蛋白质的分离,纯化和表征

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•引起蛋白质变性的因素有：
① 物理因素：高温、高压、 紫外线、电离辐射、超声波 等；
② 化学因素：强酸、强碱、 有机溶剂、重金属盐等。
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• 变性蛋白质的性质改变：
① 物理性质：旋光性改变，溶解度下 降，沉降率升高，粘度升高，光吸 收度增加等；
② 化学性质：官能团反应性增加，易 被蛋白酶水解。
反应有关基团
双缩脲反应
米伦反应
黄色反应
乙醛酸反应 (Hopking-Cole 反 应) 坂口反应 (Sakaguchi反应)
NaOH、CuSO2
HgNO3
、
Hg(NO3)2 及
HNO3混合物
浓HNO3及NH3
乙醛酸试剂及浓 H2SO4
α-萘酚、NaClO
紫色或粉 红色 红色
黄色、橘 色 紫色
红色
二个以上肽键
第五节 蛋白质的分离、纯化和表征
一、蛋白质的理化性质
（一）蛋白质的两性解离与等电点：
• 由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上 及末端存在游离的氨基和游离的羧基， 因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离
的性质，因而也具有特定的等电点。
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（二）蛋白质的呈色反应
(一)茚三酮反应 α－氨基酸与茚三酮作用时，产生蓝紫色反应， 由于肽、蛋白质是由许多α－氨基酸组成的，所以也 呈此颜色反应。
(二)双缩脲反应 蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，
称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上－CO－NH－ 键的化合物都呈此反应，肽和蛋白质分子中氨基酸是
以肽键相连，因此，所有蛋白质都能与双缩脲试剂发
生反应。
O
OHO
2NH2-C-NH2
NH2-C-N-C-NH2 +NH3
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反应名称
试剂
颜色
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电泳
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（三）层析：
• 层析是一种利用混合物中各组分理化 性质的差异，在相互接触的两相（固 定相与流动相）之间的分布不同而进 行分离分析的技术方法。
• 主要的层析技术有离子交换层析，凝 胶层析，吸附层析及亲和层析等。
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离子交换层析
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吸附层析
白质从溶液中沉淀析出，称为盐
析。
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• 常用的中性盐有：硫酸铵、氯 化钠、硫酸钠等。
• 盐析时，溶液的pH在蛋白质 的等电点处效果最好。
• 盐析沉淀蛋白质时，通常不 会引起蛋白质的变性。
• 分段盐析
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2. 有机溶剂沉淀蛋白质：
• 凡能与水以任意比例混合的有机溶 剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可
③ 生物学性质：原有生物学活性丧失， 抗原性改变。
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• 蛋白质变性的可逆性：
a) 蛋白质在体外变性后，绝大多 数情况下是不能复性的；
b) 如变性程度浅，蛋白质分子的
构象未被严重破坏；或者蛋白
质具有特殊的分子结构，并经
特殊处理则可以复性。
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核
糖
核
酸
酶
的
变
性
与
复
性
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• 蛋白质分子相互聚集而从溶液中
用于沉淀蛋白质。
• 沉淀原理是：
• ① 脱水作用；
• ② 使水的介电常数降低，蛋白质
溶解度降低。
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（二）电泳：
• 带电粒子在电场中移动的现象称为 电泳。
• 蛋白质分子在溶液中可带净的负电 荷或带净的正电荷，故可在电场中 发生移动。不同的蛋白质分子所带 电荷量不同，且分子大小也不同， 故在电场中的移动速度也不同，据 此可互相分离。
析出的现象称为沉淀。
• 变性后的蛋白质由于疏水基团的 暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质
不一定都是变性后的蛋白质。
• 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质
一定发生变性。
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二、蛋白质的分离与纯化
（一）盐析与有机溶剂沉淀： 1. 盐析：
• 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，
以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋
—OH
N
胍基
有此反应的 蛋白质或氨 基酸 所有蛋白质
Tyr
Tyr、Phe
Trp
Arg
茚三酮反应
茚三酮
蓝色
氨基及羧基
α-氨基酸
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（二）蛋白质的胶体性质：
• 蛋白质分子的颗粒直径已达
1~100nm，处于胶体颗粒的范围。 因此，蛋白质具有亲水溶胶的性 质。 • 布郎运动、丁道尔现象、不能透 过半透膜等。
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凝胶层析
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凝胶过滤分离蛋白质
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亲和层析
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（四）超速离心：
• 利用物质密度的不同，经超速离心 后，分布于不同的液层而分离。
• 超速离心也可用来测定蛋白质的 分子量，蛋白质的分子量与其沉降 系数S成正比。
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蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）； 2）带相同电荷。
+ ++
+ ++
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（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固：
• 在某些物理或化学因素的作用下，蛋白
质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的 断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和 生物学性质的改变，称为蛋白质的变性。
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