核心复合物和VgrG-PAAR 辅助复合物[25]㊂T6SS效应分子输出的另一重要途径,便是与VgrG-PAAR针尖复合物的表位结合,如溶菌酶样效应蛋白TseP㊁TseC和DNA降解酶Rhs的分泌[26-27]㊂最近研究发现,接受效应因子停泊的结构蛋白可能并不是彼此独立发挥功能的㊂通过晶体结构分析表明,Hcp-VgrG-PAAR以α和β螺旋㊁氢键等形式形成一个内径为0.28nm的传送系统,这样的结构更有利于细菌效应蛋白的快速输出[28]㊂Ⅰ 穿刺结构;Ⅱ 膜复合体;Ⅲ 收缩鞘结构㊂依照参考文献[23]绘制㊂Ⅰ puncturing device;Ⅱ membrane complex;Ⅲ contractile sheath.According to the literature[23].图1㊀T6SS与T4噬菌体结构示意图Fig.1㊀Diagram of T6SS and T4bacteriophage structures 2㊀常见水生动物病原菌T6SS的生物学功能2.1㊀副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)副溶血性弧菌是一种水生革兰氏阴性菌,在海洋和河口生态系统中普遍存在,可经海产品传播导致人类腹泻疾病,引起人类肠胃炎和伤口感染㊂首次大流行是由血清型O3:K6副溶血性弧菌引起的,此后,其他血清型引起的流行感染也越来越多地被报道[29-30]㊂基因组测序表明,副溶血性弧菌361第1期伍水龙,等:水生动物病原菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)及其溶血素共调节蛋白研究进展T6SS1和T6SS2分别位于1号和2号染色体[31],由毒力岛基因所编码[32]㊂副溶血弧菌T6SS1主要介导细菌在宿主细胞的黏附㊁定植和毒力产生[33],并通过分泌效应蛋白引发自噬反应从而诱导宿主发病,而T6SS2则介导细菌间的拮抗作用㊂[34-35]㊂副溶血弧菌主要产生两种与溶血和细胞毒性有关的毒力因子,即耐热性直接溶血素(TDH)和/或TDH 相关溶血素(TRH)[36],副溶血弧菌的进化分析显示,T6SS可能涉及以上两种毒力因子的产生过程[37]㊂2.2㊀嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)嗜水气单胞菌在温水环境中普遍存在,主要引发鱼类气单胞菌败血症(motile aeromonas septice-mia,MAS)[38]㊂研究发现,嗜水气单胞菌T6SS在不同区域来源的菌株中存在结构成分上的差异,如大多数来自美国的分离株不具有完整的T6SS,只编码了3个核心元件[tssD(Hcp)㊁tssH和tssI (VgrG)],而来自中国的分离株则具有完整的T6SS,但T6SS核心成分hcp1和vgrG1的敲除均可导致嗜水气单胞菌对斑点叉尾鮰(Ictalurus puncta-tus)幼鱼的毒力降低[39]㊂嗜水气单胞菌的毒力作用与VgrG在调节蛋白酶生成㊁菌活力及生物被膜形成方面有关[40]㊂效应蛋白-免疫因子的分泌是许多病原菌在发挥杀伤作用过程中为防止自身被误伤而采取的一种常见的T6SS分泌策略㊂研究表明,嗜水气单胞菌T6SS所分泌的一种磷脂酶Tle1AH,可促进生物被膜的形成,增强抗菌竞争能力及对斑马鱼的致病力;然而研究人员发现,在Tle1AH下游存在一种重要的同源免疫蛋白Tli1Tli2AH,可保护细菌自身免遭Tle1AH的攻击[41]㊂TseC-TsiC同样被证实是由T6SS所分泌并在嗜水气单胞菌的菌群竞争过程中发挥重要作用的效应蛋白-免疫因子对[42]㊂2.3㊀溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)溶藻弧菌广泛分布于海洋和河口环境中,是一种对海洋动物和人类均会构成潜在威胁的水生动物条件致病菌[43]㊂全基因组测序显示,溶藻弧菌可编码两套T6SS,即T6SS1和T6SS2㊂然而,目前有关T6SS1㊁T6SS2的功能作用未形成统一认识㊂鱼体竞争试验表明,溶藻弧菌EPGS株的两套T6SS均不参与宿主毒力作用,但T6SS2可介导细菌间的竞争和杀伤能力,而T6SS1则无此作用[44]㊂另有研究表明,溶藻弧菌Va T6SS1和Va T6SS2均可分泌MIXⅤ型(marker for type sIX effectors)抗细菌效应蛋白,这些效应蛋白被证实可在副溶血弧菌等海洋弧菌之间进行水平转移和交流,从而增强这些海洋弧菌与其他水生环境细菌的竞争作用[45]㊂2.4㊀哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐细菌,其基因组可编码3套T6SS(T6SS1㊁T6SS2㊁T6SS3)[46]㊂TssJ是哈维氏弧菌T6SS膜蛋白复合体成分之一,注射TssJ重组蛋白或DNA疫苗后的卵形鲳鲹(Trachinotus blochii)体内,碱性磷酸酶(AKP)㊁酸性磷酸酶(ACP)㊁溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著增强,同时白介素10 (IL10)㊁补体3(C3)㊁组织相容性复合体Iα与IIα(MHC Iα㊁MHC IIα)和免疫球蛋白M(IgM)的表达水平也明显上调,且在诱导鱼体产生血清抗体能力方面,TssJ重组蛋白免疫组要强于DNA疫苗免疫组[41]㊂此外,对T6SS主要效应因子rbsB㊁luxP㊁luxO㊁vgrG和vasC各敲除株的功能研究表明,哈维氏弧菌T6SS主要涉及细菌生物被膜形成㊁运动性及拮抗其他细菌的能力等[47]㊂2.5㊀迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)迟钝爱德华氏菌(部分菌株也被称为杀鱼爱德华氏菌)是一种在世界范围内广泛流行,可引起多种经济养殖鱼类系统性出血性败血症和烂身等疾病的病原菌[48]㊂T6SS效应蛋白EvpP可介导迟钝爱德华氏菌侵袭宿主细胞[49]㊂EvpP通过与Hcp 相互结合进行转运,是迟钝爱德华氏菌侵袭鱼类和产生毒力的重要致病因子[50-51]㊂细胞水平研究显示,EvpP致病机制可能与其抑制Ca2+依赖的Jnk 途径及阻断NLRP3炎症小体的激活有关,这为细菌在胞内定植创造了有利条件[52-53]㊂而体内研究也证实,EvpP可降低斑马鱼Jnk信号通路的磷酸化水平,从而下调趋化因子Cxcl8a㊁基质金属肽酶Mmp13及炎症因子IL-1β的表达水平,并抑制中性粒细胞向感染部位的募集作用[54]㊂2.6㊀变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)变形假单胞菌是一种温度依赖的条件性致病菌,低温时可引起大黄花鱼(Larimichthys crocea)内脏白色结节病[55]㊂变形假单胞菌基因组编码3套Ⅵ型分泌系统(T6SS1㊁T6SS2㊁T6SS3)㊂其中,T6SS1是主要毒力因子之一,T6SS2和T6SS3直接或间接参与致病性㊂T6SS1突变体在鱼脾脏中461大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷3d内消失,而其他菌株持续增加,说明T6SS1主要调节体内细菌复制[56]㊂ClpV是变形假单胞菌T6SS分泌的一种ATP酶㊂斜带石斑鱼(Epinephe-lus coiodes)被clpV-RNAi菌株感染20d内未观察到死亡;斜带石斑鱼脾脏㊁肾脏和肝脏在感染后5~8d内均未出现明显结节,肿胀逐渐消失;与对照组相比,斜带石斑鱼的脾脏和血液在感染后的大部分时间点clpV-RNAi菌株的丰度均明显减少,头肾和躯干肾脏中clpV-RNAi菌株的丰度也从感染后72h急剧下降[57]㊂由此可见,T6SS在变形假单胞菌的致病过程中发挥了重要的调控作用㊂3㊀T6SS生物学功能的调节机制3.1㊀群体感应群体感应系统(quorum sensing system,QS)涉及细菌许多分泌系统和毒力相关因子的调控过程[58]㊂QS可调控T6SS的合成与分泌,从而影响其致病作用㊂副溶血弧菌OpaR和AphA是QS的核心调控因子,分别在菌体高密度和低密度时高表达㊂当细胞密度较低时,调控因子LuxO被激活,从而抑制OpaR活性并促进AphA的表达;在较高的细胞密度下,LuxO的活性受到限制,导致AphA 活性的抑制和OpaR的激活[59];OpaR能抑制T6SS 管状结构蛋白Hcp1的表达从而负调节T6SS1的活性,同时正调节T6SS2的活性[60]㊂作为副溶血弧菌膜结合的毒力调节蛋白ToxR与AphA㊁OpaR共同作用抑制T6SS1活性,而toxR基因的表达又与QS密切相关[61]㊂PpkA2激酶对底物的磷酸化介导了T6SS2和QS之间的相互作用,从而调控溶藻弧菌EPGS T6SS2的杀菌能力[44]㊂溶藻弧菌磷酸酶PppA由T6SS基因簇所编码,全基因转录组分析揭示了PppA存在多种调控靶点,包括T6SS底物溶血素共调节蛋白(Hcp)㊁群体感应调节因子LuxR㊁外毒素碱性丝氨酸蛋白酶(Asp)㊁鞭毛蛋白及多糖生物合成与转运蛋白,因此,PppA磷酸化作用是连接T6SS㊁c-di-GMP产生及群体感应的桥梁[62]㊂群体感应还可通过调节特定的sigma(σ)依赖性激活因子的表达从而调节T6SS的功能㊂如RpoE是一种选择性σ因子和环境适应调节因子,其受群体感应系统调节并影响变形假单胞菌T6SS 的表达[63]㊂嗜水气单胞菌T6SS的功能也严格受到σ54转录激活因子VasH的调控[64]㊂3.2㊀双组分调控和磷酸化/去磷酸化修饰双组分调控和磷酸化/去磷酸化修饰是细菌响应胞内外信号的重要调节机制[65]㊂研究表明,迟钝爱德华氏菌T6SS所分泌的效应蛋白EvpP受到双组分系统EsrA-EsrB的正调控及组蛋白样核结构蛋白(H-NS)的负调控[66]㊂假单胞菌T6SS的组装和去组装过程分别受到丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(STP)通过Fha 的磷酸化和去磷酸化作用所调控㊂正常生理条件下,PppA使铜绿假单胞菌Fha1磷酸化维持在较低水平,当PpkA感知到未知的环境信号时,该激酶会抑制PppA活性,Fha就会被磷酸化从而启动信号级联反应,进而激活T6SS的组装并发挥功能[67]㊂因此,PpkA/PppA/Fha1信号轴是翻译后磷酸化修饰水平调节T6SS活性的重要途径[68]㊂3.3㊀温度及盐度大部分海洋性病原菌T6SS活性均不同程度地受到环境温度的调节㊂在温暖的夏季,海洋细菌群体不断增加,副溶血弧菌利用活跃的T6SS1可以对抗其他不同种属海洋细菌和自身同种细菌,以利于在环境中生存[69]㊂溶藻弧菌T6SS活性受到盐度和温度的双重调控㊂其中,T6SS1在LB平板培养条件下,低盐度有利于其表达;而在MLB高盐培养条件下可激活T6SS2㊂溶藻弧菌T6SS对培养温度的敏感性也存在差异,其中在30ħ培养条件下,有利于T6SS1和T6SS2的表达,而在37ħ培养条件下,唯有T6SS2可保持活性[45]㊂变形假单胞菌各Hcp的分泌也受温度的调节,如Hcp1在12~ 28ħ时分泌,Hcp2在12~35ħ时分泌,而Hcp3在体外无分泌[56]㊂另外一项研究发现,变形假单胞菌的致病力在20ħ培养条件下强于30ħ,且在低温时Hcp的mRNA水平也高于高温培养时的mRNA水平㊂[70]㊂因此,低温条件有利于促进变形假单胞菌T6SS的表达从而增强其毒力[71]㊂4㊀水生动物病原菌溶血素共调节蛋白Hcp进化关系及其生物学功能4.1㊀Hcp进化关系及其功能位点Hcp在T6SS功能发挥过程中起着重要作用,分析各水生动物致病菌Hcp的亲缘关系及其功能位点是了解其生物学作用的前提㊂本文通过Mega 5软件对水生动物病原菌基因hcp系统进化树进行分析,发现其具有以下两个特点:一是,除嗜水气单胞菌3个hcp亚型之间的进化关系较密切(爱德华氏菌除外,因其hcp亚型只有一个)外,其余各561第1期伍水龙,等:水生动物病原菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)及其溶血素共调节蛋白研究进展弧菌属病原菌hcp 亚型在亲缘关系上较疏远;二是,爱德华氏菌与变形假单胞菌两者的hcp 亲缘关系较接近(图2)㊂根据氨基酸序列,采用Softber-ry 软件预测了不同水生动物病原菌Hcp 蛋白的功能位点(图3),结果显示,病原菌Hcp 蛋白功能位点有蛋白激酶C 磷酸化位点㊁酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点㊁酪氨酸激酶磷酸化位点㊁N-豆蔻酰化位点㊁异戊烯基结合位点㊁微生物羧基端定位信号位点㊁N-糖基化位点㊁cAMP-和cGMP-蛋白激酶磷酸化位点及ATP /GTP 结合位点的基序A (P-环)等9种,其中,微生物羧基端定位信号位点是所有Hcp 蛋白共同具有的功能位点㊂除了嗜水气单胞菌NJ-35和爱德华氏菌EIB202的3个Hcp 亚型具有相同的功能位点外,其他病原菌各Hcp 亚型之间功能位点均不同㊂从进化关系及其具有的蛋白功能位点方面进行比较,Hcp 蛋白在溶藻弧菌与副溶血弧菌之间具有较高的同源性和相似性㊂尽管如此,这些位点对Hcp 生物学功能的影响及其在T6SS 致病过程中的作用机制鲜有报道㊂㊀最大似然法,自展值=1000㊂㊀Bootstrap value is 1000by maximum composite likelihood method.图2㊀水生动物病原菌溶血素共调节蛋白编码基因hcp的系统进化分析Fig.2㊀Phylogenetic tree analysis of hcp genes encodinghemolysin co-regulatory protein of aquatic ani-mal pathogenic bacteria4.2㊀Hcp 生物学作用作为最早被确认的T6SS 核心组分,Hcp 最初的功能被定义为构成T6SS 管道分泌装置的必需结构蛋白[72]㊂随后研究发现,Hcp 还充当效应蛋白或(和)分子伴侣的角色㊂目前研究显示,水生动物致病菌Hcp 具有调节细菌的生物被膜形成㊁黏附㊁运动性㊁免疫逃逸和胞内存活等多种生物学功能㊂嗜水气单胞菌中国流行株NJ-35基因组可编码3个Hcp,其中,Hcp1是T6SS 组装的必要条件,在细菌竞争中起主导作用;Hcp2对生物被膜的形成和细菌黏附具有负向调节作用,也涉及对斑马鱼毒力和面对四膜虫(Tetrahymena )捕食过程中存活能力的调控作用;而Hcp3则对生物被膜的形成和细菌黏附有正向调节作用[73]㊂这些结果表明,嗜水气单胞菌NJ-353个Hcp 蛋白参与了该菌环境适应性和毒力调控的不同过程㊂位于嗜水气单胞菌SSU 株T6SS 基因簇内的Hcp2是T6SS 装置的结构蛋白,而位于染色体远端位置的Hcp1则更多发挥着效应蛋白的作用;小鼠感染模型显示,只有Hcp1负调控细菌的运动性和蛋白酶的产生,而Hcp1㊁Hcp2蛋白均是嗜水气单胞菌扩散到外周器官所依赖的毒力因子[40]㊂这种Hcp 功能的非冗余性同样体现在爱德华氏菌㊂爱德华氏菌是一种可引起斑点叉尾鮰肠败血症(Enteric septicemia of cat-fish,ESC)的革兰氏阴性兼性细胞内病原体;Hcp1或Hcp1/Hcp2缺失后,爱德华氏菌对斑点叉尾鮰的毒力作用明显减弱;进一步的体内外试验表明,Hcp1主要参与该菌在斑点叉尾鮰体内的致病作用,而Hcp2与该菌在斑点叉尾鮰巨噬细胞与上皮细胞的黏附和存活作用有关[74]㊂此外,针对Hcp 所构建的重组疫苗也显示出了对特定病原菌感染的预防作用㊂如接种嗜水气单胞菌Hcp 重组蛋白的鲤(Cyprinus carpio )被细菌感染后,存活率显著提高(46.67%),免疫鱼血清中IgM 抗体水平显著升高,肾㊁脾和鳃中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子水平也显著升高[75],因此,Hcp 重组蛋白有望成为抗病原菌感染的候选疫苗㊂5㊀存在问题及展望近年来,通过采用冷冻电镜技术㊁基因敲除及免疫沉淀等分子生物学方法,人们对T6SS 结构和功能的研究逐渐深入㊂然而,当前大部分研究结论均来自临床分离菌株,对水生动物致病菌T6SS 及其核心组分的研究相对薄弱,主要体现在对T6SS 及其核心组分引起水产养殖动物致病机制研究的匮乏,以及不同致病菌间T6SS 研究的不充分,具体存在问题及未来研究方向建议如下㊂5.1㊀水生动物致病菌T6SS 研究存在的问题1)致病机制研究不够深入㊂目前,T6SS 及其核心组分在霍乱弧菌㊁大肠杆菌及绿脓假单胞菌等引起人类致病的机制研究中较为多见,但这些组分在水生动物致病菌中的作用是否存在并不清楚㊂有关水产养殖领域较常见病原菌T6SS 的功能机制研661大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷图3㊀水生动物病原菌溶血素共调节蛋白(Hcp )功能位点比较Fig.3㊀Protein functional site comparison of hemolysin co-regulatory protein (Hcp )from aquatic animal pathogenic bacteria761第1期伍水龙,等:水生动物病原菌Ⅵ型分泌系统(T6SS )及其溶血素共调节蛋白研究进展究还处于起步阶段㊂2)不同致病菌T6SS的研究不够充分㊂目前,水生动物致病菌T6SS研究主要集中在嗜水气单胞菌,而对副溶血弧菌㊁哈维氏弧菌和溶藻弧菌等水生动物致病菌的研究报道较少㊂此外,一些已被报道的T6SS功能还存在一些争议,如溶藻弧菌T6SS 的杀菌和杀真核生物功能等,故需要更多的试验数据支持㊂5.2㊀未来研究方向针对以上问题和不足,今后工作可从以下几方面展开㊂1)深入挖掘和全面了解水生动物病原菌T6SS 的生物学功能㊂利用现代分子生物学技术构建体内外感染模型,重点研究其对水产养殖动物的致病机制,包括黏附力㊁侵袭力㊁胞内存活㊁毒力因子分泌和免疫逃逸等,以期寻找出不同水生动物病原菌T6SS保守的分子机制㊂2)加强对T6SS及其组分活性调控与环境因素的关联性研究㊂水生动物病原菌T6SS及其组分的表达受到温度和盐度的调节,探索致病菌T6SS 受温度和盐度调节的信号分子及其响应机制,对新型防控策略的制定具有重要现实意义㊂3)拓展T6SS及其组分与致病菌代谢之间的调控关系研究㊂细菌的致病力与其代谢息息相关, T6SS除具有分泌效应蛋白功能外,还涉及胞外营养摄取,由此推测,T6SS可能参与细菌的代谢过程㊂而本课题组前期转录组学和蛋白质组学研究显示,溶藻弧菌T6SS与其碳氮代谢和内毒素产生存在关联㊂然而,具体调控机制有待进一步探究㊂综上所述,探索水生动物病原菌T6SS及其核心组分Hcp在不同种属之间的保守性和功能机制,重点围绕水生动物病原菌毒力调节的环境驱动机制㊁细菌代谢与致病力之间的调控等方面开展研究,可为药物开发和疫苗研制提供新的靶点,同时也可为更好地开展鱼类细菌性疫病防控工作提供理论支撑㊂参考文献:[1]㊀COSTA T R D,FELISBERTO-RODRIGUES C,MEIR A,et al.Se-cretion systems in Gram-negative bacteria:structural and mechanis-tic insights[J].Nature Reviews Microbiology,2015,13(6):343-359.[2]㊀PUKATZKI S,MA A T,STURTEVANT D,et al.Identification of aconserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system[J].Proceedings of the Nation-al Academy of Sciences of the United States of America,2006,103(5):1528-1533.[3]㊀ZHANG J,GUAN J,WANG M,et al.SecReT6update:a compre-hensive resource of bacterial TypeⅥSecretion Systems[J].Sci-ence China Life Sciences,2023,66(3):626-634.[4]㊀JANA B,SALOMON D.TypeⅥsecretion system:a modular tool-kit for bacterial dominance[J].Future Microbiology,2019,14: 1451-1463.[5]㊀ROBITAILLE S,TRUS E,ROSS B D.Bacterial defense against thetypeⅥsecretion system[J].Trends in Microbiology,2021,29(3):187-190.[6]㊀FERIA J M,VALVANO M A.An overview of anti-eukaryotic T6SSeffectors[J].Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2020,10:584751.[7]㊀LI Y Q,CHEN L,ZHANG P S,et al.ClpV3of the H3-typeⅥse-cretion system(H3-T6SS)affects multiple virulence factors in Pseudomonas aeruginosa[J].Frontiers in Microbiology,2020,11: 1096.[8]㊀刘琬洋,权国梅,刘家奇,等.革兰氏阴性菌Ⅵ型分泌系统及其参与金属离子转运的研究进展[J].微生物学报,2021,61(11):3377-3390.㊀㊀㊀LIU W Y,QUAN G M,LIU J Q,et al.Advances of the Gram-neg-ative bacterial typeⅥsecretion system and its function for metal ion acquisition[J].Acta Microbiologica Sinica,2021,61(11): 3377-3390.(in Chinese)[9]㊀BOUTEILLER M,GALLIQUE M,BOURIGAULT Y,et al.Crosstalkbetween the typeⅥsecretion system and the expression of class IV flagellar genes in the Pseudomonas fluorescens MFE01strain[J].Microorganisms,2020,8(5):622.[10]㊀YU K W,XUE P,FU Y,et al.T6SS mediated stress responses forbacterial environmental survival and host adaptation[J].Interna-tional Journal of Molecular Sciences,2021,22(2):478. [11]㊀PENA R T,BLASCO L,AMBROA A,et al.Relationship betweenquorum sensing and secretion systems[J].Frontiers in Microbiol-ogy,2019,10:1100.[12]㊀ZIVERI J,CHHUON C,JAMET A,et al.Critical role of a sheathphosphorylation site on the assembly and function of an atypicaltypeⅥsecretion system[J].Molecular&Cellular Proteomics:MCP,2019,18(12):2418-2432.[13]㊀CUI S L,XIAO J F,WANG Q Y,et al.H-NS binding to evpB andevpC and repressing T6SS expression in fish pathogen Edwardsiel-la piscicida[J].Archives of Microbiology,2016,198(7):653-661.[14]㊀GALÁN J E,WAKSMAN G.Protein-injection machines in bacte-ria[J].Cell,2018,172(6):1306-1318.[15]㊀HOWARD S A,FURNISS R C D,BONINI D,et al.The breadthand molecular basis of Hcp-driven typeⅥsecretion system effec-tor delivery[J].mBio,2021,12(3):e0026221. [16]㊀STIETZ M S,LIANG X Y,LI H,et al.TssA-TssM-TagA interac-tion modulates typeⅥsecretion system sheath-tube assembly inVibrio cholerae[J].Nature Communications,2020,11:5065.[17]㊀NOREEN Z,JOBICHEN C,ABBASI R,et al.Structural basis forthe pathogenesis of Campylobacter jejuni Hcp1,a structural and861大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷。

鱼类非特异性细胞毒性细胞(NCC)的研究进展

关键词：非特异性细胞毒性细胞；分离鉴定；ＣＮＣ受体
中图分类号：９￥７文献标识码：Ａ文章编号：０５８３一２１）２０７ — ７１０ — ７７（０００— ３４０
硬骨鱼类具有多种细胞毒性细胞，们能够它识别和破坏病毒感染的变异细胞。细胞毒性细胞
如胸腺、肾脏和脾脏，以及腹腔和血液中。肾、腔腹中ＮＣ最多，Ｃ血液中较少，且血液中的ＮＣ活性最Ｃ
的功能和哺乳动物的相似，括嗜中性粒细胞、包巨噬细胞、胞毒性Ｔ淋巴细胞（Ｔ和自然杀伤细ＣＬ）
尾鲴（ｔｌｒｓｕｃｔｓ、罗罗非鱼（ｒｃＦＩｉＩａｕｕｎｔｕ）尼ｃｐａＯｅｈＯ￣ｏＴｓ
低。ＮＣ是最小的白细胞，多形性，有裂口和Ｃ呈核相对少的细胞质，面有微绒毛，表通过长的胞膜纤维吸附于靶细胞上。ＮＣ的杀菌作用是自发的，Ｃ不需要任何诱导。其溶解靶细胞的敏感性与靶细胞的激
具有重要作用，即通过细胞与细胞的接触，非特异性地杀死各种靶细胞，包括同种异源和异种异源肿瘤细胞、病毒感染的细胞和寄生性原生动物。本文对
硬骨鱼类ＮＣ的分离鉴定方法和功能等方面作一综Ｃ述，旨在为深人研究鱼类非特异免疫机理提供参考。
即起作用，２～８在ｈ内，毒性作用达到最强。Ｎ寄生性原生动物等入侵的第一道防线，非特异性免疫中起重要作用，在还具有体外杀伤肿瘤细胞

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2007年在教育部本科教学工作水平评估中获得优秀。

学校的前身是成立于1935年的广东省立高级水产职业学校，她是广东现代海洋水产教育的发端，至今已有74年的办学历史，培养了10万多名应用型高级专门人才，成为促进广东经济社会发展和南海资源开发利用的重要力量。

学校分三个校区(不含寸金学院校区)：主校区、霞山校区、海滨校区。

草鱼出血病分子流行病学及GCRV多样性研究

草鱼出血病分子流行病学及GCRV多样性研究黄毅昌;雷燕;杨玉滔;闫秀英;简纪常;吴灶和【摘要】[目的]分析不同基因型GCRV分离株与患草鱼出血病草鱼症状的相关性.[方法]采用RT-PCR检测患病草鱼,应用生物信息学方法分析基因型内和基因型间不同分离株间的差异.[结果]对近3年来草鱼出血病分子流行病学分析发现,患草鱼出血病病鱼多为“肠炎型”症状,且检测发现其病原多属于GCRV基因型Ⅲ型.对GCRV的多样性分析表明,不同分离株同源蛋白的同源率高达93％以上,却被给予完全不同的名称,给GCRV多样性研究带来一定的困难;同一基因型不同分离株同源蛋白间的变异位点较少,且功能位点发生变异的更少;不同基因型不同分离株同源蛋白间的保守位点较少,且这些保守位点中只有极少数位点为功能位点;不同基因型分离株同源结构蛋白间存在较大的差异,且同源非结构蛋白间的差异更为显著.[结论]草鱼出血病不同临床症状可能与其病原基因型不同有关.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2016(000)011【总页数】7页(P120-125,153)【关键词】草鱼呼肠孤病毒;草鱼出血病;分子流行病学;多样性【作者】黄毅昌;雷燕;杨玉滔;闫秀英;简纪常;吴灶和【作者单位】广东海洋大学水产学院,广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室,广东湛江524088;广州利洋水产科技股份有限公司,广东广州510515;广东海洋大学水产学院,广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院,广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院,广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院,广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室,广东湛江524088【正文语种】中文【中图分类】S941草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖的主要经济鱼类之一，但草鱼出血病给草鱼养殖业造成了严重的经济损失[1]。

ABC转运蛋白结构及其在细菌致病性中的研究进展

ABC转运蛋白结构及其在细菌致病性中的研究进展
陈福暖;黄瑜;蔡佳;王忠良;简纪常;王蓓
【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2022(38)6
【摘要】ABC转运蛋白,即腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter)是具有多种功能且分布极为广泛的膜蛋白质家族。

它的主要功能是利用ATP水解产生的能量来实现对底物的跨膜转运,ABC超家族蛋白转运体普遍存在于细菌、真菌,线虫,果蝇、植物、哺乳动物等几乎所有生物体内。

大多数ABC 转运蛋白最初是通过研究真核生物体耐药性(多效耐药和多药耐药)而被发现的。

目前针对ABC转运蛋白在细菌致病性中所发挥作用也有广泛的研究。

本文综述了ABC 转运蛋白的结构、转运机制和ABC转运蛋白在细菌致病性过程中的作用,讨论了深入研究ABC转运蛋白作用机制对细菌性疾病防治的意义及存在问题。

ABC转运蛋白相关的细胞表面或分泌因子很可能是抗菌疗法或疫苗开发的作用靶点,为细菌性疾病的预防提供了新的思路。

【总页数】10页(P43-52)
【作者】陈福暖;黄瑜;蔡佳;王忠良;简纪常;王蓓
【作者单位】广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】G63
【相关文献】
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5.ABC转运蛋白的结构与转运机制
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红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化

第30卷第6期广东海洋大学学报 V ol.30 No.62010年12月 Journal of Guangdong Ocean University Dec. 2010收稿日期：2010-06-13基金项目：国家自然科学基金“红笛鲷仔鱼抗菌免疫基因的克隆及表达时序研究”（40906073）第一作者：魏世娜（1985－），女，硕士研究生，主要从事水产动物病害防治。

Email : weishinazi@ 通讯作者：简纪常，教授，主要从事水产动物免疫学及病害控制。

Email : jianjc@红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化魏世娜，王蓓，鲁义善，吴灶和，简纪常（广东海洋大学水产学院，广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省高等学校水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江 524025）摘要：通过克隆编码红笛鲷（Lutjanus sanguineus ）非特异性毒性细胞受体蛋白-1（nonspecific cytotoxic cell receptor protein-1, NCCRP-1）成熟肽基因序列，然后与载体连接构建pET21a-NCCRP 融合蛋白表达载体，将其转入大肠杆菌BL21进行诱导表达并优化条件。

SDS-PAGE 分析表明，在异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG ）浓度0.8 mmol/L 、37 ℃条件下培养3 h 后表达量最大，分子大小与预期值相符，融合蛋白主要以包涵体形式高效表达，通过HisTrap HP 柱子使其得到进一步纯化；Western blot 分析表明，该融合蛋白可与鼠抗His-tag 单克隆抗体发生特异性结合，说明获得该表达产物。

关键词：红笛鲷；NCCRP -1基因；原核表达；条件优化；纯化中图分类号：S942.1 + Q344+.13 文献标志码：A 文章编号：1673-9159（2010）06-0025-06Purification and Optimization of Prokaryotic Expression of CrimsonSnapper (Lutjanus sanguineus ) NCCRP-1 GeneWEI Shi-na, WANG Bei, LU Yi-shan, WU Zao-he, JIAN Ji-chang(Fisheries College of Guangdong Ocean University , Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals & Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions ,Zhanjiang 524025, China )Abstract ：The cloned mature peptide of Lutjanus sanguineus NCCRP-1 was connected with the expression vector pET-21a to construct fusion protein pET21a-NCCRP. This recombinant was transformed into Es cherichia coli BL21 and mainly expressed in the form of inclusion body. The optimal condition for the expression of this protein was that the cells were induced at 37 ℃, in 0.8 mmol/L of IPTG for 3 hours. The molecular weight of the expressed product was identical to that of expected protein by SDS-PAGE analysis, then purified by HisTrap HP column. The result of Western blot show that the expressed product could be combined with mouse anti-His-tag Mab. The fusion protein which lays the basic could be obtained for the future research on function and applied in fish innate immunity. Key words: Lutjanus sanguineus ；NCCRP-1 gene; conditions optimization; purification红笛鲷（Lutjanus sanguineus ）又名红鱼，隶属鲈形目、笛鲷科、笛鲷属，是我国南方沿海的重要经济鱼类之一。

鱼类致病杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)特异性PCR检测方法的建立

鱼类致病杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)特异性PCR检测方法的建立夏洪丽;鲁义善;汤菊芬;蔡佳;汪美;夏立群【摘要】鱼类诺卡氏菌病是全球性的鱼病,杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)是引起鱼类诺卡氏菌病的主要病原之一.根据杀鲑诺卡氏菌16S-23S转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立特异性PCR检测杀鲑诺卡氏菌的方法.结果表明,筛选的PCR引物可特异性地扩增出杀鲑诺卡氏菌的ITS片段,检测灵敏度(DNA浓度)为28.3 pg·μL-1.检测人工感染杀鲑诺卡氏菌的鱼组织,结果显示,该方法可从未分离到病原菌的病鱼组织中检出阳性片段,较传统细菌分离鉴定方法更为高效灵敏.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2014(034)004【总页数】6页(P56-61)【关键词】杀鲑诺卡氏菌;转录间隔区;聚合酶链式反应;检测【作者】夏洪丽;鲁义善;汤菊芬;蔡佳;汪美;夏立群【作者单位】广东海洋大学水产学院;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院;广东海洋大学水产学院;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088【正文语种】中文【中图分类】S941.42诺卡氏菌病（nocardiosis）是全球性的鱼病，对于水产养殖和水产品安全有较大影响。

优秀研究生导师事迹

优秀研究生导师事迹作为我校省级重点学科水产养殖学学科的学术带头人和学校庞大的科研团队的领军人物，吴灶和的一言一行，都牵系着他对科研事业的热情，透露出他对学校科研事业的希冀与期待。

态度决定高度，这句话用在吴灶和身上至为恰切。

一、执著追求一心致力学问1953年，吴灶和出生于一个农民家庭。

高中毕业后，他唯一的愿望是读大学，但由于当时社会环境限制，这个梦想久久未能实现。

念完两年师范后，吴灶和于1976年走进一所中学教书育人。

1977年冬天，中国恢复了停滞10年的高考。

虽然那时吴灶和已经25岁，有了一份固定的工作，但他还是毅然选择了参加高考，他的人生轨迹也因此发生了改变———从一位中学老师变成了我校前身湛江水产学院恢复高考后的第一届大学生。

“往者不可谏，来者犹可追。

”从农村出来的吴灶和，心里始终铭记着，他整整迟了8年才读上大学，深造的机会来之不易，他要努力学习把失去的8年光阴追回来。

吴灶和认为，如果毕业以后回顾四年的生活，曾经奋斗过，努力过，对得起自己，对得起父母，对得起社会，才算是成功地读过了大学。

这种自觉的态度，帮助他克服了学习上的诸多困难。

回忆当年，吴灶和很自豪。

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因为只在1965年即读初中时学过一年英语，在大学入学的英语模拟考试中，他连26个英语字母大小写都写不全，但到了二年级时，他的英语成绩已经名列前茅。

不仅如此，他还自修了日语，成绩在学校里也是数一数二的。

同时，吴灶和也并非“一心只读圣贤书，两耳不闻窗外事”，大学期间，他不仅在班上当副班长，还担任了养殖系学生会的第一任主席。

也许正因为成长环境和生活阅历的差异，吴灶和显得比别人更有韧性。

本科毕业时，29岁的吴灶和成了学校唯一一个考上研究生的人，得以进入中科院水生生物研究所深造。

39岁的时候，他依然不愿停止向学的脚步，决定攻读博士。

42岁博士毕业后，吴灶和一直在中科院南海研究所从事科研工作。

2000年，为了母校在水产研究方面能获得更大发展，吴灶和再次做出了改变人生轨迹的重要决定，他毅然离开了广州的家人来到湛江。

学科专业布局优化后生物科学专业建设管理创新与实践

［收稿时间］2020-07-20［基金项目］广东海洋大学2018年度教改项目“学科专业布局优化后生物科学专业建设的管理创新与实践”（XJG201869）;广东省研究生示范课程建设项目“海洋微生物学”（2018SFKC23）。

［作者简介］丁燏（1971-），男，湖北监利人，博士，教授，博士生导师，研究方向：海洋微生物学与水产病害防治。

［摘要］广东海洋大学设置了具有海洋水产特色的生物科学专业，项目组在原有相关专业建设的基础上，立足于学科专业调整的大背景，对生物科学专业建设的管理进行了大胆的创新与实践：建立与完善专业负责人（专业首席教师）负责制及其管理制度；以学校完全学分制改革为契机，深入优化培养方案，建立培养方案制订与修订、课程教学大纲制订与修订的管理制度；加强青年教师的引进与培养，完善本科生导师制，加强其过程管理与考核；完善专业负责人指导下的课程组组长负责制及其管理制度，加强课程建设与教材建设。

项目建设对生物科学专业的建设与快速发展具有重要意义，也为生物类相近专业建设提供了参考。

［关键词］生物科学专业；专业建设；高校管理；学科专业布局［中图分类号］G640［文献标识码］A ［文章编号］2095-3437（2021）12-0011-03University Education一、项目建设背景广东海洋大学“关于印发《广东海洋大学调整学院设置和优化学科专业布局总体方案》的通知”（广海大党〔2016〕47号）要求,按照学科专业内涵相关性和纵向支撑依托横向融合协同的原则设置学院与布局学科专业，构建“3+1+N ”大海洋学科体系，重点发展海洋科学、水产、食品科学与工程三大涉海学科，进一步强化海洋水产特色，对学院设置与学科专业布局进行了较大范围的科学调整。

广东海洋大学开办并重点发展具有海洋水产特色的生物科学专业，不但可以充分利用大南海资源，更是为南海经济发展提供理论支持和人才储备。

但是作为新专业（2016年成立），其建设与发展和兄弟院校尚存在较大的差距，特别是在各类管理制度、培养方案、师资队伍、课程与教材建设等方面尚需深入改革，以凸显专业特色。

溶藻弧菌肽聚糖对凡纳滨对虾白斑综合征病毒的抑制作用

溶藻弧菌肽聚糖对凡纳滨对虾白斑综合征病毒的抑制作用朱卫卫;邱德全;甘桢;鲁义善;简纪常【摘要】White Spot Syndrome Virus (WSSV) was extracted fromLitopenaeus vannameisuffering from White Spot Syndrom, and WSSV toxicity wasconfirmed by PCR. The virus crude extract was diluted 10-2, 10-3, 10-4 and 10-5 times, respectively, and the best attack dose of 10-4 fold dilution was ascertained after challenge with WSSV. Peptidoglycan at the concentration of 0.05, 0.10 and 0.15 mg/mL was injected intoL. vannamei, respectively. 24 hours later, WSSV were injected into shrimps, and the immune protection rate and the immunological indexes in hepatopancreas were measured to investigate the influence ofVibrio alginolyticus peptidoglycan in shrimps against WSSV. The results showed that the immune protection rate increased with the increase of peptidoglycan concentration, and they reached 36.67%, 46.67% and 56.67%, respectively, compared with the control group. The activities of acid phosphatase (ACP), alkaline phosphatase (AKP), superoxide dismutase (SOD) andnitrogen monoxide synthetic enzyme (NOS) in hepatopancreas had statistical differences from the control (P<0.05). TheV. alginolyticus peptidoglycan could effectively enhance theL. vannamei non-specific immunity and promise approaches to protect the shrimp from WSSV infection.%从患病凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）体内提取白斑综合征病毒（WSSV），PCR证实WSSV毒性，将病毒粗提液稀释10-2、10-3、10-4和10-5倍，攻毒实验表明，最佳攻毒剂量为10-4倍稀释液。

中草药与抗生素联用对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑菌作用

中草药与抗生素联用对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑菌作用李焯新;蔡小辉;黄瑜;王蓓【摘要】Theantibacterial activitiesof16 kinds of Chinese herbal medicine and 19 kinds of antibiotics were measured byjoan-board diffusion method, and the fractional inhibitory concentrations (FIC index) ofS. agalactiaefrom the combinations of3 herbal extracts and3antibiotics were determined by constant checkerboard test, andthe antibacterial activities of thecombination of Chinese herbs with antibiotics againstStreptococcus agalactiae isolated from tilapia, Oreochromis niloticus, were studied. The results showed that these16 kinds of herbal medicines and19 kinds of antibiotics presented good antibacterial effects onS. agalactiae, among them,and bothGalla chinensis andCoptis chinensiswater extract had the strong est effects of bacteriostasisin vitro, whose MIC were both3.9μg/mL, followed by Isatis tinctoriawith MIC250μg/mL. Cefazolin andCephalexinhad the strongest effects of bacteriostasisin vitro withMIC 0.125μg/mL, and followed byCarbenicillin (MIC 0.5μg/mL).&nb sp;Combination ofCoptis chinensis with Ceftriaxone, Cefazolin and Carbenicillin had a promoted antibacterialsynergy andadditive, and combination of,Galla chinensis with Carbenicillin showed antagonism,Radix Isatidis with three kinds of antibiotics showednon-correlation.%采用琼脂扩散法测定16味中草药水提物和19种抗生素的抑菌活性，筛选出抑菌作用较佳的3味中草药水提物和3种抗生素并测定其最小抑菌浓度（MIC），用常量棋盘稀释法测定3味中草药水提物和3种抗生素联用对罗非鱼无乳链球菌的微量抑制浓度指数（FIC index），研究中草药与抗生素联用对罗非鱼源无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的体外抑菌效果。

融合蛋白IL6-OmpW的质粒构建及表达纯化

融合蛋白IL6-OmpW的质粒构建及表达纯化黄浦江;黄郁葱;简纪常;吴灶和;鲁义善;黄瑜;樊云霞【摘要】以重组质粒pMD18-T/IL6和pMD18-T/OmpW为模板，分别扩增红笛鲷IL-6基因和哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW 基因，运用 PCR 重叠延伸剪切技术，将 IL-6和 OmpW 基因融合，将融合基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白高效表达，融合蛋白分子质量约为66.6 ku。

优化后表达条件为温度37℃，IPTG 浓度0.2 mmol · L-1，诱导时间5 h。

用HisTrap™ HP 亲和柱纯化重组蛋白，最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol · L-1，纯化蛋白的质量浓度为480µg · mL-1。

Western-blot分析显示，该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异反应，表明目的蛋白得以正确表达。

%The fusion gene IL6-(Gly4Ser)3-OmpW was constructed with the DNA fragments of the red snapper IL-6 gene and Vibrio harveyi outer membrane protein OmpW gene which from recombinant plasmid pMD18-T/IL6 and pMD18-T/OmpW by Gene-SOEing method. The full length product was then cloned into the prokaryotic expression vector pET-32a(+) for protein expression in Escherichia coli strain BL21(DE3). The molecular weight of expression fusion protein IL6-(Gly4Ser)3-OmpW was about 66.6 ku. The recombinant protein was high expressed under induction conditions of exposure at 37℃, in 0.2 mmol·L-1 of IPTG for 5 h. The fusion protein was purified using HisTrap™HP affinity column and the best elution concentration of imidazole was 400 mmol·L-1. The concentration of purified fusion protein was 480 µg·mL-1. Western-blot analysis showed that the recombinantfusion protein could be combined with mouse anti-His-Tag Mab, indicating that the aim protein was expressed successfully. These results could provide a foundation for further study of its biological activity.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2013(000)004【总页数】6页(P43-48)【关键词】哈维氏弧菌OmpW;红笛鲷IL-6;基因融合;原核表达【作者】黄浦江;黄郁葱;简纪常;吴灶和;鲁义善;黄瑜;樊云霞【作者单位】广东海洋大学水产学院，广东湛江 524025; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江 524025; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东湛江 524025;广东海洋大学水产学院，广东湛江 524025;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江 524025; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东湛江524025;广东海洋大学水产学院，广东湛江 524025; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江 524025; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东湛江 524025;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江 524025; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东湛江 524025; 仲恺农业工程学院，广东广州 510225;广东海洋大学水产学院，广东湛江 524025; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江 524025; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东湛江 524025;广东海洋大学水产学院，广东湛江 524025; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江 524025; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东湛江 524025;广东海洋大学水产学院，广东湛江 524025; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江 524025; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东湛江 524025【正文语种】中文【中图分类】Q78;S94哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是海水养殖中一种常见的条件致病菌，是一种革兰阴性发光弧菌，能引起鱼、虾等多种水生动物发病，给海水养殖业造成巨大的经济损失[1-2]。