第七章蛋白质分分离纯化和表征

例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为 0.335%,计算二者的相对分子质量。
最低相对分子量铁＝的原子量 铁的百分含量
x 100
55.8
=
x 100
=16700
0.335
也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原 理计算蛋白质的最低分子量。
第七章蛋白质分分离纯化和表征
（二）渗透压法测定相对分子量
渗透压法测定Mr操作简单， Mr 在10-100 kDa时较准，但不能区别 蛋白质分子是否均一 。
蛋白质的沉降系数(s)与相对分子质量(Mr)的关系可 用斯维得贝格方程表达:
摩尔气体常数(8.314J·K-1·mol-1);
蛋白质的扩散系数(cm2/s), 数值上等于当 浓度梯度为1个单位时在1 s内通过1 cm2面 积的蛋白质质量
Mr
RTs
D(1v)
偏微比体积(cm3/g) 又称偏微比容,蛋白质 溶于水的偏微比容约0.74 cm3/g
渗透压公式： Mr =
RT
lim π
c→0 c
(c=质量浓度，g/mol)
第七章蛋白质分分离纯化和表征
（三）沉降分析测定Mr
超速离心机最大转速: 60000～80 000r/min, 相当于位于距 转轴中心10 cm处、单位质量(1g)分子所受到的离心力(离 心场强度)为400 000 ×g～700 000 ×g. 沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关,且与溶剂 密度和黏度有关. 单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数, 用s(小写)表示:
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几种蛋白质等电点
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二、蛋白质的分子大小与分子量的测定
蛋白质的分子量的范围: 6×103～1×106 Da
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测定蛋白质相对分子量的原理和方法
（一）根据化学组成测定最低相对分子量
用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的 含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原 子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。
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蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介于1×10 －13到200×10－13秒之间。为了使用方便，以10－13秒为一个 沉降系数的单位，称为斯维得贝格单位（Svedberg unit）， 或称沉降系数单位，用S表示。如人血红蛋白的S为4.46×10 －13秒，即4.46S。
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第7章 蛋白质的分离、纯化和表征
第七章蛋白质分分离纯化和表征
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一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是 具有两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离 度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大， 蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高， 则解离情况相反。
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① 盐析法（salting out） ： 中性盐（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）→ 蛋白质脱去水
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（五）SDS-PAGE法测定Mr
聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、 检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的 电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言， 主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。
当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠 （SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质 的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的 分子量。
蛋白质的等电点
在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷 相等，静电荷为零，这一pH 称为该蛋白质的等 电点（pI）。
有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离 子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离 基团结合，影响等电点。 无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来 的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液 pH称为等离子点(isoionic point,或称等离点)。等离子点是 每种蛋白质的一个特征常数。
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热力学温度(K),旧称绝对温度 沉降系数
溶剂的密度(g/cm3)
（四）凝胶过滤法测定Mr
凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离 的技术，同时可以测定蛋白质分子量。 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:
Log M
LogM 测
A B
C
先测得几种标准蛋白质的 Ve （Ve为洗脱体积） ，并 以其分子量对数对Ve作图得 一直线，再测出待测样品的 Ve，查标准曲线即可确定分 子量，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出待 测样品的Ve，查标准曲线即 可确定分子量。
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SDS破坏蛋白氢键和疏水相互作用, 巯基乙醇能打开二硫 键, SDS和巯基乙醇存在下,单体蛋白或亚基(寡聚蛋白质解 离成亚基) 处展开状态. SDS 烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体. 在 一定条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比: 1.4g SDS / 1 g 蛋白质,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子SDS. SDS 与蛋白质结合后: 第一, SDS 阴离子使多肽链覆盖上 相同密度的负电荷, 远超过蛋白质原有电荷量, 掩盖了不同 蛋白质间原有的电荷差别; 第二, 改变蛋白质的天然构象, 使大多数蛋白质采取类似的形状. 因此在 SDS 存在下的电 泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的.
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聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS-PAGE）
SDS-PAGE，迁移率不受蛋 白质原有的电荷、分子形 状等因素影响, 但凝胶具分 子筛效应. 因此，迁移率与 相对分子质量(Mr)之关系:
lgM rabr
常数
相对迁移率： 样品迁移距离 /前沿(染料)
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三、胶体性质与蛋白质的沉淀
1．蛋白质胶体溶液的稳定性
蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100nm)。又由 于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水 成为稳定的亲水胶体溶液。 蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：
双电层 水化层
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2．蛋白质的沉淀
蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改 变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失 去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作 用。