第七章蛋白质分分离纯化和表征
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第七章蛋白质的分离纯化与表征
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(三) 蛋白质的扩散和扩散系数 平移扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为平移扩散 扩散系数：当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积 所扩散的溶质的量。
蛋白质的扩散系数与分子大小和形状及溶剂的粘度有关。
扩散过程受到蛋白质分子与溶剂间的内磨擦阻力所反抗，这种阻 力大小不仅取决于蛋白质分子的质量，并且还强力地取决于它的 颗粒形状。
2020/3/1
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
•分离蛋白质的目的 许多蛋白质的研究与应用都要获得 纯蛋白质。如研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理 化学性质，需要纯的、均一的甚至是结晶的蛋白质样品 。 •分离和纯化蛋白质方法的原理 根据蛋白质的之间的各 种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶 解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力进行 分离。
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(四) 利用选择性吸附的纯化方法 1.羟磷灰石层析 2.疏水作用层析(苯基琼脂糖、辛基琼脂糖) (五) 利用对配体的特异生物学亲和的纯化方法 (六)高效液相层析和快速蛋白质液相层析
六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
(一) 蛋白质含量测定 凯氏定氮法、双缩脲法、Folin－酚试剂法、紫外吸收法、染料结合法 （Bradford）、胶体金测定法等。 (二)蛋白质纯度鉴定 电泳、沉降、HPLC、SDS－PAGE等。
二、蛋白质分子的大小与形状
(一) 根据化学组成测定最低相对分子质量
•如果已知蛋白质分子中含某种微量元素，并已知其含量，则可测 定此微量元素的含量，计算出最低相对分子质量。
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(三) 蛋白质的扩散和扩散系数 平移扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为平移扩散 扩散系数：当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积 所扩散的溶质的量。
蛋白质的扩散系数与分子大小和形状及溶剂的粘度有关。
扩散过程受到蛋白质分子与溶剂间的内磨擦阻力所反抗，这种阻 力大小不仅取决于蛋白质分子的质量，并且还强力地取决于它的 颗粒形状。
2020/3/1
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
•分离蛋白质的目的 许多蛋白质的研究与应用都要获得 纯蛋白质。如研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理 化学性质，需要纯的、均一的甚至是结晶的蛋白质样品 。 •分离和纯化蛋白质方法的原理 根据蛋白质的之间的各 种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶 解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力进行 分离。
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(四) 利用选择性吸附的纯化方法 1.羟磷灰石层析 2.疏水作用层析(苯基琼脂糖、辛基琼脂糖) (五) 利用对配体的特异生物学亲和的纯化方法 (六)高效液相层析和快速蛋白质液相层析
六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
(一) 蛋白质含量测定 凯氏定氮法、双缩脲法、Folin－酚试剂法、紫外吸收法、染料结合法 （Bradford）、胶体金测定法等。 (二)蛋白质纯度鉴定 电泳、沉降、HPLC、SDS－PAGE等。
二、蛋白质分子的大小与形状
(一) 根据化学组成测定最低相对分子质量
•如果已知蛋白质分子中含某种微量元素，并已知其含量，则可测 定此微量元素的含量，计算出最低相对分子质量。
第七章蛋白质的分离
第七章蛋白质的分离、纯化与表征一、是非题1 一个蛋白质样品，在某一条件下用电泳检查，显示一条带。
因此说明，该样品是纯的（）2 逆流分溶和纸层析，这两个分离氨基酸的方法是基于同一原理（）3 蛋白质的SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳和圆盘电泳是两种完全不同的技术（）4 凝胶过滤法可用于测定蛋白质的分子量，分子量小的蛋白质先流出柱，分子量大的后流出柱（）5 蛋白质在小于等电点的PH溶液中，向阳极移动，而在大于等电点的PH溶液中，将向阴极移动（）6 电泳和等电聚焦都是根据蛋白质的电荷不同，即酸碱性质不同的两种分离蛋白质混合物的方法（）二、填空题1 现欲分离某蛋白质溶液中的四个蛋白质成分，它们分子量和等电点列于表内蛋白质成分Mr pIA 12000 10B 62000 4C 28000 7D 9000 5如不考虑次要因素，它们在葡聚糖凝胶G-75柱上分离时，流出的先后次序将是：最先，，其次，最后流出的蛋白质是如选用羧甲基纤维素柱分离上面四种蛋白质，并用盐浓度梯度洗脱，流出的先后次序将是：、、、2 分离蛋白质混合物的各种方法主要根据蛋白质在溶液中的下列性质，，，3 蛋白质时两性电介质，当溶液的PH在其等电点以上时蛋白质分子带电荷，而PH在等电点一下时，带电荷三、选择题1.下列哪种方法可得到蛋白质的“指纹”图谱?A.酸水解，然后凝胶过滤B.彻底碱水解并用离子交换层析测定氨基酸的组成C.用氨肽酶降解并测定被释放的氨基酸的组成D.用胰蛋白酶降解，然后进行纸层析和纸电泳E.用2，4-二硝基氟苯处理蛋白质2.若用电泳分离Gly-Lys、Asp-Val和Ala-His三种二肽，在下列哪个pH条件下电泳最为合适？A.pH2以下B.pH2～4C.pH7～9D.pH10～12E.pH12以上3.进行疏水吸附层析时，以下哪种条件比较合理A.在有机溶剂存在时上柱，低盐溶液洗脱B.在有机溶剂存在时上柱，高盐溶液洗脱C.低盐条件下上柱，高盐溶液洗脱D.高盐溶液上柱，按低盐，水和有机溶剂顺序洗脱。
蛋白质的分离纯化方法一
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
3.毛细管电泳
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
4.等电聚焦电泳
等电聚焦电泳法测定蛋白质pI
5.SDS-PAGE
6.离子交换层析
离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖：
楚雄师范学院化学与生命科学系
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
普通电泳、等电聚焦、 双向电泳、脉冲电泳、 毛细管电泳 从电泳结果分：自由界 面电泳、区带电泳、盘 状电泳 从装置上分： 圆盘电 泳（柱状）、水平板电 泳、垂直板电泳。 从支持物分： 自由界 面电泳、纸电泳（或薄 膜电泳）、凝胶电 泳（ PAGE ，琼脂糖胶， 淀粉胶等）
沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降 的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰 冻切片采样分析。
蔗糖密度梯度
聚蔗糖密度梯度
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
3.凝胶过滤
交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P ）；琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）
稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开， 不会互相碰撞凝聚而沉淀。 ②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集 而沉淀。
一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液 中析出沉淀。
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
（二）蛋白质的沉淀
①盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、 Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ②有机溶剂沉淀法 破坏水化膜，降低介电常数。 ③重金属盐沉淀 pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与 重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法 pH小于等电点时，蛋白质 带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、 苦味酸、钨酸。酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀 往往是不可逆的。
蛋白质的分离纯化和表征
2.盐溶和盐析
蛋白质的分离纯化和表征
第21页
2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
第48页
蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
第49页
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
第9页
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
第46页
蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
第13页
三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
蛋白质的分离纯化和表征
第21页
2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
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蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
第49页
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
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盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
第46页
蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
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三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
第7章蛋白质的分离、纯化和表征
In contrast, the larger molecules have only the liquid surrounding the beads accessible to them, and thus move through the column faster, emerging out of the bottom (eluting洗脱) first.
分子的大小和形状 酸碱性质 溶解度 吸附性质 对配体分子的特异生物学亲和力
Protein Purification and Characterization
The aim of protein purification is to isolate one particular protein from all the others in the starting material, exploits利用: Solubility Size Charge Hydrophobicity or/and specific binding affinity of the protein of interest
Small/more negatively-charged proteins migrate further through the gel than larger/less negatively-charged proteins
7.3 蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀
Protein colloid character and deposition
用来确定Mr。
7.2.4 沉降分析法测定相对分子质量
蛋白质溶液在电场中受到强大的离心力作用时，如果 蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。
蛋白质的结构层次
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
测定蛋白分子量
测定蛋白
标准蛋白
logMr=K1-K2R
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
• • • • 1、蛋白质溶液是一种胶体溶液； 水化作用，双电层结构 2、蛋白质沉淀 （1）盐析：加入中性盐，破坏蛋白水 化层引起沉淀 • （2）有机溶剂沉淀：加入极性有机溶 剂，脱水化层，破坏双电层 • （3）重金属盐沉淀：结合成不溶性盐 • （4）加热变性
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
一、蛋白质的酸碱性质
• 蛋白质是两性电解质 • 可解离基团：-氨基， -羧基，侧 链R基团
• 蛋白质等电点：在某一pH值，蛋白 所带正负电荷相等，即净电荷为零 时溶液的pH称为该蛋白等电点。
二、蛋白质分子大小与形状
• （一）根据化学组成测定最低分子量 例：肌红蛋白含铁量为 0.335%，其最小分 子量是多少？血红蛋白含铁量也是 0.335%。试求其分子量。 • 解：肌红蛋白的分子量为： • 100：0.335=M：56 • M=100*56/0.335=16716.4 • 血红蛋白的分子量为： • 100：0.335=M：（456） M=66865.7
（二）几种测定蛋白分子量方法
• 1、渗透压法：=cRT/Mr • 2、测定扩散系数法:随Mr增加而降 低 • 3、沉降法
• 规定ห้องสมุดไป่ตู้0-13秒为一个单位，称为沉降系 数单位，用S表示。
• *4、凝胶过滤法 • **5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）法
凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）法测定蛋白质分子量
• • • • • •
在某一溶液中含有三种蛋白质，其性质如下： 蛋白 相对分子量 等电点 A 40000 8.5 B 40000 5.9 C 60000 5.9 试设计一个方案分离纯化这三种蛋白质。
测定蛋白分子量
测定蛋白
标准蛋白
logMr=K1-K2R
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
• • • • 1、蛋白质溶液是一种胶体溶液； 水化作用，双电层结构 2、蛋白质沉淀 （1）盐析：加入中性盐，破坏蛋白水 化层引起沉淀 • （2）有机溶剂沉淀：加入极性有机溶 剂，脱水化层，破坏双电层 • （3）重金属盐沉淀：结合成不溶性盐 • （4）加热变性
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
一、蛋白质的酸碱性质
• 蛋白质是两性电解质 • 可解离基团：-氨基， -羧基，侧 链R基团
• 蛋白质等电点：在某一pH值，蛋白 所带正负电荷相等，即净电荷为零 时溶液的pH称为该蛋白等电点。
二、蛋白质分子大小与形状
• （一）根据化学组成测定最低分子量 例：肌红蛋白含铁量为 0.335%，其最小分 子量是多少？血红蛋白含铁量也是 0.335%。试求其分子量。 • 解：肌红蛋白的分子量为： • 100：0.335=M：56 • M=100*56/0.335=16716.4 • 血红蛋白的分子量为： • 100：0.335=M：（456） M=66865.7
（二）几种测定蛋白分子量方法
• 1、渗透压法：=cRT/Mr • 2、测定扩散系数法:随Mr增加而降 低 • 3、沉降法
• 规定ห้องสมุดไป่ตู้0-13秒为一个单位，称为沉降系 数单位，用S表示。
• *4、凝胶过滤法 • **5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）法
凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）法测定蛋白质分子量
• • • • • •
在某一溶液中含有三种蛋白质，其性质如下： 蛋白 相对分子量 等电点 A 40000 8.5 B 40000 5.9 C 60000 5.9 试设计一个方案分离纯化这三种蛋白质。
生物化学课件 第7章 - 蛋白质分离纯化和表征(9-21)
思考题 2012年厦门大学生物化学
5. 一多肽有侧链羧基30个（pk1=4.3），咪唑基15个(pk2 =
6.0) ，氨基10个（pk3=10）。两端羧基，氨基的pk分别为
COOH = 3.5 和 NH3+ = 9.5。求该蛋白的PI值
+26
分析：
pk1=4.3
30 × COOH
+25
NH3+ pk1=9.5
当一种氨基酸的净电荷用q=pI-pH表达时，若q为正值，则 该氨基酸带正电荷；若q为负值，则该氨基酸带负电荷。
q值的正与负和该氨基酸所带电荷的种类是一致的。如 果采用q=pH-pI来表达，则会出现相反的结果，即q为负值时， 氨基酸带正电荷；q为正值时，氨基酸带负电荷。因此，用 pI-pH更好。
思考题
第7章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的理化性质 P291
（一）蛋白质的酸碱电离
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基 侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带 负电荷或正电荷的基团。
当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子 的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
试剂的酸根离子结合而产生沉淀。
生物碱试剂和某些酸类沉淀
实例分析
实例分析：在啤酒生产工艺中有麦芽汁加啤酒 花煮沸的工序，其目的之一就是借酒花中的单 宁类物质怀变性蛋白质或盐形成沉淀，使麦芽 汁得以澄清，从而防止成品啤酒产生蛋白质混 浊。
“ 柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的 柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的 蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”
蛋白质分离纯化和表征优秀课件
2)也与蛋白质分子形状、溶液的密度 和粘度有关。
超速离心法的二个用途 1、测定蛋白质的分子量； 2、分离纯化蛋白质。
超速离心基本原理
1、离心力(Fc)
离心作用是根据在一定角度速度下作 圆周运动的任何物体都受到一个向外的离 心力进行的。离心力的大小等于离心加速 度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：
FC＝mω2X 其中ω是旋转角速度，以弧度／秒为 单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以 cm为单位：m是质量，以克为单位。
1、什么叫扩散？
如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面， 则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的 低浓度区迁移，直至达到平衡为止。由于浓 度差引起的这种溶质分子的迁移称为扩散。 扩散是高浓度向低浓度方向进行的。
2、扩散系数
它在数值上等于当浓度为一个单位时，在 一秒钟内通过1厘米2面积而扩散的溶质量
3、影响扩散系数的因素
Sephadex
G-25
G-75
G-100
1000-5000
3000—80000 4000—150000
2、聚丙烯酰胺凝胶: (Bio-gel) Bio-Rad公司(美国)
Bio-gel
P-4
P-10
P-100-150000
3、琼脂糖凝胶：(Sepharose) pharmacia公司(瑞典)
利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测 定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分 子量。
渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点
优点： 所用的实验装置简单。
缺点： 要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他
杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质 的平均分子量。
(三)蛋白质的扩散和扩散系数
超速离心法的二个用途 1、测定蛋白质的分子量； 2、分离纯化蛋白质。
超速离心基本原理
1、离心力(Fc)
离心作用是根据在一定角度速度下作 圆周运动的任何物体都受到一个向外的离 心力进行的。离心力的大小等于离心加速 度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：
FC＝mω2X 其中ω是旋转角速度，以弧度／秒为 单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以 cm为单位：m是质量，以克为单位。
1、什么叫扩散？
如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面， 则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的 低浓度区迁移，直至达到平衡为止。由于浓 度差引起的这种溶质分子的迁移称为扩散。 扩散是高浓度向低浓度方向进行的。
2、扩散系数
它在数值上等于当浓度为一个单位时，在 一秒钟内通过1厘米2面积而扩散的溶质量
3、影响扩散系数的因素
Sephadex
G-25
G-75
G-100
1000-5000
3000—80000 4000—150000
2、聚丙烯酰胺凝胶: (Bio-gel) Bio-Rad公司(美国)
Bio-gel
P-4
P-10
P-100-150000
3、琼脂糖凝胶：(Sepharose) pharmacia公司(瑞典)
利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测 定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分 子量。
渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点
优点： 所用的实验装置简单。
缺点： 要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他
杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质 的平均分子量。
(三)蛋白质的扩散和扩散系数
蛋白质化学蛋白质的分离纯化和表征标准版PPT
蛋白质的纯化是基于其结构和功能的研究需求，旨在获得高度纯化且具有生物活性的蛋白质。纯化过程中需考虑蛋白质的酸碱性质，特别是等电点，此时蛋白质溶解度最低，有利于沉淀分离。根据蛋白质的分子大小和形状，可采用渗透压法、沉降分析法、凝胶过滤法及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法等方法测定其分子量，进而指导纯化策略。蛋白质的胶体性质使其在溶液中稳定分散，而通过破坏这一稳定性，如盐析法、有机溶剂沉淀法、重金Байду номын сангаас沉淀法等，可实现蛋白质的沉淀分离。纯化时还应结合结晶分析、溶解度分析和光吸收等手段，综合评估纯化效果。最终，通过一系列分离纯化步骤，获得满足研究需求的纯蛋白质。
蛋白质分分离纯化和表征
沉降平衡法
（四）凝胶过滤法测定Mr
凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，同时可以测定蛋白质分子量。
蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:
先测得几种标准蛋白质的 Ve （Ve为洗脱体积） ，并 以其分子量对数对Ve作图得 一直线，再测出待测样品的 Ve，查标准曲线即可确定分 子量，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出待 测样品的Ve，查标准曲线即 可确定分子量。
03
根据电荷不同的纯化方法 电泳 ： 在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。 原则上按电泳的原理来分，可分为：
自由界面电
区带电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 三种物理效应：样品的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应。
CH2=CH
C=O
NH2
丙烯酰胺
N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
抗原和抗体
激素和受体蛋白
3
凝集素和糖蛋白
4
（六） 亲和层析
配体
蛋白质
蛋白质和配体复合物
交联试剂
载体
配体
载体与配体交联体
杂质
杂质
游离配体
测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。
溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。
பைடு நூலகம்
叁
若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。
贰
若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。
离子交换：
亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的 。
（四）凝胶过滤法测定Mr
凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，同时可以测定蛋白质分子量。
蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:
先测得几种标准蛋白质的 Ve （Ve为洗脱体积） ，并 以其分子量对数对Ve作图得 一直线，再测出待测样品的 Ve，查标准曲线即可确定分 子量，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出待 测样品的Ve，查标准曲线即 可确定分子量。
03
根据电荷不同的纯化方法 电泳 ： 在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。 原则上按电泳的原理来分，可分为：
自由界面电
区带电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 三种物理效应：样品的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应。
CH2=CH
C=O
NH2
丙烯酰胺
N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
抗原和抗体
激素和受体蛋白
3
凝集素和糖蛋白
4
（六） 亲和层析
配体
蛋白质
蛋白质和配体复合物
交联试剂
载体
配体
载体与配体交联体
杂质
杂质
游离配体
测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。
溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。
பைடு நூலகம்
叁
若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。
贰
若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。
离子交换：
亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的 。
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第七章蛋白质分分离纯化和表征
SDS破坏蛋白氢键和疏水相互作用, 巯基乙醇能打开二硫 键, SDS和巯基乙醇存在下,单体蛋白或亚基(寡聚蛋白质解 离成亚基) 处展开状态. SDS 烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体. 在 一定条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比: 1.4g SDS / 1 g 蛋白质,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子SDS. SDS 与蛋白质结合后: 第一, SDS 阴离子使多肽链覆盖上 相同密度的负电荷, 远超过蛋白质原有电荷量, 掩盖了不同 蛋白质间原有的电荷差别; 第二, 改变蛋白质的天然构象, 使大多数蛋白质采取类似的形状. 因此在 SDS 存在下的电 泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的.
三、胶体性质与蛋白质的沉淀
1．蛋白质胶体溶液的稳定性
蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100nm)。又由 于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水 成为稳定的亲水胶体溶液。 蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：
双电层 水化层
第七章蛋白质分分离纯化和表征
2．蛋白质的沉淀
蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改 变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失 去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作 用。
蛋白质的沉降系数(s)与相对分子质量(Mr)的关系可 用斯维得贝格方程表达:
摩尔气体常数(8.314J·K-1·mol-1);
蛋白质的扩散系数(cm2/s), 数值上等于当 浓度梯度为1个单位时在1 s内通过1 cm2面 积的蛋白质质量
Mr
RTs
D(1v)
偏微比体积(cm3/g) 又称偏微比容,蛋白质 溶于水的偏微比容约0.74 cm3/g
第七章蛋白质分分离纯化和表征
热力学温度(K),旧称绝对温度 沉降系数
溶剂的密度(g/cm3)
（四）凝胶过滤法测定Mr
凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离 的技术，同时可以测定蛋白质分子量。 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:
Log M
LogM 测
A B
C
先测得几种标准蛋白质的 Ve （Ve为洗脱体积） ，并 以其分子量对数对Ve作图得 一直线，再测出待测样品的 Ve，查标准曲线即可确定分 子量，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出待 测样品的Ve，查标准曲线即 可确定分子量。
渗透压公式： Mr =
RT
lim π
c→0 c
(c=质量浓度，g/mol)
第七章蛋白质分分离纯化和表征
（三）沉降分析测定Mr
超速离心机最大转速: 60000～80 000r/min, 相当于位于距 转轴中心10 cm处、单位质量(1g)分子所受到的离心力(离 心场强度)为400 000 ×g～700 000 ×g. 沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关,且与溶剂 密度和黏度有关. 单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数, 用s(小写)表示:
① 盐析法（salting out） ： 中性盐（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）→ 蛋白质脱去水
蛋白质的等电点
在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷 相等，静电荷为零，这一pH 称为该蛋白质的等 电点（pI）。
有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离 子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离 基团结合，影响等电点。 无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来 的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液 pH称为等离子点(isoionic point,或称等离点)。等离子点是 每种蛋白质的一个特征常数。
第七章蛋白质分分离纯化和表征
几种蛋白质等电点
第七章蛋白质分分离纯化和表征
二、蛋白质的分子大小与分子量的测定
蛋白质的分子量的范围: 6×103～1×106 Da
第七章蛋白质分分离纯化和表征
测定蛋白质相对分子量的原理和方法
（一）根据化学组成测定最低相对分子量
用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的 含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原 子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。
第七章蛋白质分分离纯化和表征
聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS-PAGE）
SDS-PAGE，迁移率不受蛋 白质原有的电荷、分子形 状等因素影响, 但凝胶具分 子筛效应. 因此，迁移率与 相对分子质量(Mr)之关系:
lgM rabr
常数
相对迁移率： 样品迁移距离 /前沿(染料)
第七章蛋白质分分离纯化和表征
例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为 0.335%,计算二者的相对分子质量。
最低相对分子量铁＝的原子量 铁的百分含量
x 100
55.8
=
x 100
=16700
0.335
也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原 理计算蛋白质的最低分子量。
第七章蛋白质分分离纯化和表征
（二）渗透压法测定相对分子量
渗透压法测定Mr操作简单， Mr 在10-100 kDa时较准，但不能区别 蛋白质分子是否均一 。
第七章蛋白质分分离纯化和表征
蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介于1×10 －13到200×10－13秒之间。为了使用方便，以10－13秒为一个 沉降系数的单位，称为斯维得贝格单位（Svedberg unit）， 或称沉降系数单位，用S表示。如人血红蛋白的S为4.46×10 －13秒，即4.46S。
P291
第7章 蛋白质的分离、纯化和表征
ห้องสมุดไป่ตู้
第七章蛋白质分分离纯化和表征
1
一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是 具有两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离 度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大， 蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高， 则解离情况相反。
第七章蛋白质分分离纯化和表征
V测第七章蛋白质分分离纯化和表征
（五）SDS-PAGE法测定Mr
聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、 检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的 电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言， 主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。
当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠 （SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质 的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的 分子量。
SDS破坏蛋白氢键和疏水相互作用, 巯基乙醇能打开二硫 键, SDS和巯基乙醇存在下,单体蛋白或亚基(寡聚蛋白质解 离成亚基) 处展开状态. SDS 烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体. 在 一定条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比: 1.4g SDS / 1 g 蛋白质,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子SDS. SDS 与蛋白质结合后: 第一, SDS 阴离子使多肽链覆盖上 相同密度的负电荷, 远超过蛋白质原有电荷量, 掩盖了不同 蛋白质间原有的电荷差别; 第二, 改变蛋白质的天然构象, 使大多数蛋白质采取类似的形状. 因此在 SDS 存在下的电 泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的.
三、胶体性质与蛋白质的沉淀
1．蛋白质胶体溶液的稳定性
蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100nm)。又由 于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水 成为稳定的亲水胶体溶液。 蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：
双电层 水化层
第七章蛋白质分分离纯化和表征
2．蛋白质的沉淀
蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改 变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失 去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作 用。
蛋白质的沉降系数(s)与相对分子质量(Mr)的关系可 用斯维得贝格方程表达:
摩尔气体常数(8.314J·K-1·mol-1);
蛋白质的扩散系数(cm2/s), 数值上等于当 浓度梯度为1个单位时在1 s内通过1 cm2面 积的蛋白质质量
Mr
RTs
D(1v)
偏微比体积(cm3/g) 又称偏微比容,蛋白质 溶于水的偏微比容约0.74 cm3/g
第七章蛋白质分分离纯化和表征
热力学温度(K),旧称绝对温度 沉降系数
溶剂的密度(g/cm3)
（四）凝胶过滤法测定Mr
凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离 的技术，同时可以测定蛋白质分子量。 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:
Log M
LogM 测
A B
C
先测得几种标准蛋白质的 Ve （Ve为洗脱体积） ，并 以其分子量对数对Ve作图得 一直线，再测出待测样品的 Ve，查标准曲线即可确定分 子量，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出待 测样品的Ve，查标准曲线即 可确定分子量。
渗透压公式： Mr =
RT
lim π
c→0 c
(c=质量浓度，g/mol)
第七章蛋白质分分离纯化和表征
（三）沉降分析测定Mr
超速离心机最大转速: 60000～80 000r/min, 相当于位于距 转轴中心10 cm处、单位质量(1g)分子所受到的离心力(离 心场强度)为400 000 ×g～700 000 ×g. 沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关,且与溶剂 密度和黏度有关. 单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数, 用s(小写)表示:
① 盐析法（salting out） ： 中性盐（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）→ 蛋白质脱去水
蛋白质的等电点
在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷 相等，静电荷为零，这一pH 称为该蛋白质的等 电点（pI）。
有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离 子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离 基团结合，影响等电点。 无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来 的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液 pH称为等离子点(isoionic point,或称等离点)。等离子点是 每种蛋白质的一个特征常数。
第七章蛋白质分分离纯化和表征
几种蛋白质等电点
第七章蛋白质分分离纯化和表征
二、蛋白质的分子大小与分子量的测定
蛋白质的分子量的范围: 6×103～1×106 Da
第七章蛋白质分分离纯化和表征
测定蛋白质相对分子量的原理和方法
（一）根据化学组成测定最低相对分子量
用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的 含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原 子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。
第七章蛋白质分分离纯化和表征
聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS-PAGE）
SDS-PAGE，迁移率不受蛋 白质原有的电荷、分子形 状等因素影响, 但凝胶具分 子筛效应. 因此，迁移率与 相对分子质量(Mr)之关系:
lgM rabr
常数
相对迁移率： 样品迁移距离 /前沿(染料)
第七章蛋白质分分离纯化和表征
例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为 0.335%,计算二者的相对分子质量。
最低相对分子量铁＝的原子量 铁的百分含量
x 100
55.8
=
x 100
=16700
0.335
也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原 理计算蛋白质的最低分子量。
第七章蛋白质分分离纯化和表征
（二）渗透压法测定相对分子量
渗透压法测定Mr操作简单， Mr 在10-100 kDa时较准，但不能区别 蛋白质分子是否均一 。
第七章蛋白质分分离纯化和表征
蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介于1×10 －13到200×10－13秒之间。为了使用方便，以10－13秒为一个 沉降系数的单位，称为斯维得贝格单位（Svedberg unit）， 或称沉降系数单位，用S表示。如人血红蛋白的S为4.46×10 －13秒，即4.46S。
P291
第7章 蛋白质的分离、纯化和表征
ห้องสมุดไป่ตู้
第七章蛋白质分分离纯化和表征
1
一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是 具有两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离 度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大， 蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高， 则解离情况相反。
第七章蛋白质分分离纯化和表征
V测第七章蛋白质分分离纯化和表征
（五）SDS-PAGE法测定Mr
聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、 检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的 电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言， 主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。
当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠 （SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质 的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的 分子量。