【资料】酶与蛋白质工程-第4章-基因表达与蛋白质分离纯化汇编
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酶与蛋白质工程-第4章-基因表 达与蛋白质分离纯化
基因表达体系
原核体系
✓ 大肠杆菌 (Escherichia coli)
遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高； 基本不分泌，易形成包涵体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰
✓ 枯草杆菌 (Bacillus subtilis)
表达载体包括的成分
（１）复制起始点 （２）选择性基因（一般为抗生素抗性基因） （３）强的、可诱导的启动子 （４）强的转录终止序列 （５）核糖体结合位点 （６）合适的多克隆位点
基因表达体系
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分：
单纯表达: 如pJLA系列 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc
分泌表达: pel/ompT分泌肽
按启动子分：
lac及衍生的tac, trc, pac, rac等启动子 lamda phage PL和PR 启动子 T7 启动子 T5 启动子 ara启动子
IPTG诱导 热诱导 IPTG诱导 IPTG诱导 阿拉伯糖诱导
基因表达体系
常用表达载体
pET系列 pQE系列 pMAL系列 pGEX系列 pBAD系列 pTYB系列
(T7 promoter, Novagen公司) (T5 promoter, Qiagen公司) (周质表达, BioLabs公司) (GST融合表达, Pharmacia公司) (Arabinose诱导型) (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)
基因表达体系
基因的融合
• 采用DNA重组技术将不同基因或基因片段融合，经合适的表达 系统表达后，可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型 多功能蛋白
His·tag S·Tag
Trx·tag thrombin enterokinase
硫氧还蛋白标签 凝血酶
肠激酶
来自百度文库
目标蛋白
基因表达体系
载体分类
• 克隆载体：携带插入外源片段的质粒或噬菌体
• 表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达 元件（如启动子、终止子等），使目的基因能够表达的 载体
基因表达体系
✓ 多肽药物生产
大肠杆菌、毕氏酵母、哺乳动物细胞组织
✓ 疫苗
大肠杆菌、酵母、动植物细胞组织
✓ 单抗生产
杂交瘤细胞
✓ 工业酶生产
各种微生物
基因表达体系
Escherichia coli
• E.coli常与一些食源性疾病有关，但从人体肠道内分离出来的两种命 名为K-12和B的良性大肠杆菌菌株却是两种重要实验用菌株。大肠杆 菌K-12的基因组的测序工作已于1997年完成。大肠杆菌B菌株自1918 年被分离出来后，在1959年被分离为两类实验用菌株：REL606和 BL21(DE3)，后者在医学和工业上用于生产蛋白质
基因表达体系
融合蛋白标签
融合蛋白技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化方便 地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段被称为 “亲和尾”（Affinity tail）的编码序列相连接，这段 “亲和尾”可以与亲和层析柱上的配基特异地结合，使 目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来
• 构建融合蛋白的基本原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删 除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白或多肽基因，即可实 现两个基因的融合表达
基因表达体系
利用融合技术表达外源基因原因：
• 为蛋白质的表达和纯化提供方便 • 蛋白质结构和功能的研究 • 获得蛋白质的途径（通过体外切割） • 与其它不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白 • 与报告分子共表达，研究蛋白定位及转基因表达 • 防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解 • 改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GST • 蛋白表达的空间定位：信号肽
基因表达体系
基因融合的策略
• 基因融合的方式
– 信号肽+基因 – 信号肽+基因+插入序列
融合蛋白接头设计和选择
将2个或多个不同的模块连接成为一个大分子，其中起连接 作用的氨基酸链即为linker，Linker的长度一般是在10-15 个氨基酸之间
基因表达体系
• 若使用的linker较长，由于在重组蛋白的生产过程中对蛋白裂 解比较敏感，可能会导致融合蛋白产量的降低；同时又涉及免 疫原性的问题，因接头序列本身就是新的抗原
• 由美国、韩国和法国的科学家组成的研究小组完成了对两种实验室常 用的大肠杆菌(E.coli)菌株基因组的测序工作，发表在《Journal of Molecular Biology》 (2009)
• 基因组大小4.6M bp
基因表达体系
目标蛋白质在大肠杆菌中的表达
细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低，是目前广 泛应用的外源基因表达体系。但缺乏真核细胞特有的加工处理，外 源蛋白大量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋白， 在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏
• 应用较短的linker虽可克服蛋白酶分解的问题，但可能使两个 大分子相距最近，影响两种蛋白高级结构的折叠，从而相互干 扰，导致蛋白功能丧失，linker序列的组成对融合蛋白的折叠 有重大影响
• 另外，在设计linker序列时，尽量避免二级结构的产生，linker 中常见的氨基酸是非极性的疏水氨基酸（Gly、Ser等）
分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构； 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳 定，尚无商品化的表达载体
✓ 其它
乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis)
基因表达体系
真核体系
✓ 酵母细胞
可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表 达;商品化表达体系：酿酒酵母、毕氏酵母、裂殖酵母 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高
✓ 昆虫细胞
可以病毒感染的形式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜 蛋白的表达，有加糖修饰； 糖链有所区别，表达量有限
✓ 哺乳动物细胞/组织
可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致； 表达量不够高，培养成本较高
✓ 植物细胞/组织
植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； 转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不便
基因表达体系
体系选择
✓ 研究基因功能
大肠杆菌、裂殖酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞
基因表达体系
原核体系
✓ 大肠杆菌 (Escherichia coli)
遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高； 基本不分泌，易形成包涵体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰
✓ 枯草杆菌 (Bacillus subtilis)
表达载体包括的成分
（１）复制起始点 （２）选择性基因（一般为抗生素抗性基因） （３）强的、可诱导的启动子 （４）强的转录终止序列 （５）核糖体结合位点 （６）合适的多克隆位点
基因表达体系
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分：
单纯表达: 如pJLA系列 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc
分泌表达: pel/ompT分泌肽
按启动子分：
lac及衍生的tac, trc, pac, rac等启动子 lamda phage PL和PR 启动子 T7 启动子 T5 启动子 ara启动子
IPTG诱导 热诱导 IPTG诱导 IPTG诱导 阿拉伯糖诱导
基因表达体系
常用表达载体
pET系列 pQE系列 pMAL系列 pGEX系列 pBAD系列 pTYB系列
(T7 promoter, Novagen公司) (T5 promoter, Qiagen公司) (周质表达, BioLabs公司) (GST融合表达, Pharmacia公司) (Arabinose诱导型) (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)
基因表达体系
基因的融合
• 采用DNA重组技术将不同基因或基因片段融合，经合适的表达 系统表达后，可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型 多功能蛋白
His·tag S·Tag
Trx·tag thrombin enterokinase
硫氧还蛋白标签 凝血酶
肠激酶
来自百度文库
目标蛋白
基因表达体系
载体分类
• 克隆载体：携带插入外源片段的质粒或噬菌体
• 表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达 元件（如启动子、终止子等），使目的基因能够表达的 载体
基因表达体系
✓ 多肽药物生产
大肠杆菌、毕氏酵母、哺乳动物细胞组织
✓ 疫苗
大肠杆菌、酵母、动植物细胞组织
✓ 单抗生产
杂交瘤细胞
✓ 工业酶生产
各种微生物
基因表达体系
Escherichia coli
• E.coli常与一些食源性疾病有关，但从人体肠道内分离出来的两种命 名为K-12和B的良性大肠杆菌菌株却是两种重要实验用菌株。大肠杆 菌K-12的基因组的测序工作已于1997年完成。大肠杆菌B菌株自1918 年被分离出来后，在1959年被分离为两类实验用菌株：REL606和 BL21(DE3)，后者在医学和工业上用于生产蛋白质
基因表达体系
融合蛋白标签
融合蛋白技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化方便 地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段被称为 “亲和尾”（Affinity tail）的编码序列相连接，这段 “亲和尾”可以与亲和层析柱上的配基特异地结合，使 目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来
• 构建融合蛋白的基本原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删 除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白或多肽基因，即可实 现两个基因的融合表达
基因表达体系
利用融合技术表达外源基因原因：
• 为蛋白质的表达和纯化提供方便 • 蛋白质结构和功能的研究 • 获得蛋白质的途径（通过体外切割） • 与其它不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白 • 与报告分子共表达，研究蛋白定位及转基因表达 • 防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解 • 改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GST • 蛋白表达的空间定位：信号肽
基因表达体系
基因融合的策略
• 基因融合的方式
– 信号肽+基因 – 信号肽+基因+插入序列
融合蛋白接头设计和选择
将2个或多个不同的模块连接成为一个大分子，其中起连接 作用的氨基酸链即为linker，Linker的长度一般是在10-15 个氨基酸之间
基因表达体系
• 若使用的linker较长，由于在重组蛋白的生产过程中对蛋白裂 解比较敏感，可能会导致融合蛋白产量的降低；同时又涉及免 疫原性的问题，因接头序列本身就是新的抗原
• 由美国、韩国和法国的科学家组成的研究小组完成了对两种实验室常 用的大肠杆菌(E.coli)菌株基因组的测序工作，发表在《Journal of Molecular Biology》 (2009)
• 基因组大小4.6M bp
基因表达体系
目标蛋白质在大肠杆菌中的表达
细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低，是目前广 泛应用的外源基因表达体系。但缺乏真核细胞特有的加工处理，外 源蛋白大量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋白， 在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏
• 应用较短的linker虽可克服蛋白酶分解的问题，但可能使两个 大分子相距最近，影响两种蛋白高级结构的折叠，从而相互干 扰，导致蛋白功能丧失，linker序列的组成对融合蛋白的折叠 有重大影响
• 另外，在设计linker序列时，尽量避免二级结构的产生，linker 中常见的氨基酸是非极性的疏水氨基酸（Gly、Ser等）
分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构； 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳 定，尚无商品化的表达载体
✓ 其它
乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis)
基因表达体系
真核体系
✓ 酵母细胞
可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表 达;商品化表达体系：酿酒酵母、毕氏酵母、裂殖酵母 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高
✓ 昆虫细胞
可以病毒感染的形式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜 蛋白的表达，有加糖修饰； 糖链有所区别，表达量有限
✓ 哺乳动物细胞/组织
可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致； 表达量不够高，培养成本较高
✓ 植物细胞/组织
植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； 转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不便
基因表达体系
体系选择
✓ 研究基因功能
大肠杆菌、裂殖酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞