大肠杆菌疫苗对胎兔肺表面活性物质蛋白基因表达的影响

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如何确定你的兔兔得了大肠杆菌病

如何确定你的兔兔得了大肠杆菌病
兔兔
大肠杆菌是仔兔、幼兔的常见病，传染性高、传播快、死亡率高，在兔兔表现出不适的时候，快速确定病因并加以治疗是快速控制疫情的唯一方法，那么我们该如何判定兔兔是患了大肠杆菌病？
1. 症状
本病以兔下痢、流涎为主要特征。

病兔体温正常或偏低，精神沉郁，食欲减退，被毛粗乱，腹部膨胀（充满气体和液体），拍打时有击鼓声，摇晃时有拍水声。

病初兔排黄色明胶样黏液便或带黏液干便，有时也会带黏液的粪球与正常粪球交替出现，随后出现黄色水样便或白色泡沫，四肢发冷，磨牙、流涎，眼部下陷，最后衰竭死亡。

2. 防治
加强饲养管理，减少各种应激;将生物制剂拌料饲喂;在兔子21 日龄时注射大肠杆菌苗，每只 1 毫升，接种自家苗效果更好。

3. 治疗
早发现、早治疗效果较好。

用鼻咳停注射液按兔每公斤体重0。

1 毫升的量注射，隔48 小时再注射1 次。

也可给病兔肌注硫酸卡那霉素，兔每公斤体重用20毫克，每天注射2次，连续用药 3 天。

还可在其饲料或饮水中添加大肠杆菌净饲饮，治疗效果都很好。

1/ 1。

真核基因在大肠杆菌中表达

增强子：特殊的序列元件，能显著增强外源基因的表达效率。
翻译终止子：必须存在终止密码子。
✓ 构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子 (UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖体的跳跃现象。
✓ 大肠杆菌最偏爱的密码子：UAA ✓ 当为四联核苷酸UAAU时，终止效率进一步增强。
真核基因在大肠杆菌中表达
翻译起始序列：决定mRNA翻译起始效率。
未鉴定出其保守结构，只能采取一些方法降低mRNA 5’-末端二级结构的形成，增加RBS中A、 T含量，碱基定点突变等。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
目前常用的表达系统
细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动物细胞等
真核基因在大肠杆菌中表达
大肠杆菌表达系统的优越性
➢ 背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机理研究的比较深入。
➢ 安全(被FDA批准为安全的基因工程受体生物)，且有多种不同的菌株和质粒载体。
➢ 已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。 ➢ 培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进
物使外源基因获得表达，如IPTG、温度等。
真核基因在大肠杆菌中表达
转录终止子（TT）
✓ 上游启动子会抑制下游启动子的转录功能(启动子封堵作用)，因此需要在克隆基因编码区的 3’-末端接上一个有效的转录终止子。
✓ 转录终止子能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中的表达
真核基因在大肠杆菌中表达
内容提纲

wp_240768786基因在大肠杆菌中的过表达实验的实验内容

wp_240768786基因在大肠杆菌中的过表达实验的实验内容实验内容：1. 构建过表达载体：首先，将基因wp_240768786的DNA序列克隆到适当的过表达载体中，例如质粒或病毒载体。

这个载体通常包含一个强效的启动子和其他必要的调控元件，以确保目标基因在大肠杆菌中高水平地表达。

2. 转化大肠杆菌：将构建好的过表达载体转化到大肠杆菌细胞中。

这可以通过电穿孔、热激转化或化学转化等方法完成。

转化后，使用适当的培养基和条件培养大肠杆菌细胞。

3. 鉴定过表达菌落：从转化后的细胞中筛选出含有过表达载体的菌落。

一种常用的筛选方法是在培养基中添加适当的抗生素，如氨苄青霉素（Ampicillin），只有带有过表达载体的菌落才能生长。

4. 培养过表达菌株：将筛选出来的过表达菌落进行预培养，并选择合适的培养条件，如温度、pH值和培养时间等，以促进基因的过表达。

5. 收集菌体：在培养菌株进入对数生长期时，收集大肠杆菌细胞。

可以通过离心将菌体沉淀下来，并冻存或进行后续的处理。

6. 提取基因产物：使用适当的方法提取过表达基因产物，例如蛋白质。

常用的方法包括细胞破碎、超声波处理或化学溶解等。

7. 验证过表达效果：使用合适的技术手段，如Western blotting、荧光定量PCR 或质谱分析等，验证基因的过表达效果。

这些方法可以检测基因产物（如蛋白质）的表达水平，以确定过表达实验是否成功。

8. 数据分析和解释：根据实验结果进行数据分析和解释。

可以比较过表达菌株与野生型菌株之间的差异，探究基因过表达对大肠杆菌的影响，并进一步研究基因功能或相关途径。

需要注意的是，以上实验内容仅为一般的大肠杆菌基因过表达实验流程，具体操作步骤可能会因实验目的、条件和使用的工具而有所不同。

大肠杆菌重组蛋白表达流程

大肠杆菌重组蛋白表达流程大肠杆菌重组蛋白表达流程主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达载体：通常选择含有启动子、转录终止子、选择标记和适当的表达调控元件的表达载体。

启动子用于驱动基因转录，转录终止子用于确定转录产物的结束位置，选择标记有助于筛选含有目的基因的转化子，而表达调控元件可以调节基因的表达水平。

2. 构建表达载体：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。

在此过程中，需要考虑目的基因的orientation（方向）、阅读框（ORF）以及表达调控元件的活性等因素。

3. 转化大肠杆菌：将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌中。

转化方法有多种，如化学法（如CaCl2法）、电转化、热激转化等。

转化后，大肠杆菌吸收了外源DNA，成为重组菌株。

4. 筛选重组菌株：在含有选择性抗生素的培养基上培养转化后的菌落，筛选出含有目的基因的重组菌株。

此外，可以通过鉴定菌落的形态、颜色等特征进行初步筛选。

5. 诱导表达：将筛选出的重组菌株接种到含有诱导剂（如IPTG）的培养基中，诱导目的基因的表达。

诱导剂IPTG可以与表达载体中的启动子结合，增强基因转录和翻译的效率。

6. 收集和纯化重组蛋白：诱导表达后，菌体中会含有目的蛋白。

可以通过离心、破碎细胞、柱层析等方法分离和纯化重组蛋白。

常用的纯化标签有His标签、GST标签等，这些标签可以帮助分离和纯化目的蛋白。

7. 蛋白活性检测和应用：对纯化的重组蛋白进行活性检测，如酶活测定、蛋白互作实验等。

确认蛋白活性后，可应用于生物学研究、药物研发等领域。

需要注意的是，大肠杆菌重组蛋白表达过程中可能会遇到表达量低、蛋白包涵体等问题。

为了解决这些问题，可以尝试优化表达载体、改变诱导条件、使用融合标签等策略。

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结果与分析
4 免疫攻毒后脏器指数
接种铝胶疫苗后进行攻毒心脏、肝脏、肺脏与肺脏指数与对照组相比不存在明显差异性（P＞0.05），计量0.15ml/只、0.20ml/只和0.25ml/只组脾脏指数与对照组存在明显差异（P＜0.05）
胸腺指数虽未存在明显差异，随疫苗计量的加大，胸腺指数有所上升，综合说明接种铝胶苗后对小白鼠的免疫有明显的免疫提高作用
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结果与分析
2 致死性结果
分离菌株接种试验动物后，发现小白鼠注射后开始出现精神萎靡，对死亡小鼠解剖观察发现心脏出血、淤血，肠壁变薄、充气。发现该临床菌致病力极强；
对于18~22g小白鼠接种0.3ml/只致死率达到100%，实验确定最小致死量为0.2ml。
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结果与分析
3 免疫剂量确定
3.1输入文字输入字
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兔大肠杆菌病症状有哪些？

兔大肠杆菌病症状有哪些？
兔大肠杆菌病主要引起家兔拉稀或便秘，粪便中常有胶冻样黏液，稍带腥臭味。

还可引起败血症及胸腔化脓等。

兔大肠杆菌病主要引起家兔拉稀或便秘，粪便中常有胶冻样黏液，稍带腥臭味。

还可引起败血症及胸腔化脓等。

临床症状
仔幼兔发病初期首先出现精神不振，采食量下降或废绝，打堆成团，有的出现排软粪等症状；中期一般表现为腹泻、拉稀，污染肛门、尾部，患兔被毛粗乱，严重的呈水样腹泻，粪便污染肛门及尾部，有的病兔拉出胶冻状物质包裹粪球，患兔耳根和四肢末梢冰凉，体温下降，病程2-5天。

青年兔与成年兔发病一般表现为拉软粪或拉稀，有的老年兔常出现便秘症状，粪球细小。

根据断奶前后仔幼兔多发，以拉黄白色水样粪便或粪便外有一层胶冻样黏液，小肠胀气，肠壁变薄，内有黏液和胶冻样液体等特点，可做出初步诊断。

第七章_疫苗概论

当前使用的病毒疫苗多数是减毒活疫苗。
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减毒活疫苗（弱毒疫苗）的优点：活疫苗通常以模拟微生物自然感染状态来刺激
免疫应答，既可刺激体液免疫又可刺激细胞免疫，特别是当以自然途径如口服或喷鼻免疫时，还可刺激黏膜免疫。因此具有免疫全面、免疫力持久等优点。
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弗氏佐剂（Freundadjuvant），是目前最常用于动物实验的佐剂，它是将抗原水溶液与油剂（石蜡油或植物油）等量混合，再加乳化剂（羊毛脂或吐温80）制成油包水抗原乳剂，称之为不完全弗氏佐剂。如在不完全佐剂中加入分枝杆菌（如死卡苗）则称为完全弗氏佐剂。白油Span佐剂是用轻质矿物油（白油）作油相，用Span-80或 Span-85及Tween-80作为乳化剂制成的油乳佐剂，是当前兽医生物制品中最常用最有效的佐剂之一。
在制备疫苗中常加入适宜的稳定剂或保护剂，如冻干疫苗中常用的乳糖、明胶、山梨醇等，以保证疫苗再加工和存储过程中的稳定性。
在疫苗生产制备中常采用化学试剂灭活，常用的化学灭活有丙酮、苯酚、甲醛、去氧胆酸钠表面活性剂等，在后续的制备程序中应从疫苗中除去，以保证疫苗的安全性。
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三、疫苗的种类
产生的抗体以sIgA为主，经粘膜上皮细胞分泌至粘膜表面，为黏膜局部抵御病原微生物感染的主要机制。
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2、减毒活疫苗（弱毒疫苗）是指将微生物的自然强毒株通过物理的、化学
的和生物学的方法连续传代，使其对原宿主丧失毒力，或只引起亚临床感染，但仍保持良好的免疫原性、遗传特性，用这种毒株、菌株制备的疫苗就叫减毒活疫苗。
皂角素是从南美种的皂角树皮提取出的具有免疫刺激活性的一类物质。其中Quil A是皂角素中初步纯化的产品，有促进Thl和Th2 T辅助细胞功能和增强体液免疫的作用。

大肠杆菌表达的病毒样颗粒疫苗

收稿日期：2013-12-24基金项目：国家自然科学基金项目(30925030；81172885)*通信作者：E-mail ：nsxia@夏宁邵，男，1964年7月生，教授，厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心主任，公共卫生学院院长，全国体外诊断产业技术创新战略联盟理事长。

长期致力于病毒性疾病的应用基础及转化研究。

主持研制出全球第一个商品化重组戊型肝炎疫苗及30余种传染病诊断试剂盒并均实现产业化，研制的重组人乳头瘤病毒16/18型二价疫苗正在进行三期临床试验。

所主持项目获国家技术发明二等奖、国家科技进步二等奖、中国专利金奖各1项，获授权专利22项，在Lancet 、PNAS 等SCI 刊物发表论文90余篇。

大肠杆菌表达的病毒样颗粒疫苗李少伟，夏宁邵*(厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，厦门 361102)摘要：重组病毒样颗粒是病毒衣壳蛋白外源表达的重要形式，形态结构与天然病毒高度相似，位于纳米尺度的大小易于被免疫系统识别，可激发机体产生保护性免疫反应，且不含有病毒基因，因此，是一种理想的疫苗形式，也是基于结构进行疫苗设计的重要结构载体。

目前已上市的乙型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗和戊型肝炎疫苗等基因工程疫苗均采用病毒样颗粒形式。

大肠杆菌表达系统被广泛用于基因工程药物的生产，具有安全性好、生产周期短、易于放大生产等优点，在病毒样颗粒疫苗应用上具有良好前景。

本文综述了利用大肠杆菌研制戊型肝炎疫苗和人乳头瘤病毒疫苗的进展，特别是这些病毒样颗粒疫苗的表达及组装、表位结构特征和临床试验结果。

关键词：疫苗；病毒样颗粒；大肠杆菌；戊型肝炎病毒；人乳头瘤病毒；重组蛋白Virus-like particle-based vaccine development usingEscherichia coli expression systemLI Shaowei, XIA Ningshao *(National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in infectious disease, Xiamen University, Xiamen 361102, China )Abstract: Virus-like particles (VLPs) are generated by the self-assembly of viral structural protein usingvarious expression systems. VLPs ensemble native virus particles in morphology and maintain key immune epitopes as authentic virus. In light of nanometer-sized particles with diameters of 20- 60 nm, VLPs were shown to be a passport to immune recognition, thus being capable of eliciting strong protective immune responses. Recombinant VLP-based vaccines have superior safety profiles due to lack of any viral genome. There are several licensed and highly successful VLP-based vaccines produced using recombinant DNA《生命的化学》2014年34卷1期· 14 ·专题：新兴疫苗technology, such as recombinant hepatitis B, human papillomavirus and hepatitis E vaccine. E.coli expression system was well-established in production of biotherapeutics. This production platform for recombinant VLP-based vaccines has many advantages, such as rapid replication cycle and amenability for scale-up for commercial scale production. This review outlines the success of hepatitis E and human papillomavirus vaccines derived from E.coli. We highlight the protein expression, particle assembly, key epitope structure and clinical trials of these VLP-based vaccines.Key words: prophylactic vaccine; virus-like particles; Escherichia coli; hepatitis E virus; human papillomavirus; recombinant protein疫苗是预防病毒性疾病最为成功的干预手段。

第七章微生物遗传试题及答案

第七章微生物遗传试题一．选择题：71085.71085.已知DNA的碱基序列为CATCATCAT，什么类型的突变可使其突变为：CTCATCATA.A.缺失B.B.插入C.C.颠换D.D.转换答：()71086.71086.已知DNA的碱基序列为CATCATCAT，什么类型的突变可产生如下碱基序列的改变：CACCATCAT？A.缺失B.插入C.颠换D.转换答：()71087.71087.不需要细胞与细胞之间接触的基因重组类型有：A.接合和转化B.转导和转化C.接合和转导D.接合答：()71088.71088.转化现象不包括A.DNA的吸收B.感受态细胞C.限制修饰系统D.细胞与细胞的接触答：()71089.71089.将细菌作为实验材料用于遗传学方面研究的优点是：A.生长速度快B.易得菌体C.细菌中有多种代谢类型D.所有以上特点答：()71090.71090.转导噬菌体A.仅含有噬菌体DNAB.可含有噬菌体和细菌DNAC.对DNA酶是敏感的D.含1至多个转座子答：()71091.71091.在Hfr菌株中：A.F因子插入在染色体中B.在接合过程中，F因子首先转移C.在接合过程中，质粒自我复制D.由于转座子是在DNA分子间跳跃的，因此发生高频重组答：()71092.71092.以下碱基序列中哪个最易受紫外线破坏？A.AGGCAAB.CTTTGAC.GUAAAUD.CGGAGA答：()71093.71093.对微生物进行诱变处理时，可采用的化学诱变剂是：A.青霉素B.紫外线C.丫啶类染料D.转座子答：()71094.71094.在大肠杆菌(E.coli)的乳糖操纵子中，基因调节主要发生在__________水平上。

A.转化B.转导C.转录D.翻译答：()71095.71095.转座子___________。

A.能从DNA分子的一个位点转移到另一个位点B.是一种特殊类型的质粒C.是一种碱基类似物D.可引起嘌呤和嘧啶的化学修饰答：()71096.71096.当F+F-杂交时A.F因子几乎总不转移到F+细胞中B.F-菌株几乎总是成为F+C.基因重组的发生频率较高D.F因子经常插入到F-细胞染色体上答：()71097.71097.在U形玻璃管中，将一滤片置于二株菌之间使之不能接触，在左臂发现有原养型菌出现，这一现象不是由于：A .接合B.转化C.普遍转导D.专性转导答：()71098.71098.F因子和λ噬菌体是：A.与寄主的生活能力无关B.对寄主致死C.与染色体重组后才可复制D.仅由感受态细胞携带答：()71099.71099.细菌以转化方式进行基因转移时有以下特性：A.大量供体细胞的基因被转移B.包含有F质粒参加C.依靠噬菌体感染受体细胞D.可通过从供体细胞中提取DNA片段来完成答：()71100.71100.一个大肠杆菌(E.coli)的突变株，不同于野生型菌株，它不能合成精氨酸，这一突变株称为：A.营养缺陷型B.温度依赖型C.原养型D.抗性突变型答：()71101.71101.转导子是指：A.供体菌B.转导噬菌体C.转导前供体菌D.转导后受体菌答：()71102.71102.以下不是专性转导特点的是：A.必须是原噬菌体状态B.供体细胞中的任何染色体基因片段都有机会被转移到受体细胞中C.通常包括了一个基因如半乳糖(gal)基因的重组D.原噬菌体转导导致噬菌体某些基因留在了细菌的基因组中答：()71103.71103.当Hfr F-时，A.进入到F-细胞中的第一个基因随Hfr菌株的不同而不同B.采用在不同时间中断杂交的方法来作基因图C.单链DNA链的5 '端首先进入F-细胞D.所有上述特点全正确答：()71104.71104.抗药性质粒(R因子)在医学上很重要是因为它们：A.可引起某些细菌性疾病B.携带对某些抗生素的特定抗性基因C.将非致病细菌转变为致病菌D.可以将真核细胞转变为癌细胞答：()71105.71105.在普遍性转导中，同源DNA分子的交换要求：A.转座子B.插入序列C.DNA链的断裂和重新连接D.反转录答：()71106.71106.F+F-杂交时，以下哪个表述是错误的？A.F-细胞转变为F+细胞B.F+细胞转变为F-细胞C.染色体基因不转移D.细胞与细胞间的接触是必须的答：()71107.71107.以下突变中哪个很少有可能产生回复突复：A.点突变B.颠换C.转换D.染色体上三个碱基的缺失答：()71108.71108.准性生殖：A.通过减数分裂导致基因重组B.有可独立生活的异核体阶段C.可导致高频率的基因重组D.常见于子囊菌和担子菌中答：()71109.71109.流产转导不具有_________的特性。

蛋白质的表达纯化教师教材.ppt

实验原理
克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。
见清晰的界限）
青苗辅导
6
• 3．制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配
方如下：
30%Arc- Tris-HCl H2O
Bis
pH 6.7
400ul 750ul 1800ul
10%AP TEMED 50ul 10ul
青苗辅导
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4. 灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。
青苗辅导
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• 5．加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样10L。
• 6．电泳：先恒压80V，待样品进入分离胶后，调电压为120V（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约 0.5cm时，停止电泳。
青苗辅导
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7．翘开玻璃板，将浓缩胶切掉, 剥下凝胶，准备染色。
8．凝胶染色：使用考马斯亮蓝R250染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约15-20秒，摇床振荡15分钟，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（25%乙醇，75% 乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，每次10分钟。
青苗辅导
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BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 • 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 • 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h. • 4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于20℃或-70℃冰箱中。

兔子大肠杆菌怎么治疗？

兔子大肠杆菌怎么治疗？兔大肠杆菌病的明显特征就是病兔拉稀，看上去不精神，一看就知道有兔子身体有问题，急性的大约在2天内就会出现死亡现象，亚急性的一星期左右会出现死亡。

所以建议大家，当发现兔子又拉稀等疑似发病症状时，一定要及时诊断，对症治疗，以免耽误病情拖延发病时间，或导致兔子死亡。

当然，首先有一点最重要的就是要在每日的兔子饲养管理过程中，注意留心观察兔子的健康情况，做到早发现，早治疗。

下面514193兽药招商网针对兔大肠杆菌病，主要从兔子患发该病的原因、诊断、治疗和预防三大方面做以下介绍，希望能对大家防治兔大肠杆菌有所帮助。

兔子大肠杆菌病发生的原因1、环境差。

所谓的环境差，就是说给兔子提供的水源水质差，有污染或不合格。

养兔的环境卫生差，没有消毒或无严格消毒，环境差。

2、兔子体质差。

体质差的兔子最容易感染大肠杆菌病，特别是刚断奶或段奶时间不长的小兔子，由于体质弱，抵抗力差，很容易感染。

3、病原滋生。

养兔环境差，导致寄生虫滋生，又没及时治疗，也很容易使兔诱发大肠杆菌病。

兔子大肠杆菌病的诊断在这里给大家介绍下兔大肠杆菌最简单的诊断方法，主要是从兔子的外在症状来观察，判断。

如果你发现你的病兔有这些症状就要看看是不是得大肠杆菌病了。

该病的潜伏期为4-6天，所以一般在这几天之前可能我们肉眼是看不到兔子明显的病症状的。

初期，兔子在发病初期，拉黄稀便或粘液干便，有时候也会有带黏液的粪球和正常粪球交替出现。

随后，开始出现黄水便或白色泡沫，身体后部被粪便黏液玷污。

最后，发展为四肢发凉，磨牙，流口水，眼部下陷，最终衰竭死亡。

当然这只是初步判断，如果根据这些症状还确定不了的话，就需要病理剖检或进行实验室检验以最终确定兔子是否是得了大肠杆菌。

兔子大肠杆菌怎么治疗?1.用恩吉诺(主要成分：恩诺沙星等)注射液，每公斤体重0.5-1ml，每日2次，肌肉注射，连用3天。

2.病兔群与健康群饲料内混喘痢杀(主要成分：环丙沙星等)按说明饲喂，连用5天。

生物药物的分类基因重组多肽蛋白类治疗剂基因药物

1、生物药物的分类：（1）基因重组多肽、蛋白类治疗剂（2）基因药物（3）天然生物药物（4）合成与部分合成的药物。

DNA重组药物和基因药物的区别：DNA重组药物即应用重组DNA技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等；基因药物即以基因物质（DNA或RNA）为基础，研究而成的基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。

3、DNA重组药物主要有哪几类，举例说明。

DNA重组药物有：（1）细胞因子干扰素类：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素（2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子：白介素-2（IL-2）和突变型白介素-2（Ser125-IL-2）肿瘤坏死因子类主要有TNF-α和TNF-α受体。

（3）造血系统生长因子类：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）、促红细胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO）干细胞生长因子（SCF）（4）生长因子类：胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDFD）、转化生长因子（TGF-α和TGF- β）、神经生长因子（NGF）及各种神经营养因子。

（5）重组多肽与蛋白质类激素：重组人胰岛素（rhInsulin）、重组人生长激素（rhGH）、促卵胞激素（FSH）、促黄体生成素（LH）和绒毛膜促性腺激素（HCG）、重组人白蛋白和重组人血红蛋白（6）心血管病治疗剂与酶制剂：Ⅷ因子、水蛭素、tpA、rtpA、尿激酶、链激酶、葡激酶、天冬酰胺酶、超氧化歧化酶、葡萄糖脑苷酶及DNsae等（7）重组疫苗与单抗制品：重组乙肝表面抗原疫苗、乙肝基因疫苗、AIDS疫苗、流感疫苗、痢疾疫苗和肿瘤疫苗。

2 简述生物活性物质分离纯化的主要原理：根据混合物中的不同组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，或者将混合物置于某一相中，外加一定作用力，使多组分分配于不同区域，从而达到分离的目的。

大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用

大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是常用的表达宿主。

利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而产生大量目标蛋白。

本文将介绍大肠杆菌表达载体的构建方法及其应用。

一、大肠杆菌表达载体的构建方法1. 选择适合的表达载体：常见的大肠杆菌表达载体包括pET系列、pBAD系列和pGEX系列等。

选择适合的表达载体主要考虑载体的复制起源、选择标记、表达调控元件和蛋白纯化标记等因素。

2. 克隆目标基因：将目标基因通过PCR扩增得到目标基因片段，然后利用限制性内切酶切割载体和目标基因片段，将目标基因片段插入载体中。

3. 进行质粒转化：将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中。

可以通过化学法、电穿孔法或热冲击法等方法将质粒导入大肠杆菌中。

4. 筛选与鉴定：经过转化后，利用选择性培养基筛选出含有目标基因的重组大肠杆菌。

通过PCR、限制性酶切和测序等方法对重组菌株进行鉴定，确认目标基因已经成功插入载体。

二、大肠杆菌表达载体的应用1. 蛋白表达：利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而大量产生目标蛋白。

这对于研究蛋白的结构、功能及其在生物学过程中的作用具有重要意义。

2. 蛋白纯化：大肠杆菌表达载体常含有蛋白纯化标记，如His标签、GST标签等。

通过这些标记，可以方便地对目标蛋白进行纯化和检测，为后续研究提供了便利。

3. 蛋白互作研究：大肠杆菌表达载体可以用于蛋白互作研究。

通过将目标蛋白与其他蛋白共同表达，可以研究它们之间的相互作用关系，揭示生物学过程中的分子机制。

4. 疫苗研究：大肠杆菌表达载体可以用于疫苗研究。

将目标抗原基因导入大肠杆菌中进行表达，可以获得大量的抗原蛋白，从而用于疫苗的开发和研究。

5. 酶工程：大肠杆菌表达载体可以用于酶工程研究。

通过将目标酶基因导入大肠杆菌中表达，可以进行酶的产量优化、酶的工艺改造等研究，提高酶的生产效率和稳定性。

大肠杆菌表达系统的研究

大肠杆菌表达系统的研究大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统。

大肠杆菌表达系统的发展历史可追溯到二十年前，Struhl等（1976）、Vapnek等（1977）和Chang等（1978）分别将酿酒酵母DNA片段、粗糙链孢霉DNA片段和哺乳动物cDNA片段导入大肠杆菌，引起其表型的改变，证明了外源基因在大肠杆菌中可以使现有功能的活性表达。

这些研究工作为大肠杆菌表达系统的发展奠定了理论基础。

Guarante等（1980）在Science杂志上发表了以质粒、乳糖操纵子为基础建立起来的大肠杆菌表达系统，这一发展构成了大肠杆菌系统的雏型。

随着80年代后期分子生物学技术的不断发展，大肠杆菌表达系统也不断得到发展和完善。

与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点。

在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。

1 表达载体大肠杆菌质粒是一类独立于染色体外自主复制的双链、闭环DNA分子，大肠杆菌质粒可分为结合转移型和非结合转移型两种，非结合转移型质粒在通常培养条件下不在宿主间转移，整合到染色体上的频率也很低，具有遗传学上的稳定性和安全性。

又因其大小一般在2－50kb范围内，适合于制备和重组DNA的体外操作，因此几乎所有的大肠杆菌表达系统都选用非结合转移型质粒作为运载外源基因的载体，这些表达载体通过对天然质粒的改造获得。

理想的大肠杆菌表达载体要求具有以下特征：（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。

（2）具有显性的转化筛选标记。

（3）启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低。

（4）启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制。

（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点。

复制子、筛选标志、启动子、终止子和核糖体结合位点是构成表达载体的最基本元件。

基因工程药物的生产原理及其应用

基因工程药物的生产原理及其应用第一篇：基因工程药物的生产原理及其应用基因工程药物的生产原理及其应用摘要：近年来，基因工程药物在目的基因制备、载体的构建、基因转移技术、宿主表达系统和生物反应发生器等方面取得了令人瞩目的成就。

本文简单介绍基因工程药物的生产原理及其重要应用。

关键词：基因工程药物生产原理应用随着基因研究的深入，人类已经可以生产出许多基因工程产品。

基因工程药物引入医药产业,由此引起了医药工业的重大变革,使得医药产业成为最活跃、发展最快的产业之一，同时大大提高了21世纪人类的整体健康状况。

基因工程药物又称生物技术药物是指利用基因工程技术研制和生产的药物，是根据人们的愿望设计的基因,在体外剪切组合,并和载体DNA 连接,然后将载体导入靶细胞(微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞),使目的基因在靶细胞中得到表达,最后将表达的目的蛋白质纯化及做成制剂,从而成为蛋白类药或疫苗。

主要种类有：胰岛素、单克隆抗体、荷尔蒙、干扰素、白细胞介素、组织型纤溶酶原激活因子、红细胞生成素、集落刺激因子。

生产原理基因工程制药技术分获取目标基因的上游技术和大量培养上游技术阶段。

上游技术实质就是基因工程技术。

下游技术则包括菌体培养，细胞破碎，大量培养以及分离纯化几个步骤。

1.1 基因工程制药的上游技术基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。

所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。

它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达。

基因工程研究采用的技术方法很多，以下介绍常见基本两种：聚合酶链反应技和Sanger双脱氢链终止法。

基于网络药理学分析党参减轻大肠杆菌感染小鼠急性肺损伤的作用机制

畜牧兽医学报 2023,54(8):3571-3581A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.08.040开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):基于网络药理学分析党参减轻大肠杆菌感染小鼠急性肺损伤的作用机制巩志国,赵佳敏,顾柏臣,任佩佩,于琢雅,白云洁,刘鑫煜,王超,刘博*(内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018)摘要:本研究以网络药理学和相关分子生物学试验相结合共同探究党参对小鼠急性肺损伤(a c u t e l u n g i n j u r y,A L I )的保护作用机制㊂通过网络药理学相关数据库对党参的主要化学成分及主成分相关靶点进行挖掘㊂通过疾病相关数据库获取急性肺损伤的相关靶点㊂构建蛋白相互作用(P P I)网络,并对挖掘的数据进行G O 分析和K E G G 通路富集分析㊂结果表明,党参中的主要成分有8种化合物可作用于303个靶点;急性肺损伤相关靶点有1522个,党参与急性肺损伤相交靶点为119个,P P I 网络包括MA P K ,N F -κB 和T L R 4等总共103个核心靶点;G O 功能富集分析显示,分子功能133条,生物学过程79条,细胞组分523条;K E G G 富集分析显示相关通路132条㊂通过W e s t e r n b l o t ㊁E L I S A 和免疫荧光方法进行验证㊂试验结果表明,党参多糖(C o d o n o p s i s p i l o s u l a p o l y s a c -c h a r i d e ,C P P S )预处理可显著下调大肠杆菌诱导的巨噬细胞中MA P K 和N F -κB 炎症信号通路的激活,并可显著下调炎性细胞因子T N F α和I L -1β的分泌水平;此外小鼠体内试验表明党参多糖可显著下调小鼠肺中T N F α和I L -1β的产生,并可下调损伤相关因子HMG B 1的表达从而降低大肠杆菌诱导的肺损伤㊂综上所述,党参可对急性肺损伤的疾病相关靶点通过多个通路及生物过程进行调控从而发挥对肺保护作用㊂关键词:急性肺损伤;党参;网络药理学;靶点中图分类号:S 853.74 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)08-3571-11收稿日期:2022-11-08基金项目:国家自然科学基金项目(32160854)作者简介:巩志国(1995-),内蒙古锡林浩特人,博士生,主要从事细菌感染性疾病发病机理研究,E -m a i l :156********@163.c o m*通信作者:刘博,主要从事奶牛产后细菌感染性疾病发病机理和诊断防治研究,E -m a i l :l i u b o 8510@i m a u .e d u .c nE x p l o r i n gt h e M e c h a n i s m o f C o d o n o p s i s p i l o s u l a i n A l l e v i a t i o n o f A c u t e L u n g I n j u r y i n E s c h e r i c h i a c o l i I n f e c t e d M i c e B a s e d o n N e t w o r k P h a r m a c o l o g yG O N G Z h i g u o ,Z H A O J i a m i n ,G U B a i c h e n ,R E N P e i p e i ,Y U Z h u o y a ,B A I Y u n j i e ,L I U X i n yu ,WA N G C h a o ,L I U B o*(C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,I n n e r M o n g o l i a A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,H o h h o t 010018,C h i n a )A b s t r a c t :T h e n e t w o r k p h a r m a c o l o g y a n d r e l a t e d m o l e c u l a r b i o l o g y e x pe r i m e n t s w e r e u s e d t o e x -p l o r e t h e p r o t e c t i v e m e c h a n i s m of C o d o n o ps i s p i l o s u l a o n a c u t e l u n g i n j u r y (A L I ).T h e m a i n c h e m i c a l c o m p o n e n t s o f C o d o n o p s i s r a d i x a n d r e l a t e d t a r g e t s w e r e m i n e d t h r o u gh t h e n e t w o r k p h a r m a c o l o g y d a t a b a s e .T h e r e l a t e d t a r g e t s o f A L I w e r e o b t a i n e d t h r o u gh d i s e a s e -r e l a t e d d a t a -b a s e s .p r o t e i n i n t e r a c t i o n (P P I )n e t w o r k w a s c o n s t r u c t e d ,a n d G O a n a l y s i s a n d K E G G p a t h w a ye n r i c h m e n t a n a l y s i s w e r e p e rf o r m e d o n t h e m i n e d d a t a .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t 8c o m po u n d s i n C o d o n o ps i s p i l o s u l a c o u l d a c t o n 303t a r g e t s ,1522t a r g e t s r e l a t e d t o A L I ,119i n t e r s e c t i n g t a r -g e t s i n v o l v e d i n A L I ,103t a r g e t s i n P P I n e t w o r k i n c l u d i n g MAP K ,N F -κB a n d T L R 4.G O f u n c -t i o n a l e n r i c h m e n t a n a l y s i s s h o w e d 133m o l e c u l a r f u n c t i o n s ,79b i o l o g i c a l pr o c e s s e s a n d 523c e l l u -畜牧兽医学报54卷l a r c o m p o n e n t s,a n d K E G G s h o w e d132r e l a t e d p a t h w a y s.T h e r e s u l t s w e r e v e r i f i e d b y W e s t e r nb l o t t i n g,E L I S A a n d i mm u n o f l u o r e sc e n c e.T h e r e s u l t s s h o w ed t h a t C o d o n o p s i s p i l o s u l a p o l y s a c-c h a r ide s p r e t r e a t m e n t c o u l d d o w n-r e g u l a t e MA P K a n d N F-κB i nf l a mm a t o r y s ig n a l p a th w a y s a c t i-v a ti o n a n d T N Fαa n d I L-1βs e c r e t i o n i n E.c o l i-i n d u c e d m a c r o p h a g e s.F u r t h e r m o r e,C o d o n o p s i s p i l o s u l a p o l y s a c c h a r i d e c o u l d d o w n-r e g u l a t e T N Fαa n d I L-1βp r o d u c t i o n,a n d d o w n-r e g u l a t e HMG B1e x p r e s s i o n t o r e d u c e t h e l u n g i nj u r y i n t h e E.c o l i-i n f e c t e d l u n g s o f m i c e.I n c o n c l u s i o n, C o d o n o p s i s p i l o s u l a c o u l d p r o t e c t t h e l u n g b y r e g u l a t i n g d i s e a s e-r e l a t e d t a r g e t s o f A L I t h r o u g h m u l t i p l e p a t h w a y s a n d b i o l o g i c a l p r o c e s s e s.K e y w o r d s:a c u t e l u n g i n j u r y;C o d o n o p s i s p i l o s u l a;n e t w o r k p h a r m a c o l o g y;t a r g e t s*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:L I U B o,E-m a i l:l i u b o8510@i m a u.e d u.c n党参(C o d o n o p s i s p i l o s u l a)具有补中益气㊁生津㊁胃和健脾益肺等功效,是我国传统的补益药之一[1]㊂党参多糖(C o d o n o p s i s p i l o s u l a p o l y s a c c h a-r i d e,C P P S)是从中药党参中提取的主要生物活性化合物之一[2]㊂其具有广泛的生物活性和药理作用,包括调节细胞和体液免疫㊁抗炎㊁抗病毒㊁抗肿瘤和抗氧化㊂中医药具有以整体观和辨证论治为特色的理论体系和几千年的临床实践经验,随着医学与生命科学研究逐渐步入大数据时代㊂网络药理学应运而生从整体的角度探索药物与疾病间的关联性[3]㊂目前,网络药理学已成为中医药研究领域的热点和前沿㊂急性肺损伤(a c u t e l u n g i n j u r y,A L I)是由直接或间接肺损伤引起的炎症反应,是一种剧烈的肺部炎症反应,表现为中性粒细胞聚集㊁间质水肿㊁上皮完整性破坏㊁蛋白渗入肺泡间隙和炎性细胞因子水平升高等[4]㊂重症则为急性呼吸窘迫综合征,可导致多器官衰竭,致死率高达30%~50%,特征是炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(T N F-α)㊁白细胞介素1β(I L-1β)的释放及炎性细胞的流入和活化[5-6]㊂大肠杆菌(E s c h e r i c h i a c o l i,E.c o l i)所致感染性肺损伤的病理生理变化,与常见吸入性肺损伤所致A L I 的发病过程相似[7]㊂大量研究表明,大肠杆菌菌体成分L P S和大肠杆菌均可诱导小鼠A L I的发生[8-10]㊂L P S吸入是小鼠A L I的成熟试验模型,其特征是肺组织/支气管肺泡灌洗液中急性中性粒细胞积累和肺水肿[11]㊂但党参对防治急性肺损伤的作用机制目前尚不清楚㊂本研究采用网络药理学的方法,对党参防治急性肺损伤进行有效成分的预测和靶点的挖掘,并从蛋白互作㊁分子功能,生物学过程和相关通路多角度挖掘党参对防治急性肺损伤的潜在作用机制㊂使用大肠杆菌建立A L I小鼠模型,对相关的信号通路激活和细胞因子分泌情况进行验证,并通过免疫荧光和H E染色对肺损伤进行评估㊂因此,该机制阐明可为兽医临床应用党参来防治由细菌感染所致的急性肺损伤和相关新兽药的研发提供理论依据㊂1材料与方法1.1主要试剂、药品及抗体本研究使用的C P P S由内蒙古农业大学兽医学院高珍珍博士馈赠,C P P S的结构表征(分子量5.3~230.6k u),主要由G a l㊁A r a和G l u组成[12]㊂I L-1β和T N F-α的E L I S A试剂盒均购自B i o l e g e n d 公司;胎牛血清(F B S)购自E x C e l l B i o l o g y公司; R P M I1640培养基和磷酸盐缓冲液(P B S)均购自H y C l o n g公司;无酶水(D N a s e/R N a s e-F r e e D e i o n-i z e d W a t e r)购自T i a n g e n公司;牛血清白蛋白(B S A)购自B D B i o s c i e n c e s公司;酵母提取物(y e a s t e x t r a c t)和胰蛋白胨(t r y p t o n e)均购自O x o i d公司;吐温-20(T w e e n-20)购自S o l a r b i o公司;兔抗高迁移率族蛋白B1(HMG B1/HMG1)购自N O-V U S B I O公司;G A P D H抗体和山羊抗兔(A l e x a F l u o r488)二抗均购自A b c a m公司;组织裂解液购自T h e r m o S c i e n t i f i c公司;p65㊁P-p65㊁p38㊁P-p38㊁E R K和P-E R K抗体均购自C e l l S i g n a l i n g T e c h-n o l o g y公司,H R P标记山羊抗兔二抗购自A f f i n i t yB i o s c i e n c e s公司㊂1.2细菌培养野生型大肠杆菌(鉴定证书号S Y S110017)由本课题组分离鉴定保存㊂将在-80ħ低温保存的菌液在4ħ环境中融化后,转移至100m L已灭菌的L B肉汤培养基中,在37ħ,200r㊃m i n-1于恒温摇床中连续培养12h㊂根据本课题组前期研究数27538期巩志国等:基于网络药理学分析党参减轻大肠杆菌感染小鼠急性肺损伤的作用机制据,使用酶标仪检测菌液600n m波长处的吸光值大约为0.9时,表明其处于对数生长期㊂将菌液混匀后取1m L置于无菌无酶离心管中,3000r㊃m i n-1离心6m i n,弃掉上清,用无菌P B S溶液重悬菌液3次,最后使用1m L P B S缓冲液重悬细菌,4ħ保存备用[13]㊂1.3党参有效成分和靶点的获取及靶点网络关系图的构建本研究利用中药系统药理学分析平台T C M S P (h t t p s:ʊo l d.t c m s p-e.c o m/i n d e x.p h p)检索词党参 ,以口服利用度ȡ30%,类药性ȡ0.18进行初步筛选后,再按L i p i n s k五原则相对分子质量ɤ500,氢给体数目<5,氢受体数目<10,脂水分配系数<5进行再次筛选㊂通过U n i p r o t(h t t p s:ʊw w w.u n i-p r o t.o r g/)和P u b C h e m(h t t p s:ʊp u b c h e m.n c b i. n l m.n i h.g o v/)获取T C M S P数据库筛出的活性成分所对应的靶点㊂将筛选好的活性成分及其靶点输入C y t o s c a p e中,构建党参的中药-化合物-靶点网络图㊂1.4急性肺损伤靶点的获取及关键靶点筛选以 a c u t e l u n g i n j u r y 为检索词,使用G e n e-C a r d s(h t t p s:ʊw w w.g e n e c a r d s.o r g/)和D i s G e N-E T(h t t p s:ʊw w w.d i s g e n e t.o r g/)数据库进行检索,得到急性肺损伤的相关靶点,使用微生信平台(h t t p:ʊw w w.b i o i n f o r m a t i c s.c o m.c n/)绘制韦恩图将党参活性成分的靶点与急性肺损伤的靶点取交集,将交集靶点导入S T R I N G(h t t p s:ʊc n.s t r i n g-d b.o r g/)数据库,选择物种 H o m o s a p i e n s ,将最低交互要求分数设置为置信度大于0.700,且隐藏网络中断开连接的节点,构建P P I网络图㊂1.5G O富集及K E G G分析将党参与急性肺损伤的交集靶点导入D A V I D (h t t p s:ʊd a v i d.n c i f c r f.g o v/)数据库,选择物种 H o m o s a p i e n s 随后得到G O富集和K E G G通路,运用微生物平台进行可视化分析㊂1.6实验动物及分组本试验所用实验动物为C57B L/6J小鼠购自内蒙古大学实验动物中心,本研究选用8周龄,体重23gʃ2g㊂随机将小鼠分组,每组10只,即阴性对照组(u n i n f e c t e d)㊁E.c o l i感染组㊁C P P S(40㊁100或250m g㊃k g-1)+E.c o l i处理组㊁地塞米松(D E X)+E.c o l i阳性对照组㊂体内试验感染前1h腹腔注射C P P S (40㊁100㊁250m g㊃k g-1),地塞米松(0.5m g㊃k g-1)㊂菌液用P B S洗涤3次,重悬备用,鼻腔滴注30μL菌液,大肠杆菌感染12h后处死小鼠,收集肺,将肺组织研磨后取上清㊂体外细胞试验巨噬细胞使用C P P S(6.25㊁12.5㊁25㊁50μg㊃m L-1)预处理1h后,使用大肠杆菌感染巨噬细胞(MO I5ʒ1),感染1h 后,使用P B S清洗3次,随后用含有10m g㊃m L-1卵清蛋白和20U㊃m L-1干扰素的新鲜培养基清洗细胞3次,再用P B S清洗3次,培养至24h收集上清㊂按照E L I S A试剂盒说明书检测组织和细胞上清中的T N F-α和I L-1β的水平㊂1.7小鼠腹腔巨噬细胞培养和试验处理小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养方法基于本课题组先前的研究[14]㊂小鼠腹腔注射3%T G培养基2m L㊂腹腔注射3%T G培养基3d后处死小鼠㊂沿腹部中线将小鼠皮肤组织剪开,暴露腹膜㊂用无菌P B S缓慢注射到小鼠腹腔并晃动小鼠2m i n,随后吸取小鼠腹腔灌注液,直至吸取得腹腔灌注液澄清透明㊂将腹腔灌注液1000r㊃m i n-1离心5m i n 后弃掉上清,用无菌P B S进行重悬细胞,重复此步骤3次㊂用含10%胎牛血清的R P M I1640培养基重悬细胞,并将细胞浓度调至5ˑ106㊃孔-1,置于5%C O2,温度37ħ细胞培养箱中培养过夜㊂1.8总蛋白提取和W e s t e r n b l o t分析将巨噬细胞使用C P P S(6.25㊁12.5㊁25㊁50μg㊃m L-1)预处理1h后,使用大肠杆菌感染巨噬细胞(MO I5ʒ1),感染时间15和30m i n㊂随后进行总细胞蛋白提取,用200μL M-P E R处理巨噬细胞10m i n后使用细胞刮刀收获贴壁细胞㊂用B C A 试剂盒测定蛋白样品的浓度㊂W e s t e r n b l o t分析采用12%S D S聚丙烯酰胺凝胶,电泳时每泳道总蛋白10μg㊂随后进行膜转印㊂随后用含3%B S A的封闭液封闭P V D F膜4h,然后在4ħ条件下孵育一抗14h㊂一抗稀释比例如下:p65㊁P-p65㊁p38㊁P-p38㊁E R K和P-E R K稀释比例均为1ʒ1000,G A P-D H稀释比例1ʒ10000㊂一抗孵育完成后,用T B S T缓冲液清洗3次,室温孵育兔二抗(1ʒ3000稀释)1h㊂然后用T B S T清洗3次㊂用化学发光底物和化学发光成像系统进行图像的采集,通过I m-a g e J软件对试验结果灰度值进行分析㊂1.9免疫荧光检测和形态学观察采集小鼠肺在液氮中速冻,-80ħ保存,修块,用O T C包埋剂将修好的组织块包埋,冰冻切片机切片,厚度为6~10μm,4或-20ħ保存,切片放置3753畜牧兽医学报54卷室温15m i n干燥,冷丙酮固定10m i n,冷P B S洗2次,每次5m i n,用5%的B S A封闭1h,吸除多余的液体,4ħ孵育HMG B1抗体过夜㊂次日,用含P B S T洗3次,每次5m i n,室温孵育荧光二抗1h,用含P B S T洗3次,每次5m i n㊂随后使用激光共聚焦显微镜采集荧光强度㊂收集小鼠肺制备石蜡切片,用不同浓度的酒精(100%㊁75%㊁50%和25%)脱水㊂苏木精㊁伊红(H&E)染色后,扫描观察肺病理变化㊂1.10统计分析所有数据使用G r a p h P a d P r i s m8软件统计并进行差异性分析(3次重复试验数据 x-ʃs ,O n e-W a y A N O V A),以*.P<0.05;**.P<0.01;***. P<0.001表示与大肠杆菌组相比较,以#.P< 0.05表示与空白对照组相比较㊂2结果2.1党参的活性成分及靶点从T C M S P数据库中共筛选出8种符合要求的活性化学成分,如表1所示㊂同时找到党参活性成分对应靶点对应的急性肺损伤靶点交集119个,运用C y t o s c a p e软件构建网络图,如图1所示㊂表1党参的主要活性成分T a b l e1M a i n a c t i v e c o m p o n e n t s o f C o d o n o p s i s p i l o s u l a编号N o.分子标识M o l e c u l a rm a r k e r化合物C h e m i c a lc o m p o u n d口服利用度O r a la v a i l ab i l i t y类药性D r u g-l i k e n e s s相对分子质量M r氢给体数目N u m b e r o fh y d r o g e nd o n o r s氢受体数目N u m b e r o fh y d r o g e na c c e p t o r s脂水分配系数L i p o-h y d r op a r t i t i o nc o e f f i c i e n tC P1MO L0070593-β-h y d r o x y m e t h y l-l e n e t a n s h i q u i n o n e 32.160.41294.32143.16C P2MO L0038967-m e t h o x y-2-m e t h y l i s o f l a v o n e 42.560.20266.31033.36C P3MO L00841111-h y d r o x y r a n k i n i d i n e40.000.66356.46261.04C P4MO L008397D a t u r i l i n50.370.77436.64044.34C P5MO L005321F r u t i n o n e A65.900.34264.24042.70C P6MO L008400G l y c i t e i n50.480.24284.28252.32C P7MO L000006L u t e o l i n36.160.25286.25462.07C P8MO L002140P e r l o l y r i n e65.950.27264.30233.20(图1转下页)(F i g.1 C o n t i n u e d o n t h e n e x t p a g e) 47538期巩志国等:基于网络药理学分析党参减轻大肠杆菌感染小鼠急性肺损伤的作用机制(续图1 C o n t i n u e d)红色椭圆.党参;绿色三角.党参活性成分;橙色方形.靶点R e d o v a l.C o d o n o p s i s p i l o s u l a;G r e e n t r i a n g l e.C o d o n o p s i s p i l o s u l a a c t i v e c o m p o u n d;O r a n g e s q u a r e.T a r g e t 图1党参中药-化合物-靶点网络F i g.1C o d o n o p s i s p i l o s u l a"t r a d i t i o n a l C h i n e s e m e d i c i n e-c o m p o u n d-t a r g e t"n e t w o r k2.2党参治疗急性肺损伤的潜在靶点及蛋白互作(P P I)网络分析通过疾病相关数据库筛选出1522个与急性肺损伤相关的靶点,其中与党参的交集靶点共119个,并绘制P P I图发现党参与急性肺损伤的靶点与N F-κB㊁M A P K和T L R4之间存在紧密关联,如图2所示㊂图2党参治疗急性肺损伤的潜在靶点及P P I网络分析F i g.2P o t e n t i a l t a r g e t a n d P P I n e t w o r k a n a l y s i s o f C o d o n o p s i s p i l o s u l a i n t r e a t i n g A L I2.3富集分析通过富集筛选与急性肺损伤相关的生物过程和分子功能,结果如图3所示㊂生物过程主要包括肽基酪氨酸磷酸化,跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路,蛋白质磷酸化,MA P K级联的正调控,激酶活性正调控和蛋白质自磷酸化等㊂此外,分子功能主要包括跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性,蛋白酪氨酸激酶活性,A T P结合和蛋白激酶活性等㊂K E G G通路富集分析表明,N F-κB信号通路㊁MA P K信号通路和T N F信号通路等信号通路在党参治疗中发挥关键作用㊂57536753畜牧兽医学报54卷8期巩志国等:基于网络药理学分析党参减轻大肠杆菌感染小鼠急性肺损伤的作用机制2.4党参多糖对大肠杆菌诱导巨噬细胞中M A P K 和N F-κB信号通路激活及炎症因子分泌的影响探究C P P S对大肠杆菌诱导的巨噬细胞中MA P K和N F-κB信号通路激活的影响,以及对促炎性细胞因子T N F-α和I L-1β分泌水平的影响㊂结果表明,大肠杆菌感染可诱导巨噬细胞分泌高水平的T N F-α和I L-β,如图4所示㊂C P P S(6.25㊁12.5㊁25和50μg㊃m L-1)预处理均能降低大肠杆菌感染后巨噬细胞T N F-α和I L-1β的分泌㊂此外,与大肠杆菌感染后15和30m i n相比,C P P S预处理组E R K㊁p65和p38磷酸化水平明显降低,如图4所示㊂上述结果表明在大肠杆菌感染过程中,C P P S 可影响巨噬细胞MA P K信号通路中p38和E R K 以及N F-κB信号通路中p65的激活,以及促炎性细胞因子和趋化因子的分泌㊂与大肠杆菌组相比,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;与空白对照组相比,#.P<0.05C o m p a r e d w i t h t h e E s c h e r i c h i a c o l i g r o u p,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;C o m p a r e d w i t h t h e b l a n k c o n t r o l g r o u p,#.P<0.05图4党参多糖对大肠杆菌诱导巨噬细胞中M A P K和N F-κB信号通路激活及炎症因子分泌的影响F i g.4E f f e c t o f C P P S o n a c t i v a t i o n o f M A P K a n d N F-κB s i g n a l i n g p a t h w a y s a n d s e c r e t i o n o f i n f l a m m a t o r y f a c t o r s i n E.c o l i-i n f e c t e d m a c r o p h a g e s2.5党参多糖对大肠杆菌感染诱导的小鼠体内炎性细胞因子T N F-α和I L-1β产生的影响C P P S预处理C57B L/6J野生型小鼠后,检测炎性细胞因子T N F-α和I L-1β分泌的情况㊂如图5所示,C P P S预处理可显著下调大肠杆菌感染诱导的小鼠肺中T N F-α㊁I L-1β的产生㊂上述结果表明,7753畜牧兽医学报54卷与大肠杆菌组相比,*.P <0.05,**.P <0.01,***.P <0.001;与空白对照组相比,#.P <0.05C o m p a r e d w i t h t h e E s c h e r i c h i a c o l i g r o u p ,*.P <0.05,**.P <0.01,***.P <0.001;C o m pa r e d w i t h t h eb l a n kc o n t r o l g r o u p ,#.P <0.05图5 C P P S 对大肠杆菌感染诱导的小鼠体内炎性细胞因子T N F -α和I L -1β产生中的影响F i g .5 E f f e c t o f C P P S o n t h e p r od u c t i o n o f i n f l a m m a t o r y c yt o k i n e s T N F -αa n d I L -1βi n E .c o l i -i n f e c t e d m i c e C P P S 可降低大肠杆菌感染诱导的炎性细胞因子的产生,且具有剂量依赖性㊂2.6 党参多糖对大肠杆菌诱导损伤标记物H M G B 1蛋白表达和肺病理损伤的影响 C 57B L /6J 小鼠腹腔注射C P P S 预处理后,用1ˑ108C F U 大肠杆菌鼻腔滴注小鼠后取肺组织,检测小鼠肺中HMG B 1的表达情况,如图6所示㊂相比于未处理组,使用C P P S 处理组小鼠在大肠杆菌感染时肺组织的荧光强度中位数较低,提示HMG B 1表达处于较低水平㊂此外,通过H E 染色结果可观察到对照组小鼠肺基本正常,未见明显病理变化,而大肠杆菌感染组病变较为严重,表现为大部分肺泡间质变宽,有的区域可见大量中性粒细胞渗出,当使用C P P S 预处理后,再使用大肠杆菌感染肺损伤程度显著下调,表现为部分区域肺泡间质稍有增宽,轻度淤血㊂上述结果表明,C P P S 可下调大肠杆菌感染诱导的肺中HMG B 1的表达并可减轻肺的损伤㊂与大肠杆菌组相比,*.P <0.05,**.P <0.01,***.P <0.001;与空白对照组相比,#.P <0.05C o m p a r e d w i t h t h e E s c h e r i c h i a c o l i g r o u p ,*.P <0.05,**.P <0.01,***.P <0.001;C o m pa r e d w i t h t h eb l a n kc o n t r o l g r o u p ,#.P <0.05图6 C P P S 对大肠杆菌诱导损伤标记物HM G B 1蛋白表达和肺病理损伤的影响F i g .6 E f f e c t o f C P P S o n t h e e x p r e s s i o n o f HM G B 1i n j u r y m a r k e r p r o t e i n i nd u ce d b y E .c o l i a n d l u n g p a t h o l o g i c a l i n j u r y3 讨论急性肺损伤(a c u t e l u n g i n j u r y,A L I )是一种严重的呼吸系统疾病,目前缺乏有效的治疗方法导致死亡率较高[15-16]㊂A L I 的特征是肺间隙和肺实质中无法控制的高炎症反应,包括肺泡毛细血管膜损伤㊁血管通透性增加和中性粒细胞募集增多[17]㊂党参作为一种常用中药具有补中益气和健脾益肺的功效[18]㊂研究表明,党参在防治慢性阻塞性肺,呼吸窘迫综合征和间质性肺病等肺部相关疾病具有重要作用[19-21]㊂但党参对A L I 的作用目前尚不清楚,因此本研究通过网络药理学和分子生物学试验相结合的87538期巩志国等:基于网络药理学分析党参减轻大肠杆菌感染小鼠急性肺损伤的作用机制方式探究党参对A L I的作用机制,以期为兽医临床防治急性肺损伤及相关新兽药的研发提供理论依据㊂本研究发现党参发挥作用的网络中核心靶点主要包括P T G S1㊁P T G S2㊁I L2㊁P D G F R A㊁J A K3㊁J A K2㊁J A K1㊁C X C R1㊁C X C R2㊁N O S1㊁T G F B R1㊁M I F㊁T L R4㊁T L R9㊁Z A P70㊁MA P K1㊁MA P K8㊁M A P K10㊁M A P K14㊁M A P2K1㊁N F K B1㊁H S P90A A1㊁P P A R A㊁M P O㊁P L G等㊂前列腺素在炎症反应的产生中起着关键作用,在炎症组织中的生物合成显著增加,并有促进急性炎症的发展,因此被认为是一种高效的炎性介质[22]㊂P T G S1和P T G S2基因编码的环加氧酶C O X-1和C O X-2催化前列腺素合成的速率限制步骤,这是炎症的关键调节因子[23]㊂众所周知,J a n u s激酶(J A K1㊁J A K2和J A K3)是多种细胞因子信号通路的重要介质,存在于正常的细胞过程和免疫介导的炎症[24]㊂大量研究表明,白细胞介素-8(C X C L8/I L-8)受体趋化因子受体1型(C X-C R1)和趋化因子受体2型(C X C R2)可作为A L I的潜在治疗靶点[25]㊂M I F参与了L P S诱导的A L I的发病机制,可能是A L I的治疗靶[26]㊂哺乳动物细胞中,有4组主要的传统MA P K s信号通路E R K1/2 (分别称为MA P K3和MA P K1)㊁E R K5㊁J N K s (J N K1㊁J N K2和J N K3)分别称为(MA P K8㊁MA P K9和MA P K10)和p38MA P K s(p38a l p h a㊁p38b e t a㊁p38g a mm a和p38d e l t a分别称为(MA P K14㊁MA P K11㊁MA P K12和MA P K13)[27]㊂M P O参与了包括在A L I内的多种疾病,如严重脓毒症和A R D S㊂综上所述,本文通过网络药理学方法得到的核心基因可从调节炎症反应㊁炎症信号通路相关基因表达等方面在急性肺损伤过程中发挥关键作用㊂通过G O和K E G G富集分析发现,党参防治急性肺损伤的靶基因主要参与MA P K级联活化密切相关㊁膜受体蛋白酪氨酸激酶活性㊁蛋白质结合和A T P结合等相关生物功能,而且相关靶基因主要富集在MA P K㊁N F-κB和T N F等信号通路中㊂研究表明,包括A L I在内的各种炎症性疾病均涉及巨噬细胞通过N F-κB或MA P K信号通路介导细胞因子(如T N F-α㊁I L-6和I L-1β),以及炎症介质(如N O 和P G E2)表达[28]㊂然而,党参是否通过以上关键通路调节急性肺损伤,还有待进一步的验证㊂大量研究表明,大肠杆菌感染可诱导A L I[9]㊂本研究使用大肠杆菌感染建立小鼠A L I模型㊂C P P S是党参提取的一种多糖,具有广泛的生物活性和药理作用,包括免疫调节㊁清除自由基㊁造血等[12,29]㊂C P P S在炎症反应㊁疾病的预防和治疗等方面被广泛应用[30]㊂研究表明,在大肠杆菌感染过程中可激活M A P K和N F-κB信号通路进而介导炎症介质的分泌[31]㊂C P P S对L P S诱导的R A W264.7细胞炎症因子分泌具有调控作用,且可减轻了葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎的临床症状[32]㊂上述网络药理学研究结果表明,N F-κB或MA P K信号通路在急性肺损伤中具有重要作用,因此通过W e s t e r n b l o t检测C P P S对大肠杆菌诱导MA P K和N F-κB信号通路激活的影响㊂结果表明,C P P S可减弱大肠杆菌感染诱导的MA P K(p38和E R K)和N F-κB(p65)的激活㊂MA P K和N F-κB 信号通路激活减弱预示炎症反应转归[33]㊂此外,当细胞破损HMG B1释放到细胞外可引起炎症,并刺激先天免疫细胞迁移和激活,因此将其作为组织损伤相关分子模式成员之一[34]㊂在A L I发生是促炎反应的增加和抗炎反应的减少,大量的炎症细胞因子(如I L-6和T N F-α)被分泌出来,导致细胞因子风暴的发展,从而导致呼吸衰竭[35]㊂结果表明,C P P S 可降低肺中T N F-α和I L-1β的分泌以及HMG B1的表达,因此C P P S对大肠杆菌感染所致急性肺损伤具有保护作用㊂4结论党参可通过下调MA P K(p38和E R K)和N F-κB(p65)炎症信号通路的激活对T N F-α和I L-1β的分泌进行调控,从而降低肺的损伤程度及病理变化㊂此外,党参多糖对大肠杆菌诱导的急性肺损伤具有较好的防治作用,但具体作用机制还需进一步研究㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] L U A N F,J I Y F,P E N G L X,e t a l.E x t r a c t i o n,p u r i f i c a t i o n,s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d b i o l o g i c a lp r o p e r t i e s o f t h e p o l y s a c c h a r i d e s f r o m C o d o n o p s i sp i l o s u l a:a r e v i e w[J].C a r b o h y d r P o l y m,2021,261:117863.[2] D E N G X L,F U Y J,L U O S,e t a l.P o l y s a c c h a r i d ef r o m r a d i x c o d o n o p s i s h a s b e n e f i c i a l e f f e c t s o n t h em a i n t e n a n c e o f T-c e l l b a l a n c e i n m i c e[J].B i o m e dP h a r m a c o t h e r,2019,112:108682.[3]张彦琼,李梢.网络药理学与中医药现代研究的若干进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2015,299753畜牧兽医学报54卷(6):883-892.Z HA N G Y Q,L I S.P r o g r e s s i n n e t w o r kp h a r m a c o l o g y f o r m o d e r n r e s e a r c h o f t r a d i t i o n a lC h i n e s e m e d i c i n e[J].C h i n J P h a r m a c o l T o x i c o l,2015,29(6):883-892.(i n C h i n e s e)[4] K U L K A R N I H S,L E E J S,B A S T A R A C H E J A,e ta l.U p d a t e o n t h e f e a t u r e s a n d m e a s u r e m e n t s o fe x p e r i m e n t a l a c u t e l u n g i n j u r y i n a n i m a l s:a n of f i c i a lA m e r i c a n t h o r a c i c s o c i e t y w o r k s h o p r e p o r t[J].A m JR e s p i r C e l l M o l B i o l,2022,66(2):e1-e14.[5] F U Y H,L I U B,L I U J H,e t a l.G e n i p o s i d e,f r o mG a r d e n i a j a s m i n o i d e s E l l i s,i n h i b i t s t h e i n f l a m m a t o r yr e s p o n s e i n t h e p r i m a r y m o u s e m a c r o p h a g e s a n d m o u s em o d e l s[J].I n t I mm u n o p h a r m a c o l,2012,14(4):792-798.[6] T O L L E L B,S T A N D I F O R D T J.D a n g e r-a s s o c i a t e dm o l e c u l a r p a t t e r n s(D AM P s)i n a c u t e l u n g i n j u r y[J].J P a t h o l,2013,229(2):145-156.[7]车玉虎,刘志,董雪松,等.大肠杆菌气管注入致急性肺损伤的实验研究[J].中国医科大学学报,2006,35(3):262-264.C H E Y H,L I U Z,D O N G X S,e t a l.A c u t e l u n gi n j u r y i n d u c e d b y i n t r a t r a c h e a l i n s t i l l a t i o n o fE s c h e r i c h i a c o l i i n r a b b i t s[J].J C h i n a M e d U n i v,2006,35(3):262-264.(i n C h i n e s e)[8] WU H Y,Y A N G J,S U E M,e t a l.L i p o x i n A4a n dp l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r a r e i n v o l v e d i n E.c o l i o rL P S-i n d u c e d l u n g i n f l a mm a t i o n i n C F T R-d e f i c i e n tm i c e[J].P L o S O n e,2014,9(3):e93003.[9] K E S HA R I R S,S I L A S I-MA N S A T R,Z HU H,e ta l.A c u t e l u n g i n j u r y a n d f ib r o s i s i n a b a b o o n m o d e lo f E s c h e r i c h i a c o l i s e p s i s[J].A m J R e s p i r C e l l M o lB i o l,2014,50(2):439-450.[10] S A F F A R Z A D E H M,J U E N E MA N N C,Q U E I S S E RM A,e t a l.N e u t r o p h i l e x t r a c e l l u l a r t r a p s d i r e c t l yi n d u c e e p i t h e l i a l a n d e n d o t h e l i a l c e l l d e a t h:ap r e d o m i n a n t r o l e o f h i s t o n e s[J].P L o S O n e,2012,7(2):e32366.[11] M O U R A T I S M A,M A G K R I O T I C,O I K O N O M O UN,e t a l.A u t o t a x i n a n d e n d o t o x i n-i n d u c e d a c u t e l u n gi n j u r y[J].P L o S O n e,2015,10(7):e0133619.[12] G A O Z Z,Z HA N G C,J I N G L R,e t a l.T h es t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n a n d i mm u n e m o d u l a t i o na c t i v i t i v e s c o m p a r i s o n o f C o d o n o p s i s p i l o s u l ap o l y s a c c h a r i d e(C P P S)a n d s e l e n i z i n g C P P S(s C P P S)o n m o u s e i n v i t r o a n d v i v o[J].I n t J B i o lM a c r o m o l,2020,160:814-822.[13]巩志国,顾柏臣,沈媛,等.布劳恩脂蛋白对大肠埃希氏菌感染导致的小鼠体内细胞因子分泌及死亡的调节作用[J].动物医学进展,2022,43(2):25-29.G O N G Z G,G U B C,S H E N Y,e t a l.R e g u l a t i o n o fB r a u n l i p o p r o t e i n o n c y t o k i n e s e c r e t i o n a n d d e a t h i nE s c h e r i c h i a c o l i-i n f e c t e d m i c e[J].P r o g V e t M e d,2022,43(2):25-29.(i n C h i n e s e)[14] WU J D,L I U B,MA O W,e t a l.P r o s t a g l a n d i n E2r e g u l a t e s a c t i v a t i o n o f m o u s e p e r i t o n e a l m a c r o p h a g e sb y S t a p h y l oc o c c u s a u r e u s t h r o u g h t o l l-l i k e r e c e p t o r2,t o l l-l i k e r e c e p t o r4,a n d N L R P3i n f l a mm a s o m es i g n a l i n g[J].J I n n a t e I mm u n,2020,12(2):154-169.[15] F L O R I A N M,WA N G J P,D E N G Y P,e t a l.G e n ee n g i n e e r e d m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s:g r e a t e r t r a n s g e n ee x p r e s s i o n a n d ef f i c a c y w i t h m i n i c i r c l e v s.p l a s m i dD N A v e c t o r s i n a m o u s e m o d e l o f a c u t e l u n g i n j u r y[J].S t e m C e l l R e s T h e r,2021,12(1):184. [16] M E Y E R N J,G A T T I N O N I L,C A L F E E C S.A c u t er e s p i r a t o r y d i s t r e s s s y n d r o m e[J].L a n c e t,2021,398(10300):622-637.[17] WH E E L E R A P,B E R N A R D G R.A c u t e l u n g i n j u r ya n d t h e a c u t e r e s p i r a t o r y d i s t r e s s s y n d r o m e:a c l i n i c a lr e v i e w[J].L a n c e t,2007,369(9572):1553-1564.[18]张建军,胡春玲.中药党参研究的现代进展[J].甘肃高师学报,2017,22(3):39-43.Z HA N G J J,HU C L.A d v a n c e s o f m o d e r n i ns t u d i e s o n c o d o n o p s i s p i l o s u l a[J].J o u r n a l o f G a n s uN o r m a l C o l l e g e s,2017,22(3):39-43.(i n C h i n e s e) [19]白娟,邱桐.党参治疗呼吸窘迫综合征的实验研究-肺泡-动脉血氧分压差和气-血屏障的变化[J].甘肃中医学院学报,1994,11(1):50-52.B A I J,Q I U T.E f f e c t s o f c o d o n o p s i s o n c h a n g e s o fa l v e o l a r-a r t e r i a l o x y g e n g r a d i e n t a n db l o o d-a i r b a r r i e ri n r a t s w i t h r e s p i r a t o r y d i s t r e s s s y n d r o m e[J].J o u r n a l G a n s u C o l l e g e o f T C M,1994,11(1):50-52.(i n C h i n e s e)[20]郭鹏翔,杨扶德,王志旺,等.党参对慢性阻塞性肺疾病小鼠肿瘤坏死因子-α与核转录因子-κB信号通路的影响[J].中国临床药理学杂志,2022,38(16):1930-1934,1944.G U O P X,Y A N G F D,WA N G Z W,e t a l.E f f e c t so f c o d o n o p s i s r a d i x o n t u m o r n e c r o s i s f a c t o r-α/n u c l e a r f a c t o r-κB s i g n a l i n g p a t h w a y i n m i c e w i t hc h r o n i c o b s t r u c t i v e p u l m o n a r yd i se a s e[J].T h eC h i n e s e J o u r n a l o f C l i n i c a l P h a r m a c o l o g y,2022,38(16):1930-1934,1944.(i n C h i n e s e)08538期巩志国等:基于网络药理学分析党参减轻大肠杆菌感染小鼠急性肺损伤的作用机制[21]王玉冰.党参对博莱霉素致间质性肺病大鼠的作用机制研究[D].济南:山东中医药大学,2015.WA N G Y B.T h e m e c h a n i s m o f D a n g s h e n o nb l e o m yc i n-i nd u ce d i n t e r s t i t i a l l u n g d i s e a s e of r a t s[D].J i'n a n:S h a n d o n g U n i v e r s i t y o f T r a d i t i o n a lC h i n e s e M e d i c i n e,2015.(i n C h i n e s e)[22] R I C C I O T T I E,F I T Z G E R A L D G A.P r o s t a g l a n d i n sa n d i n f l a mm a t i o n[J].A r t e r i o s c l e r T h r o mb V a s cB i o l,2011,31(5):986-1000.[23] V O G E L L K,SÆB M,H Y E R H,e t a l.I n t e s t i n a lP T G S2m R N A l e v e l s,P T G S2g e n e p o l y m o r p h i s m s,a n d c o l o r e c t a l c a r c i n o g e n e s i s[J].P L o S O n e,2014,9(8):e105254.[24] R AW L I N G S J S,R O S L E R K M,HA R R I S O N D A.T h e J A K/S T A T s i g n a l i n g p a t h w a y[J].J C e l l S c i,2004,117(8):1281-1283.[25] L A N D O N I G,P I E MO N T I L,MO N F O R T E A D A,e t a l.A m u l t i c e n t e r p h a s e2r a n d o m i z e d c o n t r o l l e ds t u d y o n t h e e f f i c a c y a n d s a f e t y o f r e p a r i x i n i n t h et r e a t m e n t o f h o s p i t a l i z e d p a t i e n t s w i t h C O V I D-19P n e u m o n i a[J].I n f e c t D i s T h e r,2022,11(4):1559-1574.[26] H A O J,L V T G,X U L P,e t a l.M a c r o p h a g em i g r a t i o n i n h i b i t o r y f a c t o r i s i n v o l v e d i n a n t i n e u t r o p h i lc y t o p l a s m i c a n t i b od y-me d i a t e d a c t i v a t i o n of C5a-p r i m e dn e u t r o p h i l s[J].B M C I mm u n o l,2019,20(1):22.[27] B OHU S H A,N I E W I A D OM S K A G,F I L I P E K A.R o l e o f m i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e s i g n a l i n g i nP a r k i n s o n's d i s e a s e[J].I n t J M o l S c i,2018,19(10):2973.[28] F A N C,WU L H,Z HA N G G F,e t a l.4'-H y d r o x y w o g o n i n s u p p r e s s e s l i p o p o l y s a c c h a r i d e-i n d u c e d i n f l a mm a t o r y r e s p o n s e s i n R AW264.7m a c r o p h a g e s a n d a c u t e l u n g i n j u r y m i c e[J].P L o SO n e,2017,12(8):e0181191.[29] M I N G K,H E M,S U L L,e t a l.T h e i n h i b i t o r ye f f e c t o f p h o s p h o r y l a t e d C o d o n o p s i s p i l o s u l ap o l y s a c c h a r i d e o n a u t o p h a g o s o m e s f o r m a t i o nc o n t r i b u t e s t o t h e i n h i b i t i o n o fd u c k he p a t i t i s A v i r u sr e p l i c a t i o n[J].P o u l S c i,2020,99(4):2146-2156.[30]郜艳雪,时坤,李健明,等.党参多糖对动物免疫调节作用研究进展[J].动物医学进展,2019,40(9):103-106.G A O Y X,S H I K,L I J M,e t a l.A d v a n c e o ni mm u n o r e g u l a t i o n e f f e c t o f C o d o n o p s i s p i l o s u l ap o l y s a c c h a r i d e s[J].P r o g r e s s i n V e t e r i n a r yM e d i c i n e,2019,40(9):103-106.(i n C h i n e s e)[31] P E A R S O N J S,HA R T L A N D E L.T h ei n f l a mm a t o r y r e s p o n s e d u r i n g e n t e r o h e m o r r h a g i cE s c h e r i c h i a c o l i i n f e c t i o n[J].M i c r o b i o l S p e c t r,2014,2(4):E H E C-0012-2013.[32] M E N G Y,X U Y J,C HA N G C,e t a l.E x t r a c t i o n,c h a r a c t e r i z a t i o n a nd a n t i-i n f l a mm a t o r y a c t i v i t ie s of a ni n u l i n-t y p e f r u c t a n f r o m C o d o n o p s i s p i l o s u l a[J].I n tJ B i o l M a c r o m o l,2020,163:1677-1686. [33] HO B B S S,R E Y N O S O M,G E D D I S A V,e t a l.L P S-s t i m u l a t e d N F-κB p65d y n a m i c r e s p o n s e m a r k st h e i n i t i a t i o n o f T N F e x p r e s s i o n a n d t r a n s i t i o n t o I L-10e x p r e s s i o n i n R AW264.7m a c r o p h a g e s[J].P h y s i o l R e p,2018,6(21):e13914.[34] L O T Z E M T,T R A C E Y K J.H i g h-m o b i l i t y g r o u pb o x1p r o t e i n(HMG B1):n uc l e a r w e a p o n i n t h ei mm u n e a r s e n a l[J].N a t R e v I mm u n o l,2005,5(4):331-342.[35] C H E N S S,X I A J G,Z HA N G Y,e t a l.I L35a t t e n u a t e d L P S-i n d u c e d a c u t e l u n g i n j u r yb yr e g u l a t i n g m a c r o p h a g e p o l a r i z a t i o n[J].M o l B i o lR e p,2022,49(7):5811-5820.(编辑白永平)1853。

wp_240768786基因在大肠杆菌中的过表达实验的实验内容

wp_240768786基因在大肠杆菌中的过表达实验的实验内容基因在大肠杆菌中的过表达实验是一种常用的实验方法，通过引入外源表达载体，将感兴趣的基因在大肠杆菌中过量表达，从而研究该基因在生物体中的功能、调控机制和相互作用等方面的问题。

本文将介绍基因在大肠杆菌中过表达实验的实验内容。

一、实验前的准备工作1.选择合适的表达载体：通常采用静态表达载体，如pUC19，pBluescript等，或动态表达载体，如pET系列，pGEX系列等。

2.克隆目标基因：使用PCR或其他克隆方法从原始样本中扩增出目标基因，并通过酶切与载体连接。

3.转化大肠杆菌：利用热激转化、电穿孔转化等方法将重组载体转化到大肠杆菌中。

二、基因克隆与构建表达载体1.通过PCR扩增基因：设计引物，利用PCR技术从模板DNA中扩增目标基因。

2.准备载体：选择适当的表达载体，并通过限制性内切酶酶切开，以便与PCR扩增的基因片段连接。

3.构建重组载体：将PCR扩增的目标基因片段与线性化的载体连接，利用连接酶如T4 DNA连接酶处理，并通过热激转化等方法将重组载体转化到大肠杆菌中。

三、大肠杆菌中的基因过表达1.筛选阳性克隆：将转化后的大肠杆菌克隆在含有适当抗生素的培养基上培养，选择阳性克隆并进行验证。

2.静态表达或动态表达：根据需要选择适当的表达载体和表达系统。

四、鉴定表达产物1.确定表达水平：通过聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质质谱、Western blot、酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法，检测表达基因的存在和表达水平。

2.验证表达产物功能：通过下游分析，如活性酶测定、免疫组化、免疫印迹等方法，评估过表达产物的功能和活性。

五、研究过表达基因的功能和调控机制1.功能研究：通过过表达基因后的表型观察，如细胞生长、代谢物产量、酶活性增加等，评估基因表达对细胞生理过程的影响。

2.亚细胞定位：通过融合表达产物与荧光标记或标示剂相结合等方法，观察基因表达产物在细胞中的定位，从而推测其功能和组织定位。

大肠杆菌

大肠杆菌（Escherichia coil）是我们了解得最清楚的原核生物，它为分子生物学的发展做出了巨大的贡献。

本文简要介绍大肠杆菌的细胞壁、细胞膜、细胞核、质粒、核糖体、鞭毛等结构与功能以及大肠杆菌的产能方式和生化反应。

大肠杆菌（Escherichia coli）在自然界分布很广，是人和动物肠道中的正常菌群。

正常情况下一般不致病，但它是条件致病菌。

大肠杆菌是单细胞原核生物，具有原核生物的主要特征：细胞核为拟核，无核膜，细胞质中缺乏象高等动植物细胞中的线粒体、叶绿体等具膜结构的细胞器，核糖体为70S，以二分分裂繁殖。

大肠杆菌为革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌。

其大小为：0.5～0.8μm×1.0～3.0μm。

周身鞭毛，能运动，具致育因子的菌株还具性菌毛。

1．形态结构1.1 细胞壁位于大肠杆菌的最外层，厚约11um，分为两层，即外膜和肽聚糖层。

外膜是大肠杆菌细胞壁的主要成分，占细胞壁于重的80％，厚约8nm，位于肽聚糖层的外侧，主要由磷脂、蛋白质和脂多糖组成。

脂多糖是革兰氏阴性细菌的内毒素，也是革兰氏阴性细菌细胞壁的特有成分，主要和其抗原性、致病性及对噬菌体的敏感性有关。

肽聚糖层由1～2层网状的肽聚糖组成，占细胞壁干重的10％，厚约2～3nm，是细菌等原核生物所特有的成分。

大肠杆菌的肽聚糖由聚糖链、短肽和肽桥三部分组成。

聚糖链由N-乙酸葡糖胺和N-乙酚胞壁酸分子通过β-1，4糖苷键连接而成，短肽由L-丙氨酸→D-谷氨酸→内消旋二氨基庚二酸→D-丙氨酸组成，并由L-丙氨酸与胞壁酸相连。

一条聚糖链短肽的D-丙氨酸与另一条聚糖链短肽的内消旋二氨基庚二酸直接形成肽键（肽桥），从而使肽聚糖形成网状的整体结构。

由脂蛋白将外膜和肽聚糖层连接起来，从而使大肠杆菌的细胞壁形成一个整体结构。

1.2 细胞膜大肠杆菌细胞膜的结构和其它生物细胞膜的结构相似。

但其细胞膜中蛋白质的含量高且种类多。

其细胞膜具选择透性，从而可控制营养物质进出细胞。

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