假单胞菌M_6菌株对微囊藻毒素MC_LR的降解机理初探
微囊藻毒素(MCs)的研究进展
微囊藻毒素（MCs）的研究进展作者：欧小蕾来源：《中国科技博览》2018年第19期[摘要]微囊藻毒素（MCs）是一类由蓝藻水华产生的一类具有环状结构和间隔双键的七肽单环肝毒素。
其具有毒性大、分布广、结构稳定，是危害人体健康的重要生物毒素之一。
本文主要对微囊藻毒素的来源、分布、化学结构、毒性、毒理效应、分离检测及脱除技术等进行综述。
中图分类号：X52 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）19-0350-02随着我国经济的快速发展，工业废水、生活污水的不断增加和不合理排放，导致我国水体的富营养化程度逐渐加剧，由水体富营养化导致的蓝藻水华和赤潮的发生日趋普遍，已成为一个亟待解决的环境污染问题。
其中最为常见的次生代谢产物--微囊藻毒素（microcystins，MCs）是一类分布最为广泛的肝毒素，其能造成家畜、家禽、野生动物等的中毒死亡，人类饮用含有微囊藻毒素的水体也会导致人体肝脏器官的损伤或者诱发肝癌的高发。
因此，MCs对水体环境的污染和对人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一。
为保障人类对饮用水的食用安全，我国相关管理部门规定了对饮用水体中MCs含量的实时监测，同时对MCs的来源、分布、化学结构、理化性质、毒理毒性、检测及降解脱除技术的改进等，也将成为研究热点。
1.MCs的来源、分布MCs在蓝藻水华中出现的频率最高、产毒量最大，严重威胁人和动物的生命安全。
MCs 属于一种藻细胞内毒素，其主要在蓝藻活细胞内产生合成，当细胞衰老、死亡、溶解或破裂后，毒素就会被释放到水体中。
MCs有毒株（toxic strains）和无毒株（nontoxic strains）之分，它的毒性均由遗传基因决定。
MCs的产生同时还受到环境因素的影响，如光照、温度、pH值、营养盐浓度[1]等，其中光照是毒素产生的一个最重要制约因子[2]，其次是温度。
MCs的分布主要分为区域差异分布和季节差异分布。
目前，就我国的MCs的地域分布情况来看，华东、华南、华中以及西南地区的水体中都已检测出MCs，部分水体中MCs的浓度已超出国家生活饮用水卫生标准限值1μg/L，其中以华东地区尤为突出。
微囊藻毒素(MC-LR)ELISA检测方法的改进及误差分析
最 新 网上 公布 的《 活饮 用水 卫生标 准 》 Ｇ ５４ ２０ ） 生 （ Ｂ ７９— ０５ 征求稿 中 已将 微囊 藻毒素 一 Ｒ 的标 准 值列 入 ， 照 ＷＨ Ｌ 参 Ｏ
标准 ， 定为 ０ ０ １ ｇ Ｌ ．０ ｍ ／ 。 酶联 免疫 吸附分 析法 已广泛 应用 于食 品 、 料 、 料 、 饲 饮
目前 尚没有强 制性 的饮水 中藻毒素 含量 卫生 标 准 ， 各
国 已有 饮水 中的藻毒 素含 量标 准 一 般 都 为微 囊 藻毒 素 一
Ｌ Ｍｉ ｏｙｔ Ｒ（ ｃ ｃｓｎ—Ｌ ＭＣ—Ｌ 的 含 量 。世 界 卫 生 组 织 ｒ ｉ Ｒ， Ｒ）
酶 标板 的方 法可加 快免 疫反应 。
（Ｊ ｎｓ ｓ ｔ ｅｏ ｉｒｂ ｌｇ ｏ ， ｔ、２４ ６ ； ｅｔ ｒ ｉ ａｅＰｅｅ ｔｎａ ｄＣ ｎｒｌ ｆ ｘ Ｃｔ ２４ ０ ） １ｉ ｇｕＩ ｔｕ ｆ ｃｏｉ ｏｙＣ ． Ｌｄ １０ ３ ２Ｃ ｎｅ ｆ ｓ ｓ ｒｖｎｉ ｎ ｏｔ ｉ ｉ １０ １ ａ ｎ ｉｔ Ｍ ｏ ｒｏ Ｄ ｅ ｏ ｏ ｏ Ｗｕ ｙ
尽 管 Ｅ Ｉ 以其 突出 的优 点 如 灵 敏度 高 、 ＬＳ Ａ 操作 简 便 、 成 本低廉 、 全 性 好 等 日渐 被 广 大 水 质 监 测 工 作 者 所 接 安
受 ， 由于不 同地 域 水 质 、 但 污染 性 质 、 污染 程 度 不 同 ， 各地 水 源水 中成 分 复 杂 多 样 ， 些 成 分 会 对 测 定 结 果 造 成 影 有
蔡 正森 孙蔚榕 钮伟 民 张敬平 陆茂林 蔡建荣 赵 晓联ｈ
（ 江苏省微生物研究所有限公司 ， １ 江苏无锡 ２ ４ ６ ； 无锡市疾病预防控制 中心 ， １０ ３ ２ 江苏无锡 ２ ４０ ） １０ １
一种检测微囊藻毒素MC-LR的酶联免疫试剂盒及其检测方法[发明专利]
![一种检测微囊藻毒素MC-LR的酶联免疫试剂盒及其检测方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/ca376bcb951ea76e58fafab069dc5022abea4650.png)
[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 1932519A [43]公开日2007年3月21日[21]申请号200610041452.X [22]申请日2006.09.05[21]申请号200610041452.X[71]申请人江苏省微生物研究所有限责任公司地址214063江苏省无锡市钱荣路7号[72]发明人赵晓联 孙蔚榕 陆茂林 赵春城 龚燕蔡建荣 张东升 蔡正森 时瑾 沈雯琰 [74]专利代理机构无锡市大为专利商标事务所代理人时旭丹[51]Int.CI.G01N 33/543 (2006.01)G01N 33/531 (2006.01)G01N 21/27 (2006.01)权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 2 页[54]发明名称一种检测微囊藻毒素MC－LR的酶联免疫试剂盒及其检测方法[57]摘要一种检测微囊藻毒素MC－LR的酶联免疫分析试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫分析(ELISA)技术领域，用于对水体、饮用水和藻类制品中微囊藻毒素(MC－LR)含量的检测。
本试剂盒测定的基础是标记免疫反应，微孔板包被有MC－LR－BSA，加入MC －LR标准或样品，再加入MC－LR抗体。
游离的MC－LR与微孔板上的MC－LR－BSA竞争MC－LR抗体，没有连接的MC－LR抗体被洗涤除去，加入HRP－羊抗兔抗体，标记免疫反应后没有连接的HRP－羊抗兔抗体被洗涤除去。
加显色液、终止液后，用酶标仪测定其吸光度，吸光度的值与样品中的MC－LR浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中MC－LR的含量。
本试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.25ng/ml。
200610041452.X权 利 要 求 书第1/2页 1、一种检测微囊藻毒素MC-LR的酶联免疫分析试剂盒，其特征是由96或48或24孔包被板(1)，微囊藻毒素标准品(2)，抗微囊藻毒素的抗体冻干品(3)，酶标记的羊抗兔抗体冻干品(4)，洗涤液(5)，显色液A(6)，显色液B(7)和终止液(8)所组成；所述的酶标记的羊抗兔抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗兔抗体冻干品，洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为硫酸溶液。
微囊藻毒素-LR 酶联免疫检测试剂盒(MC-I 型) 说明书
6) 显色底物液 A
1瓶
7) 显色底物液 B
1瓶
8) 终止液
1瓶
9) 浓缩洗涤液(20×)
1瓶
操作流程
样品处理
试剂准备
加入样品/标准品 加入抗体
室温，50min
加入酶标二抗
室温，40min
加入显色底物
室温，10min
吸光度测定
结果分析
结果分析
Absorbance (A)
1.2
1.0
A= - 0.5462 lgC + 0.6979
试剂盒组成
1) 使用说明书 2) 96 孔酶标板板
1份 1 块 (LR-BSA)
3) MC-LR 标准品 5 瓶
(0.2μg/L, 0.5μg/L, 1.0μg/L, 2.0μg/L, 4.0μg/L) 4) 微囊藻毒素-LR 抗体 1 瓶
5) 酶标二抗溶液
1瓶
交叉反应率(%)
工作原理
间接竞争 ELISA 原理示意图
图例(Legend) 固相载体 抗原 抗体 酶标二抗 底物 显色后底物
交叉反应
该试剂盒特异性好，与第四位非精氨酸的微囊 藻毒素几乎没有交叉反应；与第四位为精氨酸的微 囊藻毒素有较小的交叉反应(CR%≤10%)。
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 MC–LR MC–YR MC-RR MC-LF MC–LW Nodularin
0.8
R2 = 0.9997
0.6
0.4
0.2
0.1
1
10
Microcystin-LR (µg/L)
检测平台
相关服务体系
z 了解客户对微囊藻毒素检测和监测的需求；协 助有需要的客户确定合理的监测方案。
活性炭纤维固定化菌对微囊藻毒素MC—LR的去除研究
中 国环 境 科 学
２ ０ １ ４ ， ３ ４ （ ２ ） ：４ ０ ３ － ４ ０ ９
Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ
活性 炭纤维 固定化菌对微囊藻毒素 ＭＣ — Ｌ Ｒ的去 除研 究
袁 媛 ， 吴 涓， 李 玉成 ， 王 宁 （ 安徽大学资源与环境工程学院， 安徽 合肥 ２ ３ ０ ６ ０ １ ）
ＭＣ ＬＲ．
关 键词 ：微 囊 藻毒 素一 Ｌ Ｒ；固 定化 ；活性 炭 纤维 ；去 除率 中图 分类 号 ：Ｘ７ ０ ３ ． ５ 文 献标 识码 ：Ａ 文 章编号 ： １ ０ ０ ０ — ６ ９ ２ ３ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ２ — ０ ４ ０ ３ — ０ ７
Ｒｅ ｍｏ ｖａ ｌ ｏ ｆ ｍｉ ｅ ｒ ｏ ｅ ｙ ｓ ｔ ｉ ｎ — ＬＲ ｂ ｙ ａ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｅ ｙ ｓ ｔ ｉ ｎ － ｄ ｅ ｇ ｒ ａ ｄ ｉ ｎ ｇ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｉ ｍｍ ｏ ｂ ｉ ｌ ￣ｅ ｄ ｂ ｙ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｅ ｄ ｃ ａ ｒ ｂ ｏ ｎ ｉ ｆ ｂ ｅ ￣ ＹＵＡＮ Ｙｕ ａ ｎ ， ｗ Ｕ Ｊ ｕ ａ ｎ ，Ｌ Ｉ Ｙｕ － ｃ ｈ ｅ ｎ ｇ ‘ ＷＡ ＮＧ Ｎｉ ｎ ｇ（ Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆ Ｒｅ ｓ ｏ ｕ ｒ ｃ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ Ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ， Ａｒ ｄ ａ ｕ ｉ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｈｅ ｆ ｅ ｉ
微囊藻毒素的生态学和毒理学研究
微囊藻毒素的生态学和毒理学研究随着人类经济社会的发展，水体污染已经成为一个突出的问题。
其中，富营养化现象引起极大的关注。
微囊藻毒素是水体富营养化现象的一个重要表现，也是造成水体污染的重要原因之一。
因此，微囊藻毒素的生态学和毒理学研究成为了当前生态环境领域内的重要课题之一。
1. 微囊藻毒素的来源及其生态学研究微囊藻是一种重要的水生微生物。
其生长发育旺盛，能够在水体中迅速繁殖，并产生微囊藻毒素。
微囊藻毒素是一类能够影响脊椎动物、贝类和其他水生动植物生长、繁殖及免疫系统的毒素。
微囊藻毒素在水体中广泛存在，不仅对水生动植物产生负面影响，同时也对人类健康产生危害。
因此，微囊藻毒素的生态学研究应作为富营养化问题的重要环节加以关注。
微囊藻毒素在水体中的分布和变化与气候、水体温度、酸碱度、PH值、水深、营养盐等因素息息相关。
通过对这些环境因素的研究，可以更好地了解微囊藻毒素在水体中的分布和变化规律，为有效防治微囊藻毒素提供理论依据。
2. 微囊藻毒素的毒理学研究微囊藻毒素在生态环境中的毒理学效应与其在机体内的毒性作用密切相关。
微囊藻毒素在人体内进入肝细胞及其他器官，导致细胞膜通透性变高、纤维蛋白原合成、蛋白质合成、核酸合成和荷尔蒙合成等生物过程受到抑制或干扰，使人体细胞交流信号失常，严重的时候甚至会导致中毒和死亡。
因此，微囊藻毒素的毒理学研究成为寻找有效控制水生生物污染的重要课题之一。
近年来，通过动物实验和人体暴露实验来研究微囊藻毒素在生物体内的毒性作用已经得到了越来越多的关注。
实验结果表明，在饮用含有微囊藻毒素的水后会影响人体内的脑部神经细胞，甚至导致瘫痪和死亡。
此外，微囊藻毒素还会对人体内多种器官造成伤害，破坏人体正常代谢和免疫系统，给人类健康造成了极大的危害。
3. 微囊藻毒素的治理及其未来发展趋势随着人类对水环境的快速破坏，微囊藻毒素对生态系统的危害逐渐加剧。
治理微囊藻毒素的措施包括增加水中氧气含量、增加水体流动性、减少污染源、降低水体温度和营养盐含量等措施。
微囊藻毒素微生物降解途径与分子机制研究进展
微囊藻毒素微生物降解途径与分子机制研究进展一、内容描述微囊藻毒素(Microcystins,MC)是由某些单细胞藻类产生的一种具有高毒性的天然毒素，广泛存在于海洋环境中。
由于其对生态系统和人类健康的潜在危害，研究微囊藻毒素的微生物降解途径与分子机制具有重要意义。
近年来科学家们在这一领域取得了一系列重要进展。
首先研究人员发现了许多能够降解微囊藻毒素的微生物菌株，这些菌株主要包括细菌、真菌和病毒等，它们可以利用不同的酶类或代谢途径来降解微囊藻毒素。
例如一些细菌通过合成脲酶降解微囊藻毒素中的脲键，从而降低其毒性；真菌则通过降解微囊藻毒素中的脂肪酸酯来达到降解的目的。
此外还有一些病毒可以感染微囊藻并抑制其生长，从而间接地减少微囊藻毒素的产生。
其次科学家们揭示了微囊藻毒素降解过程中的关键酶和代谢途径。
研究表明微囊藻毒素的降解主要涉及多种酶的作用，如脲酶、酯酶、酰胺酶等。
这些酶在不同微生物菌株中具有特异性，可以有效地降解微囊藻毒素。
此外研究还发现，微囊藻毒素的降解过程受到环境因素的影响，如光照、温度、盐度等，这些因素可以影响微生物菌株的生长和代谢途径的选择。
研究人员还探讨了微囊藻毒素降解的分子机制，研究发现微囊藻毒素与微生物菌株之间的相互作用是影响降解效果的关键因素之一。
通过基因工程技术，科学家们已经成功地构建了一些具有抗性基因的微生物菌株，这些菌株可以在高浓度的微囊藻毒素环境中存活并进行有效的降解。
此外研究还发现，微囊藻毒素降解过程中的一些关键酶和代谢产物具有生物活性，可以作为药物或食品添加剂用于环境保护和健康促进等领域。
1. 微囊藻毒素的来源和危害微囊藻毒素是由某些单细胞藻类产生的一种有毒物质，主要存在于海洋中。
这些有毒藻类在生长过程中会分泌出微囊藻毒素，其中包括一些对人体健康具有极大危害的毒素，如艾氏藻毒素、汉氏氏藻毒素等。
微囊藻毒素具有极高的生物活性，能够破坏人体的细胞膜和线粒体功能，导致细胞死亡。
微囊藻毒素水处理方法研究初探
《资源节约与环保》2018年第6期引言微囊藻毒素(Microcystins)是一类七肽单环物质，目前已知有80多种微囊藻毒素相似结构，其中Microcystins-LR 被证实是一种强烈的肝脏肿瘤促进剂。
微囊藻毒素产生于蓝藻水华，它对水体环境和人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一[1-3]。
目前对微囊藻毒素的研究以及实验室去除方法较多[4]。
微囊藻毒素在许多国家和地区饮用水中已经检测出藻毒素。
1微囊藻毒素的性质微囊藻毒素性质稳定，在常规水体中降解速度较慢，存在时间最短数天，最长可至数周。
在水体煮沸条件下不失活，不挥发，pH 变化无影响，溶于水、甲醇或丙酮且水溶性大于1g/L 。
微囊藻毒素能耐300℃高温，常规水处理工艺的混凝沉淀、物理过滤以及曝气等都不能破坏其结构，真核生物和细菌肽酶也不能将其分解。
因此其可在水生生物中富集，微囊藻毒素的去除难度大也正是由于其化学性质具有高稳定性的特点。
2微囊藻毒素的毒害作用2.1微囊藻毒素对多种生物具有毒性作用目前已经证实多种水生生物受到微囊藻毒素的毒性作用，比如鱼类、虾、螃蟹，螺类等。
如果陆地上的生物直接接触或饮用含有微囊藻毒素的水，也会出现中毒现象，严重的甚至在数小时以至数天内死亡。
研究证明，中毒死亡主要是由于肝损伤，微囊藻毒素可以造成肝内出血甚至肝坏死。
2.2微囊藻毒素对人体会产生毒性作用微囊藻毒素对人体的危害主要表现在两个方面：一个方面是直接接触，另一个方面是饮用含有藻毒素的水源。
当人体暴露在含有藻毒素的水体中，会引起皮肤不适、眼睛过敏、疲劳以及肠胃疾病，如果长期如此，甚至会引发皮肤癌。
当人们饮用含有藻毒素的水源，最直接的危害就是引起人体肝脏酶学指标的波动和变化，即使藻毒素平均含量低于0.3g/L ，也会引起肝脏酶学指标变化，从而对肝脏造成损伤，甚至导致肝癌的发生[5]。
3饮用水中藻毒素含量标准目前全世界只针对微囊藻毒素-LR 制定了限量标准。
一株微囊藻毒素降解菌的筛选及鉴定
一株微囊藻毒素降解菌的筛选及鉴定谢维;吴涓;李玉成;何席伟;杜洋;王光云【摘要】从蓝藻爆发期间的巢湖底泥中筛选微囊藻毒素降解菌,为水体中藻毒素-LR(MC-LR)污染的生物治理提供有效的菌源.以MC-LR为唯一碳氮源,利用富集驯化培养技术分离筛选MC-LR降解菌,并对其进行形态观察、生理生化实验及16S rRNA序列分析鉴定.从巢湖底泥中分离得到一株藻毒素-LR降解菌株M6,生理生化实验及分子鉴定结果均表明,该菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus).分离出的MC-LR降解菌为蜡状芽孢杆菌,该菌株对MC-LR有较高的降解能力.%To provide effective microorganisms for the treatment of water polluted by microcystins(MCs), the strains with capablily of biodegrading microeystin LR(MC-LR) were isolated from the sediment of Chaohu Lake. The enrichment culture using MC-LR as the sole carbon source was utilized to isolate the microcystin-degrading strains. The isolated strain was identified according to the observation of morphologica, the physiological and chemical tests and the analysis of 16S rRNA gene sequences. Strain M6 effectively degraded MC-LR. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene showed the similarity of 99% to Bacillus cereus. So, M6 was identified as Bacillus cereus and experimental results showed the strain M6 had the higher degrading capacity for MC-LR.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2012(029)006【总页数】4页(P35-38)【关键词】微囊藻毒素-LR;筛选;鉴定;16S rRNA;微生物降解【作者】谢维;吴涓;李玉成;何席伟;杜洋;王光云【作者单位】安徽大学资源与环境工程学院,合肥230601;安徽大学资源与环境工程学院,合肥230601;安徽大学资源与环境工程学院,合肥230601;安徽大学资源与环境工程学院,合肥230601;安徽大学资源与环境工程学院,合肥230601;安徽大学资源与环境工程学院,合肥230601【正文语种】中文【中图分类】Q93-331;X172近年来，由于工农业的迅速发展导致了富含大量氮、磷等的废水不断流入水体，致使天然水体中蓝藻大范围爆发，给巢湖的生态环境造成了严重的危害［1］。
微囊藻毒素降解菌株及利用其降解MC-LR的方法[发明专利]
![微囊藻毒素降解菌株及利用其降解MC-LR的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/4a39ceefe87101f69f319560.png)
专利名称：微囊藻毒素降解菌株及利用其降解MC-LR的方法专利类型：发明专利
发明人：张文艺,姚立荣,李秋艳,邱小兰,范培成
申请号：CN201110004314.5
申请日：20110111
公开号：CN102154170A
公开日：
20110817
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于环保水处理技术领域，涉及从太湖蓝藻重污染河浜底泥中筛选的微囊藻毒素-LR 降解菌及利用其降解微囊藻毒素的方法。
该菌株现保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.4498。
经鉴定为芽孢杆菌。
利用上述菌种降解MC-LR的方法：将上述微囊藻毒素降解菌按照接种量以质量分数计为2-10%的比例接种到以MC-LR为唯一碳源和氮源的pH为5-9无机盐培养基中，在30℃摇床转速100-180r/min下培养48小时即能降解MC-LR。
本发明所筛选出的菌株源自太湖水体，适应太湖流域的自然环境，对于生物法去除太湖流域水体中的MC-LR具有较广阔的应用前景。
申请人：常州大学
地址：213164 江苏省常州市武进区滆湖路1号
国籍：CN
代理机构：南京经纬专利商标代理有限公司
代理人：楼高潮
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《微囊藻毒素-LR对人体肝脏细胞的遗传毒性及相关机制的研究》
《微囊藻毒素-LR对人体肝脏细胞的遗传毒性及相关机制的研究》一、引言随着现代工业化的快速发展和人类生活方式的改变，环境污染问题日益严重，其中水体污染已成为全球关注的焦点。
微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR，简称MC-LR）是一种常见的蓝藻毒素，广泛存在于受污染的水体中。
MC-LR对人体健康的影响已引起广泛关注，尤其是其对肝脏细胞的遗传毒性问题。
本文旨在探讨MC-LR对人体肝脏细胞的遗传毒性及相关机制，为预防和治疗MC-LR相关疾病提供理论依据。
二、研究方法1. 实验材料选用人正常肝细胞株（L-02）作为实验对象，MC-LR为实验药物。
2. 实验设计将L-02细胞分为不同浓度的MC-LR处理组和对照组，观察MC-LR对细胞的影响。
采用显微镜观察细胞形态变化，通过MTT法测定细胞增殖活性，以及采用流式细胞仪检测细胞凋亡率等指标。
3. 遗传毒性检测采用单细胞凝胶电泳（SCGE）技术检测细胞DNA损伤情况；利用PCR-SSCP技术检测基因突变情况；采用基因芯片技术分析基因表达谱变化。
4. 机制研究通过蛋白质组学技术分析MC-LR处理后差异表达的蛋白质；利用免疫印迹技术（Western blot）验证相关蛋白质的表达；通过生物信息学软件预测和验证MC-LR与靶基因的结合情况。
三、实验结果1. 细胞形态与增殖活性变化显微镜观察发现，随着MC-LR浓度的增加，L-02细胞形态发生明显变化，细胞增殖活性降低。
2. DNA损伤与基因突变SCGE结果显示，MC-LR处理后，L-02细胞DNA损伤程度加重；PCR-SSCP技术检测到基因突变率增加。
3. 基因表达谱变化基因芯片结果显示，MC-LR处理后，L-02细胞中多种基因表达发生改变，涉及细胞周期、凋亡、DNA修复等多个生物学过程。
4. 蛋白质组学分析蛋白质组学技术分析发现，MC-LR处理后，L-02细胞中多种蛋白质表达发生改变，包括与DNA损伤修复、细胞周期调控、凋亡等相关的蛋白质。
微囊藻毒素降解酶mlra的生物学特征及催化机理研究进展
修回日期：2019-10-14
通信作者：王华生（1977—），男，博士，副教授，wanghusheng2005@
第一作者：潘禹（1994—），男，硕士研究生，precious6y@
基金项目：国家自然科学基金项目(21467009)；江西省自然科学基金项目(20192BAB203017)
shown that some bacteria isolated from water bodies and sediments are capable of degrading MCs, which as an
efficient and environmentally friendly strategy for MCs removal. The critical enzyme identified in bacterial strains is
关键词： 微囊藻毒素；酶；生物催化；MlrA；分子生物学
中图分类号：Q 71；X 52
文献标志码：A
开放科学 （资源服务） 标识码 （OSID）：
文章编号： 0438-1157 （2020） 03-0945-10
Progress of biological characterization and mechanism of enzymatic
潘禹，王华生，詹鸿峰，孙缓缓
（江西理工大学建筑与测绘工程学院，江西 赣州 341000）
摘要： 蓝藻水华产生并释放的微囊藻毒素 （microcystins， MCs） 在自然环境中高度稳定，难以被传统水处理技
术有效去除，对饮用水安全及生态系统构成严重威胁。通过微生物代谢作用，可实现 MCs 的高效原位酶促降解。
degradation of microcystinase
富里酸(FA)_对微囊藻毒素-LR_(MC-LR)_的光降解作用及环境影响因素分析
第39卷第2期大连海洋大学学报Vol.39No.2 2024年4月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Apr.2024DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2023-220文章编号:2095-1388(2024)02-0281-08富里酸(FA)对微囊藻毒素-LR(MC-LR)的光降解作用及环境影响因素分析汪艳昭,张静静,张达娟,戴伟,毕相东∗(天津农学院水产学院,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津300384)摘要:为研究自然水环境中溶解性有机质(DOM)对微囊藻毒素-LR(MC-LR)的光降解作用,选择DOM的主要光敏活性组分富里酸(FA)作为光敏剂,在模拟太阳光照射下,对比了不同质量浓度FA(2.5㊁5.0㊁7.5㊁10.0mg/L)溶液中MC-LR的光降解规律和光降解产物,并探究了不同pH㊁光照度对FA光降解MC-LR的影响㊂结果表明:MC-LR能在去离子水中发生直接光降解反应,不同质量浓度的FA对MC-LR的光降解均有促进作用,其中,7.5mg/L FA对MC-LR的光降解作用最强,180min时降解率达52.65%;FA对MC-LR的光降解过程符合二级反应动力学方程,其光降解产物与在去离子水中直接光降解的产物相同;不同pH和光照度下,FA对MC-LR的光降解作用依次为pH6>pH7>pH8>pH9,39.8μmol/(s㊃m2)>56.9μmol/(s㊃m2)>22.8μmol/(s㊃m2)㊂研究表明,pH和光照度均会影响FA对MC-LR的光降解作用,其中,pH为6㊁光照度为39.8μmol/(s㊃m2)时,FA对MC-LR光降解作用最强㊂关键词:富里酸;微囊藻毒素;光降解;溶解性有机质(DOM)中图分类号:S964.3㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀池塘养殖是中国水产养殖的主要生产方式之一㊂随着集约化养殖模式的深入推广,池塘养殖水体富营养化现象日趋严重,蓝藻水华频繁暴发,已成为制约淡水池塘养殖业健康发展的重要因素[1]㊂蓝藻水华在生长和消亡过程中释放的藻毒素会对养殖动物造成较严重和直接的危害,其中,以微囊藻毒素(MCs)危害最大[2]㊂自然水体中MCs质量浓度为1~80μg/L[3],而某些养殖池塘可达2.5mg/L[4]㊂因此,在生产过程中利用有效途径减少池塘养殖水体中MCs浓度,降低其危害已迫在眉睫㊂自然环境中MCs降解主要依赖于微生物降解和光化学降解两种途径[5-6],其中,光化学降解包括直接光降解和间接光降解两种方式㊂MCs不仅可以在紫外光下发生直接光降解[7],还会在光敏剂作用下发生间接光降解[8-9]㊂溶解性有机质(DOM)是自然水体中普遍存在着的一类光敏性物质,主要由富里酸㊁腐殖酸㊁低分子量有机酸和碳水化合物等组成[10]㊂作为MCs间接光降解的重要参与者,DOM在自然水体MCs光降解中发挥着重要作用㊂在太阳光照射下DOM形成激发三重态(3DOM∗),通过能量传递间接降解MCs[11],还可吸收太阳光产生多种活性氧(ROS),如单线态氧(1O2)㊁羟基自由基(㊃OH)㊁超氧阴离子(O-2㊃)和过氧化氢(H2O2),这些活性氧物质可以与MCs发生氧化反应,促进MCs的光降解[9]㊂自然水体中DOM的含量一般低于10mg/L (以C计)[12]㊂除了陆源性DOM经风㊁降雨和地表径流进入外[13],自然水体中DOM主要来自浮游植物代谢和死亡后的残骸[14-15]㊂在养殖池塘中,养殖动物排泄物㊁残饵及施入的有机肥也是内源性DOM的重要来源[16]㊂池塘养殖水环境复杂,水体pH㊁光照条件等因素都会对水中MCs的降解产生一定影响㊂MCs具有200种以上异构体,微囊藻毒素-LR (MC-LR)是淡水养殖池塘中最常见㊁急性毒性最㊀收稿日期:2023-10-16㊀基金项目:国家自然科学基金面上项目(32172978);天津市科技计划项目(22JCYBJC00430,22ZYCGSN00050);甘肃省科技计划项目(21CX6NP223);天津市教委科研计划项目(2021KJ110)㊀作者简介:汪艳昭(1998 ),女,硕士研究生㊂E-mail:1712219286@㊀通信作者:毕相东(1980 ),男,教授㊂E-mail:yl801123@强的异构体[17]㊂本研究中,选择DOM的主要光敏活性组分富里酸(FA)作为光敏剂,在模拟太阳光照射下,对比了不同浓度FA溶液中MC-LR的光降解规律和光降解产物,并探究了不同pH㊁光照度对FA光降解MC-LR的影响,以期为养殖池塘MCs污染控制提供科学参考㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料试验试剂:MC-LR标样,美国苏望尼河富里酸标样(FA StandardⅡ),甲醇㊁三氟乙酸和乙腈为色谱纯,H2SO4㊁NaOH均为分析纯,试验用水为去离子水㊂试验仪器:Agilent1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司),Agilent1290InfinityⅡ-6545液质联用仪(美国Agilent公司),长弧氙灯(上海季光特种照明电器厂),磁力搅拌器(天津科诺仪器设备有限公司)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀MC-LR在不同浓度FA溶液中的光降解试验㊀光降解试验以500W长弧氙灯模拟太阳光作为光源,固定氙灯于玻璃冷阱中央,以保证四周光源的均匀性㊂通过循环冷凝装置保持试验过程中温度恒定㊂分别向5个10mL容量瓶中加入1mL质量浓度为10mg/L的MC-LR储备液,再分别加入0㊁0.25㊁0.50㊁0.75㊁1.00mL质量浓度为100mg/L的FA储备液,加去离子水定容至10mL,并用体积分数为1%的H2SO4和浓度为0.1mol/L 的NaOH分别调节pH至7㊂反应体系中MC-LR终质量浓度为1mg/L,FA终质量浓度分别为0㊁2.5㊁5.0㊁7.5㊁10.0mg/L㊂先将样品置于磁力搅拌器上在避光条件下进行暗反应,10h后立即将样品置于500W氙灯下进行光反应,光源打开的瞬间记为0min㊂在整个暗反应和光反应期间磁力搅拌器均处于持续工作状态,分别在0㊁10㊁20㊁60㊁120㊁180min时取样㊂采用高效液相色谱仪测定MC-LR浓度,采用液质联用仪检测MC-LR的光降解产物㊂1.2.2㊀不同环境条件下MC-LR的光降解试验1)不同pH下MC-LR在FA溶液中的光降解试验㊂反应体系中MC-LR终质量浓度为1mg/L, FA终质量浓度为7.5mg/L,调节反应体系pH,使pH分别为6㊁7㊁8㊁9㊂光反应及暗反应条件同 1.2.1节 ,分别于0㊁10㊁20㊁60㊁120㊁180min时取样并测定MC-LR含量㊂2)不同光照度下MC-LR在FA溶液中的光降解试验㊂反应体系中MC-LR终质量浓度为1mg/L,FA终质量浓度为7.5mg/L,光照度分别设置为0㊁22.8㊁39.8㊁56.9μmol/(s㊃m2)㊂光反应及暗反应条件同 1.2.1节 ,分别于0㊁10㊁20㊁60㊁120㊁180min时取样并测定MC-LR含量㊂1.2.3㊀检测方法㊀液相色谱检测方法:SB-C18柱(4.6mmˑ150mmˑ5μm),流动相为0.05%三氟乙酸+甲醇(二者体积比为40ʒ60),流速为0.8mL/min,检测波长为238nm,进样量为10μL,柱温为40ħ㊂液质联用检测方法:色谱柱为SB-C18柱(4.6mmˑ150mmˑ5μm),流动相A为水,流动相B为乙腈,流速为0.3mL/min,进样量为2μL,柱温为40ħ;电离源为ESI,检测模式为正模式检测,分子量扫描范围为105~1200㊂1.2.4㊀反应动力学方程㊀MC-LR的光催化降解率方程为㊀㊀㊀v=(1-C/C0)ˑ100%㊂(1)式中:v为MC-LR的降解率(%);C㊁C0分别为反应t时刻及初始时刻MC-LR的质量浓度(mg/L)㊂对MC-LR的光降解过程进行动力学[18]拟合:一级反应动力学方程为㊀㊀㊀-ln(C/C0)=k1t㊂(2)二级反应动力学方程为㊀㊀㊀1/C-1/C0=k2t㊂(3)式中:t为光反应时间(min);k1为一级反应动力学常数;k2为二级反应动力学常数㊂FA在MC-LR的光降解过程中会产生光屏蔽作用,且其广泛分布在天然水体中,因此,在分析FA对MC-LR的光降解影响时应建立在扣除光屏蔽作用的基础上进行,根据MC-LR和FA的吸光度及光源条件计算,对表观速率常数进行光屏蔽校正[19-20]:㊀Sλ=1-10-(αλ+ελˑC MC-LR)ˑL2.303(αλ+ελˑC MC-LR)ˑL,(4)㊀k FA=k obs(FA)-k obs(no-FA)ˑSλ㊂(5)式中:k FA为扣除光屏蔽作用后的表观速率常数(min-1);Sλ为光屏蔽系数;ελ为MC-LR的摩尔吸光系数[L/(mol㊃cm)];αλ为FA的消光系数(cm-1);L为光程(cm);C MC-LR为MC-LR的浓度(mol/L);k obs(no-FA)为MC-LR在去离子水中的表观速率常数(min-1);k obs(FA)为MC-LR在FA282大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷存在条件下的表观速率常数(min-1)㊂1.3㊀数据处理采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),显著性水平设为0.05㊂2㊀结果与分析2.1㊀MC-LR在不同浓度FA溶液中的光降解规律2.1.1㊀降解率㊀从图1可见:去离子水中MC-LR 在光照初期降解较快,光照10min时MC-LR降解率可达23.42%,随后降解速度下降,光照180min 时MC-LR降解率为42.91%,表明MC-LR在去离子水中发生了直接光降解反应;在去离子水中添加FA后,前10min各试验组间降解效果无显著性差异(P>0.05),随着降解时间的延长,60~180min 时各FA添加组MC-LR降解率均显著高于去离子水组(P<0.05),且在相同降解时间下,MC-LR降解率随着FA浓度的升高呈先升高后下降趋势,其中, 7.5mg/L FA对MC-LR的光降解作用最强,且在光照180min时MC-LR降解率达到最高(52.65%)㊂∗表示相同时间点FA添加组与去离子水组间有显著性差异(P<0.05)㊂∗means significant difference between the FA addition group and the deionized water group at the same time point(P<0.05).图1㊀MC-LR在不同浓度FA溶液中的降解率Fig.1㊀Degradation rate of MC-LR in different concen-trations of FA solutions 2.1.2㊀反应动力学方程㊀MC-LR的光降解动力学过程复杂,分别采用一级反应动力学和二级反应动力学方程进行拟合,结果见图2,相关光降解动力学参数见表1㊂MC-LR在去离子水中直接光降解的一级动力学拟合相关性R2=0.7351,二级动力学拟合相关性R2=0.8095,表明去离子水中MC-LR 直接光降解更符合二级反应动力学方程;MC-LR 在FA溶液中的光降解二级动力学拟合相关性R2值均高于一级动力学拟合相关性R2值,表明MC-LR在FA溶液中的光降解过程更符合二级反应动力学方程(表1)㊂图2㊀MC-LR在不同浓度FA溶液中的光降解动力学拟合曲线Fig.2㊀Fitting curve of photodegradation kinetics for MC-LR in different concentrations of FA solu-tions表1㊀MC-LR在不同浓度FA溶液中的光降解动力学方程及参数Tab.1㊀Kinetic equations and parameters of photodegradation of MC-LR in different concentrations of FA solutionsρFA/(mg㊃L-1) FA concentration 一级动力学拟合first-order dynamic fitting二级动力学拟合second-order dynamic fitting 方程equation k1/min-1R2方程equation k2/min-1R22.5-ln(C/C0)=0.00285t0.002850.75571/C-1/C0=0.00317t0.003170.83845.0-ln(C/C0)=0.00291t0.002910.70731/C-1/C0=0.00320t0.003200.79687.5-ln(C/C0)=0.00338t0.003380.72251/C-1/C0=0.00385t0.003850.804210.0-ln(C/C0)=0.00309t0.003090.68361/C-1/C0=0.00312t0.003120.7675去离子水deionized water-ln(C/C0)=0.00244t0.002440.73511/C-1/C0=0.00317t0.003170.8095382第2期汪艳昭,等:富里酸(FA)对微囊藻毒素-LR(MC-LR)的光降解作用及环境影响因素分析2.1.3㊀光屏蔽校正㊀从表2可见:MC-LR在不同浓度FA溶液中的光屏蔽系数(Sλ)越小,光屏蔽作用越强,不同浓度FA的光屏蔽作用表现为10.0mg/L>7.5mg/L>5.0mg/L>2.5mg/L;通过光屏蔽校正后,MC-LR在不同浓度FA溶液中的表观速率常数(k FA)表现为7.5mg/L>10.0mg/L> 5.0mg/L>2.5mg/L;不同浓度FA的k obs(no-FA)ˑSλ均小于k obs(FA),说明通过光屏蔽校正后,不同浓度FA均能促进MC-LR的光降解,促进程度表现为7.5mg/L>10.0mg/L>5.0mg/L>2.5mg/L㊂2.2㊀MC-LR在去离子水和FA溶液中的光降解产物在7.5mg/L FA溶液中,MC-LR光降解产物的质荷比(m/z)分别为277.2156㊁292.2267㊁332.2190㊁334.2349㊁336.2518,在去离子水中m/z分别为277.2159㊁292.2267㊁332.2192㊁334.2350㊁336.2517,FA溶液中MC-LR的降解产物与去离子水中的基本相同㊂根据不同产物的准分子离子峰(M+H)+的m/z数据推断产物结构及可能的降解途径见图3,以上大部分产物中Adda 基团的共轭碳双键均被破坏,FA溶液中MC-LR的光降解途径主要通过Adda基团的共轭双键断裂及酰胺键中C-N键的断裂实现㊂表2㊀MC-LR在不同浓度FA溶液中的表观速率常数与光屏蔽系数Tab.2㊀Apparent rate constant and light shielding coeffi-cient of MC-LR in different concentrations of FAsolutionsρFA/(mg㊃L-1)FA concentrationk obs(FA)/min-1Sλk obs(no-FA)ˑSλ/min-1k FA/min-12.50.003170.6110.00190.00135.00.003200.5420.00170.00157.50.003850.4890.00160.002310.00.003120.4420.00140.0017图3㊀MC-LR在去离子水和7.5mg/L FA溶液中的光降解产物Fig.3㊀Photolysis products of MC-LR in deionized water and7.5mg/L FA solution2.3㊀不同pH下FA对MC-LR光降解的影响不同pH的7.5mg/L FA溶液均对MC-LR具有一定的光降解作用,pH为6时,FA对MC-LR的光降解作用最强(图4)㊂分别采用一级反应动力学和二级反应动力学方程拟合不同pH下FA对MC-LR的光降解过程(图5),二级动力学拟合相关性R2值均高于一级动力学R2值,表明不同pH 下FA对MC-LR的光降解过程更符合二级反应动力学方程(表3)㊂2.4㊀不同光照度下FA对MC-LR光降解的影响从图6可见:无光条件下,MC-LR不发生降解反应;有光条件下,7.5mg/L的FA对MC-LR具有图4㊀不同pH下MC-LR在7.5mg/L FA溶液中的降解率Fig.4㊀Degradation rate of MC-LR in7.5mg/L FA so-lution at different pH values一定的光降解作用,3个光照度下的降解率表现为39.8μmol/(s㊃m2)>56.9μmol/(s㊃m2)> 22.8μmol/(s㊃m2)㊂分别采用一级反应动力学和482大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷表3㊀不同pH 下MC-LR 在7.5mg /L FA 溶液中的光降解动力学方程及参数Tab.3㊀Photodegradation kinetic equations and parameters of MC-LR in 7.5mg /L FA solution at different pH valuespH 一级动力学拟合first-order dynamic fitting二级动力学拟合second-order dynamic fitting方程equationk 1/min -1R 2方程equationk 2/min -1R 26-ln(C /C 0)=0.00385t0.003850.78711/C -1/C 0=0.00458t0.004580.90347-ln(C /C 0)=0.00334t0.003340.84441/C -1/C 0=0.00433t0.004330.91488-ln(C /C 0)=0.00230t0.002300.74071/C -1/C 0=0.00269t0.002690.80519-ln(C /C 0)=0.00155t0.001550.92691/C -1/C 0=0.00188t0.001880.9336去离子水deionized water-ln(C /C 0)=0.00183t0.001830.59101/C -1/C 0=0.00268t0.002680.6635图5㊀不同pH 下MC-LR 在7.5mg /L FA 溶液中的光降解动力学方程拟合曲线Fig.5㊀Fitting curve of photodegradation kinetic equa-tion for MC-LR in 7.5mg /L FA solution at dif-ferent pHvalues图6㊀不同光照度下MC-LR 在7.5mg /L FA 溶液中的降解率Fig.6㊀Degradation rate of MC-LR in 7.5mg /L FA so-lution under different light intensities二级反应动力学方程对不同光照度下MC-LR 的光降解过程进行拟合(图7),其中,在56.9㊁39.8μmol /(s㊃m 2)光照度下,二级动力学拟合相图7㊀不同光照度下MC-LR 在7.5mg /L FA 溶液中的光降解动力学方程拟合曲线Fig.7㊀Fitting curve of photodegradation kinetics equa-tion of MC-LR in 7.5mg /L FA solution underdifferent light intensities关性R 2值均高于一级动力学,表明在这2个光照条件下,MC-LR 光降解过程更符合二级反应动力学方程(表4);而在22.8μmol /(s㊃m 2)光照度下,一级动力学拟合相关性R 2值则高于二级动力学,表明在该光照条件下,MC-LR 光降解过程更符合一级反应动力学方程㊂3㊀讨论3.1㊀FA 对MC-LR 的光降解作用MC-LR 在紫外光下可发生直接光降解,而照射到地面的太阳光包括可见光和少量紫外光㊂实验室条件下一般采用氙灯模拟太阳光㊂Yan 等[21]利582第2期汪艳昭,等:富里酸(FA )对微囊藻毒素-LR (MC-LR )的光降解作用及环境影响因素分析表4㊀不同光照度下MC-LR在7.5mg/L FA溶液中的光降解动力学方程及参数Tab.4㊀Kinetic equations and parameters of photodegradation of MC-LR in7.5mg/L FA solution under different light in-tensities光照度/(μmol㊃s-1㊃m2)light intensity 一级动力学拟合first-order dynamic fitting二级动力学拟合second-order dynamic fitting 方程equation k1/min-1R2方程equation k2/min-1R222.8-ln(C/C0)=0.00084t0.000840.22041/C-1/C0=0.00065t0.000650.2164 39.8-ln(C/C0)=0.00440t0.004400.80981/C-1/C0=0.00519t0.005190.9066 56.9-ln(C/C0)=0.00337t0.003370.71901/C-1/C0=0.00382t0.003820.8000暗dark-ln(C/C0)=0.00007t0.000070.46321/C-1/C0=0.00006t0.000060.4634用氙灯模拟太阳光,在Milli-Q水中进行MC-LR光降解试验,光照14h时未监测到MC-LR降解㊂张天芳[22]利用氙灯模拟太阳光,在去离子水中直接光降解MC-LR,10h后MC-LR的去除率为59%㊂本研究中发现,利用氙灯模拟太阳光,去离子水中MC-LR亦发生了直接光降解反应,180min时MC-LR的降解率达到42.91%,所选用的氙灯(500W)波长为170~700nm,其中包括紫外光㊁可见光和红外光㊂不同型号㊁厂家的氙灯在波长范围上存在一定差异,会影响其对MC-LR的光降解效果㊂前期研究发现,对目标污染物的光降解能力既与太阳光的光照度有关,还受光量子产率影响[23-24]㊂选用的氙灯光照度不同,光量子产率存在差异,也会影响MC-LR的直接光降解效果㊂本研究中,在模拟太阳光下,不同浓度FA对MC-LR的光降解均有促进作用,且随着FA浓度升高,光降解作用呈现先升高后下降趋势㊂当FA浓度较低时,主要以光敏剂形式产生3DOM∗和ROS 等物质与MC-LR产生反应,进而促进间接光降解反应发生;随着FA浓度不断增大,促进作用越发明显㊂同时,因FA具有共轭发色团吸光而会产生光屏蔽效应,还会与ROS等相互淬灭[22]㊂随着FA浓度增加,其分子数变多㊁分子层变厚,使得MC-LR在单位面积上接收到的光能辐射变弱㊂此外,FA与MC-LR通过吸附或螯合作用,致使光能向FA转移,FA结构中包含的不饱和键也会与MC-LR进行竞争,致使光降解效率降低[25]㊂随着FA浓度增加,其通过光屏蔽㊁淬灭等对MC-LR光化学反应的抑制作用亦逐渐增强㊂因此,当FA浓度达到一定值时(7.5mg/L)时,对MC-LR的降解效果最好㊂在养殖池塘中,可适当种植水生植物,使其与蓝藻竞争营养盐㊁阳光和氧气等,限制蓝藻生长,从根源上降低了水体中MC-LR含量升高的风险,同时水生植物的茎㊁叶腐败后可增加水体中FA的含量,有利于MC-LR的光降解[26-27]㊂3.2㊀FA对MC-LR光降解的影响因素本研究中,在不同pH条件下,MC-LR降解率随着pH的升高呈下降趋势,MC-LR在酸性条件下的降解效果好于碱性条件下㊂在模拟太阳光照射下酸性溶液更易产生㊃OH,而㊃OH能够促进MC-LR的光降解㊂Yan等[21]发现,在酸性条件下,FA表面电荷被中和,从而促进FA分子的自卷曲和聚集,形成胶束状构象,增强了与疏水化合物MC-LR的结合㊂在碱性条件下,FA表面呈更多负电荷,同时MC-LR中的谷氨酸和甲基天冬氨酸基团去质子化㊂负电荷增加了MC-LR和FA之间的排斥力,从而降低了吸附效果㊂光照度是影响MC-LR降解的重要环境条件因素之一㊂本研究中,在黑暗条件下,MC-LR的浓度基本保持不变;随着光照度的增大,单位溶液的能量密度增加,有利于产生更多的有效光子,其能量越大,所产生ROS浓度就越高,MC-LR的降解也就越快[28];但随着光照度的进一步增强,产生光降解产物分子的效率加快,这些中间产物分子与MC-LR母体分子之间对光能的吸收为竞争关系,大量中间产物累积,对光降解反应具有一定的抑制作用[29]㊂这种竞争作用与ROS所产生的促进作用相互制衡,当光照度为56.9μmol/(s㊃m2)时, MC-LR吸收光能的效率降低,导致光降解速率减慢,因此,当光照度为39.8μmol/(s㊃m2)时, MC-LR的光降解效果最好㊂3.3㊀FA对MC-LR光降解的途径Adda中的共轭碳双键会引起蛋白磷酸酶1 (PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制,因此,该位点是MC-LR的毒性基团[30]㊂本研究中发现,去离子水与FA溶液中MC-LR的降解途径一致,均主要通过Adda基团的共轭碳双键断裂及酰胺键中C-N键断裂实现的,得到了破坏Adda键的产物㊂无论直接光降解还是间接光降解途径,均能使682大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷MC-LR失去毒性作用㊂不同分子量的FA对MC-LR 在水中的光降解影响也得到相似结果[22]㊂Islam 等[31]通过PP2A抑制试验发现,MC-LR经过高铁酸盐氧化处理后其毒性降低,其降解产物与本研究产物有所相似㊂4 结论1)利用氙灯模拟太阳光,MC-LR在去离子水中发生直接光降解反应;FA对MC-LR的光降解有促进作用,且其光降解作用具有浓度依赖性, 7.5mg/L FA对MC-LR光降解作用最强;去离子水与FA溶液中MC-LR的光降解过程均符合二级反应动力学方程㊂2)pH和光照度均会影响FA对MC-LR的光降解作用㊂在本研究条件下,pH为6㊁光照度为39.8μmol/(s㊃m2)时,FA对MC-LR光降解的促进效果最好㊂3)去离子水中与FA溶液中MC-LR的光降解产物相同,光降解途径一致,均能使MC-LR失去毒性作用㊂参考文献:[1]㊀PAERL H W,TUCKER C S.Ecology of blue-green algae in aqua-culture ponds[J].Journal of the World Aquaculture Society,1995, 26(2):109-131.[2]㊀毕相东.微囊藻毒素(MCs)对淡水池塘养殖业的危害及防控研究进展[J].大连海洋大学学报,2021,36(4):535-545.㊀㊀㊀BI X D.Research progress on the harm and control of microcystins (MCs)in freshwater pond aquaculture:a review[J].Journal of Dalian Ocean University,2021,36(4):535-545.(in Chinese) [3]㊀XIE G Y,HU 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Different concentrations of FA led to promote the photolysis of MC-LR,with the best photodegradation at7.5mg/L of FA.There was degradation rate of52.65%in180min.The photodegradation of MC-LR by FA was shown to be conformed to the second-order reaction kinetics,with the same photodegradation products as the direct photolysis products in deionized water.The descending order of photodegradation effects of FA on MC-LR were described as pH6>pH7>pH8>pH9and39.8μmol/(s㊃m2)>56.9μmol/(s㊃m2)>22.8μmol/(s㊃m2),indicating that both pH value and light intensity affected the photodegradation of FA on MC-LR.The best promoting effect of FA on the MC-LR photodegradation was observed at pH6and light intensity of39.8μmol/(s㊃m2).Key words:fulvic acid(FA);MC-LR;photodegradation;dissolved organic matter(DOM)882大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷。
基于水中微囊藻毒素MC-LR去除的不同氧化方法降解机制研究
基于水中微囊藻毒素MC-LR去除的不同氧化方法降解机制研究微囊藻毒素-LR（MC-LR）是有毒蓝藻释放的次级代谢产物,是一种单环七肽肝毒素。
MC-LR化学性质稳定,在常规饮用水处理中无法被有效去除,为此,强化去除水中MC-LR的有效方法、去除途径和降解产物成为水处理领域关注的焦点。
UV辐照、O<sub>3</sub>氧化、UV/H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>氧化和UV/O<sub>3</sub>氧化等方法是较为常见的强化常规饮用水除污染的方法,但将这些方法用于降解MC-LR,仍有许多问题值得研究。
有关UV法、O<sub>3</sub>法和UV/H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>法降解MC-LR的过程、降解路径和产物的研究仍不完善;而UV/O<sub>3</sub>氧化MC-LR的氧化产物、反应位点和降解路径等都鲜有报道;此外,有关上述几种方法降解MC-LR的研究,不同研究人员和不同实验条件,获得的结果往往存在差异,无法对各方法降解MC-LR的效能及降解机制进行直接比较。
因此,深入探讨上述四种方法降解MC-LR的去除效能、影响因素、降解产物和降解路径等,并在相同实验条件下比较各方法降解MC-LR的区别和联系,具有重要的理论意义和实用价值。
本论文从理论研究的角度,分别对UV辐照、O<sub>3</sub>氧化、UV/H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>氧化和UV/O<sub>3</sub>氧化去除水中的MC-LR展开研究。
考察每种方法对MC-LR的去除效能、影响因素及矿化效能,进一步分析检测MC-LR的反应中间产物,并依据产物结构深入探讨MC-LR的反应位点和降解路径。
微囊藻毒素的检测和脱除方法研究进展
微囊藻毒素的检测和脱除方法研究进展
戴宵;廖芊穗;黎晓阳
【期刊名称】《食品安全质量检测学报》
【年(卷),期】2024(15)6
【摘要】近年来,由于富营养化,全球有害蓝藻水华的发生率持续上升,形成水华的蓝藻会释放出多种毒素。
微囊藻毒素是有害蓝藻产生的常见毒素,具有肝毒性、肾毒性、神经毒性、生殖毒性等多种毒性,严重威胁人类和生态系统健康。
微囊藻毒素在水中非常稳定,难以通过传统水处理工艺去除。
因此,寻求经济有效的微囊藻毒素检测和脱除方法至关重要。
本文综述了定量检测和去除微囊藻毒素的方法,包括物理法、化学法和生物法,并分析总结了这3类方法用于检测和脱除微囊藻毒素的优势与局限性,总结了不同方法脱除微囊藻毒素的机理,重点介绍了绿色高效的光催化与安全有效的生物方法脱除微囊藻毒素,最后基于当前的研究结果,对未来微囊藻毒素脱除研究方向进行了展望,为解决环境中微囊藻毒素的污染问题提供思路。
【总页数】8页(P180-187)
【作者】戴宵;廖芊穗;黎晓阳
【作者单位】南昌大学食品学院
【正文语种】中文
【中图分类】X52
【相关文献】
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收稿日期:2007-12-16基金项目:福建省自然科学基金资助项目(D0310007);国家自然科学基金资助项目(50308006)作者简介:李艳波(1978-),女,河南济源人,硕士研究生。
水污染防治假单胞菌M-6菌株对微囊藻毒素MC-LR 的降解机理初探Discussion on Degradation Mechan ism of Microcystin -LR byPseudomonas sp.M -6李艳波1 史 怀2 苑宝玲3 陈彩云3(1.福建省农业职业技术学院 福州 350007);(2.福建省农业科学院生物技术研究所 福州 350003);(3.福州大学环境资源学院 福州 350002)摘要 研究了以假单胞菌M -6菌株对藻毒素M C-L R 的降解机理。
结果表明M -6菌株的胞外物质提取液对M C -LR 没有降解能力,而胞内物质提取液60min 能将15mg /mL 的M C-L R 降解92%。
SDS-P A GE 电泳发现经M C-L R 诱导后M -6菌株胞内有三种蛋白的表达量增加,HP LC 图谱显示在降解过程中产生了两种中间产物和两种终产物。
关键词 假单胞菌M -6菌株 M C-L R 降解机理Abstract T he int racellular ext racts could deg rade 92%of 15mg/mL M icrocy st in-L R in 60mins,w hile the ex tracellu ar didn't have degr adation capabilit y.T he result of SDS-PA GE demonstrated that ex pr ession o f thr ee prot eins are increased after inductio n w ith M icrocy st in-LR.HP LC chr omato gr ams show that ther e ar e tw o inter mediate deg radatio n product s and two end deg radatio n pro ducts.Key words P seudomona s sp.M -6 Micr ocys tin -LR Degradation Mechanism水体富营养化现象以及由此带来的环境与生态问题日益严重,蓝藻爆发性繁殖引起的藻毒素污染就是其中一种[1]。
微囊藻毒素是以动物肝脏为作用靶器官的一类肝毒素,能够特异性地抑制蛋白磷酸酶活性进而诱发癌症等一系列病变,是世界各地广泛存在并且危害极大的一种蓝藻毒素[2]。
MC-LR 是其中存在最广泛,危害最大的藻毒素之一,其分子结构为带有特征的共扼二烯芳香族氨基酸支链的一类环状七肽化合物,结构稳定,在300 高温下还能维持很长时间不分解,传统的水处理工艺很难将MC-LR 从水中去除[3]。
研究生物降解可能是解决大面积藻毒素污染的最佳切入点之一。
近十几年,国内外开展了大量利用微生物方法降解M C-LR 的研究[4],但降解机理方面的研究少见报道。
本实验室从发生水华的水体中分离出一株高效降解M C-LR 的菌株,经鉴定为假单胞菌,并对其降解效能进行了研究[5]。
本文对该菌株降解机理进行了初步的研究,为进一步展开M C-LR 的微生物治理提供有效的菌源与理论依据。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌株 假单胞菌M -6,本实验室从发生水华的水体底泥中分离。
1.1.2 培养基及培养条件 NaH 2PO 40 05%,M gSO 4 7H 2O 0 02%,CaCl 20 01%,K 2H PO 40 05%,自然pH ,M C-LR 15m g/L 。
菌株接种于装有200m L 液体培养基的三角瓶中,30 150rpm 摇床避光培养。
1.2 实验方法M C-LR 含量的H PLC 测定条件[6]:固定相为C-18反相硅胶柱,流动相为乙腈和0 1%三氟乙酸(60!40),流速0 8mL/m in,紫外检测波长238nm ,外标法定量。
本条件下M C -LR 的保留时间为4 7min 。
∀4∀环境保护科学 第34卷 第5期 2008年10月1.2.1 M -6菌株胞内外物质提取液的制备 假单胞菌M -6菌株经诱导培养3d 后取菌液,8000rpm 离心10m in,收集菌体。
上清液为胞外物质,设为A1。
以20倍体积的0 1m ol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7 0)清洗菌体细胞3次,并配制成细胞悬浊液,置于冰浴中超声波破碎15min 。
破碎液8000rpm 离心20min 取上清,即为胞内物质,设为A2。
A1、A2均保存在-4 冰箱中备用。
1.2.2 M -6菌株降解M C-LR 活性物质的定位 将A1和A2分别加入到等体积的30m g/L MC-LR 溶液中,并设空白对照,于30 150rpm 下催化降解M C-LR,每60min 取样测定各溶液中MC-LR 的降解情况。
1.2.3 MC -LR 诱导培养前后M -6菌株的全细胞蛋白电泳 对诱导培养前后M -6菌株的胞内物质提取液进行SDS-PAGE 电泳。
电泳条件:分离胶与浓缩胶浓度分别为15%和5%,10mA 恒定电流4h 。
考马斯亮蓝R -250染色,0 5mol/L NaCl 溶液脱色。
1.2.4 M -6菌株催化降解MC -LR 过程观测 在5mL 离心管中加入胞内物质提取液A2与30m g/L 的M C-LR 溶液各1mL,均匀混合。
于30 ,150rpm 下催化降解MC -LR,每15m in 取样200 L,立即加入2 L 6m ol/L 浓盐酸中止降解反应,H PLC 进行测定。
2 结果与分析2.1 M -6菌株降解M CLR 活性物质的定位假单胞菌M -6的胞内外物质对M C-LR 的降解活性见表1。
A1组与空白对照组中M C-LR 含量均无明显的变化,而A2组中MC -LR 含量则明显降低,60min 时M C -LR 降解率达92%。
由此可以看出,对M C-LR 产生降解作用的为假单胞菌M-6的胞内物质,其胞外代谢物对MC-LR 基本上没有降解能力。
表1 菌株M -6胞内外物质对M C-LR 的降解活性处理初始浓度(mg/L)处理后浓度(mg/L)降解率%胞外物质胞内物质空白对照15 0015 0015 0014 981 214 97-92-2.2 藻毒素诱导培养前后M -6菌株的全细胞蛋白电泳电泳结果见图1。
可以看出,菌株M-6在诱导前后所含蛋白条带总数量相同,表明没有新的蛋白被诱导产生。
但却有一种低分子量蛋白(A)及两种中等分子量蛋白(B 、C)的表达量增加,尤其是蛋白A 和蛋白B 表达量的增加极为明显。
由此可推测这三种蛋白即是与MC-LR 降解有关的酶类,这与鞘氨醇单胞菌降解藻毒素相关的酶在数量上类似[7]。
图1 诱导前后细胞全蛋白SDS-PA GE 电泳结果2.3 M -6菌株催化降解MC -LR 过程观测M-6菌株催化降解M C-LR 过程观测结果见图2。
保留时间4 7min 的峰为M C-LR,反应图2 降解过程的H PL C 谱图15m in 后M C-LR 的峰高明显降低,此时在保留时间4 0m in 处出现了第1个M C-LR 降解产物A 的峰。
反应30m in 后产物A 的峰高有所增大,∀5∀假单胞菌M-6菌株对微囊藻毒素M C-LR 的降解机理初探 李艳波同时在保留时间3 4min和7 2min处出现了MC -LR的第2个和第3个降解产物B和C的峰。
此后随时间的延长,产物A的峰高降低,而产物B 和C的峰逐渐升高,反应60m in后,MC-LR的峰消失。
反应120m in后,产物C的峰开始降低,出现了产物D的峰。
反应10个h后,只检测到产物B和D。
从H PLC图谱的变化中可以看出,MC-LR在假单胞菌M-6菌株胞内酶的催化降解过程中,产生了4个非常明显的降解产物,分别是中间代谢产物A和C以及终产物B和D。
Bourne 等[7]同样降解过程中发现两种M C-LR的降解中间物质,推测是线性的(acyclo-)M C-LR和四肽NH2-ADDA-Glu(iso)-甲基脱氢丙胺酸ala-OH。
本实验及H iro shi等[8]的研究结论与其一致。
3 结论(1)假单胞菌M-6菌株降解M C-LR的活性物质为胞内酶。
(2)至少有三种酶与降解过程有关,这三种酶为非诱导性酶类。
(3)假单胞菌M-6酶促降解M C-LR的过程中产生2个中间产物和2个终产物,推测降解步骤如下:步骤1:酶#将MC-LR降解为中间产物A;步骤2:酶∃将中间产物A降解为终产物B和中间产物C;步骤3:酶%将中间产物C降解为终产物D。
参 考 文 献1.许秋瑾,高光,陈伟民.微囊藻毒素的污染研究进展[J].中国公共卫生,2002,18(6):761-763.2.Haider S,Naithani V,Visw anath an P N,et al.Cyanobacterial tox ins:a g row ing en vironme-ntal concern[J].C hem os phere, 2003(52):1-21.m bert T W,Holm es C F B,H rudey S E.M icrocystin class of toxins:health effects and safety of drin king w ater su pplies[J]. Environ Rev,1994,2(1):167-186.4.Park H D,S as aki Y,M aru yama T,et al.Degradation of the cy anobacterial h epatotoxin microcystin by a new bacterium isolated from a hypertr oph ic lak e[J].En viron.T oxicol.,2001(16):337 -343.5.苑宝玲,李艳波,赵艳玲,等.高效藻毒素降解菌的筛选及其降解藻毒素的效能研究[J].福建师范大学学报(自然科学版),2005, 21(3):48-51.6.苑宝玲,曲久辉.藻类肝毒素的富集提取与分离[J].分析化学, 2001,29(12):1406-1408.7.Bourne D G,J ones G J,Blakeley R L,et al.E nzymatic pathw ay for th e degradation of the cyanobacterial toxin microcystin LR [J].Ap pl E nviron M icrobiol,1996,62(11):4086-4092.8.Hiroshi Ishii,M iyuki Nishijima,T oshih iko Abe.Characteriza tion of degradation progres s of cyanobacteria h epatotoxin s by a gram-negative aerobic bacterium[J].W ater Resear ch,2004 (38):2667-2776.(上接第3页)~2006年来看NO2浓度整体变化呈下降趋势。