第5章 蛋白质分离纯化和表征
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➢ SDS破坏蛋白氢键和疏水相互作用, 巯基乙醇能打开二硫 键, SDS和巯基乙醇存在下,单体蛋白或亚基(寡聚蛋白质解 离成亚基) 处展开状态.
➢ SDS 烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体. 在 一定条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比: 1.4g SDS / 1 g 蛋白质,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子SDS.
V测
(五)SDS-PAGE法测定Mr
聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率,用它分离、 检测蛋白质混合样品,主要是根据各蛋白质各组分的 电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言, 主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。
当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠 (SDS)时,则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质 的分子量,从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的 分子量。
渗透压公式: Mr =
RT
lim π
c→0 c
(c=质量浓度,g/mol)
(三)沉降分析测定Mr
➢ 超速离心机最大转速: 60000~80 000r/min, 相当于位于距 转轴中心10 cm处、单位质量(1g)分子所受到的离心力(离 心场强度)为400 000 ×g~700 000 ×g.
➢ 沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关,且与溶剂 密度和黏度有关.
SDS-PAGE,迁移率不受蛋 白质原有的电荷、分子形 状等因素影响, 但凝胶具分 子筛效应. 因此,迁移率与 相对分子质量(Mr)之关系:
lg M r a br
常数
相对迁移率: 样品迁移距离 /前沿(染料)
三、胶体性质与蛋白质的沉淀
1.蛋白质胶体溶液的稳定性
蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100nm)。又由 于其分子表面有许多极性基团,亲水性极强,易溶于水 成为稳定的亲水胶体溶液。 蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素: ➢ 双电层 ➢ 水化层
热力学温度(K),旧称绝对温度 沉降系数
溶剂的密度(g/cm3)
(四)凝胶过滤法测定Mr
凝胶过滤(层析)可按照蛋白质分子量大小进行分离 的技术,同时可以测定蛋白质分子量。 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:
Log M
LogM 测
A B
C
先测得几种标准蛋白质的 Ve (Ve为洗脱体积) ,并 以其分子量对数对Ve作图得 一直线,再测出待测样品的 Ve,查标准曲线即可确定分 子量。
➢ 有中性盐时,蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离 子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可Leabharlann Baidu蛋白质某些可解离 基团结合,影响等电点。
➢ 无盐类干扰时,蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来 的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液 pH称为等离子点(isoionic point,或称等离点)。等离子点是 每种蛋白质的一个特征常数。
盐溶(salting in):稀盐溶液中蛋白质溶解度增 加的现象。
② 有机溶剂沉淀法: 极性有机溶剂(甲醇,乙醇,丙酮)→脱去水化层以及
降低介电常数 而增加带电质点间的相互作用。 条件:低温操作,缩短时间。
③ 重金属盐沉淀法:当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷,易与 重金属离子
(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等) →生成沉淀。
2.蛋白质的沉淀
蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的,相对的。假若改 变环境条件,破坏其水化膜和双电层,蛋白质亲水胶体便失 去稳定性,发生絮结沉淀现象,这既是所谓的蛋白质沉淀作 用。
① 盐析法(salting out) : 中性盐(NH4SO4,NaSO4,NaCl等)→ 蛋白质脱去水
化层。 优点:不引起蛋白质变性。
几种蛋白质等电点
二、蛋白质的分子大小与分子量的测定
蛋白质的分子量的范围: 6×103~1×106 Da
测定蛋白质相对分子量的原理和方法
(一)根据化学组成测定最低相对分子量
用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的 含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原 子,则可由此计算出蛋白质的最低分子量。
➢ 单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数, 用s(小写)表示:
蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介于1×10- 13到200×10-13秒之间。为了使用方便,以10-13秒为一个沉 降系数的单位,称为斯维得贝格单位(Svedberg unit),或 称沉降系数单位,用S表示。如人血红蛋白的S为4.46×10-13 秒,即4.46S。
蛋白质的沉降系数(s)与相对分子质量(Mr)的关系可 用斯维得贝格方程表达:
摩尔气体常数(8.314J·K-1·mol-1);
蛋白质的扩散系数(cm2/s), 数值上等于当 浓度梯度为1个单位时在1 s内通过1 cm2面 积的蛋白质质量
RTs
M r D(1 v)
偏微比体积(cm3/g) 又称偏微比容,蛋白质 溶于水的偏微比容约0.74 cm3/g
P291
第5章 蛋白质的分离、纯化和表征
1
一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团,是 具有两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离 度与溶液的pH有关,pH越低,碱性解离度越大, 蛋白质分子带正电荷越多,负电荷越少;pH升高,
则解离情况相反。
蛋白质的等电点
在特定pH条件下,某种蛋白质分子所带正负电荷 相等,静电荷为零,这一pH 称为该蛋白质的等 电点(pI)。
例:肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%, 计算二者的相对分子质量。
最低相对分子量=铁的原子量 铁的百分含量
x 100
=
55.8 x 100 =16700
0.335
也可以利用蛋白质中含量特少的aa,用同样的原 理计算蛋白质的最低分子量。
(二)渗透压法测定相对分子量
渗透压法测定Mr操作简单, Mr 在10-100 kDa时较准,但不能区别 蛋白质分子是否均一 。
➢ SDS 与蛋白质结合后: 第一, SDS 阴离子使多肽链覆盖上 相同密度的负电荷, 远超过蛋白质原有电荷量, 掩盖了不同 蛋白质间原有的电荷差别; 第二, 改变蛋白质的天然构象, 使大多数蛋白质采取类似的形状. 因此在 SDS 存在下的电 泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的.
聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS-PAGE)