铜绿假单胞菌的耐药
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注意：实验室诊断应与临床表现相结合
药物治疗
• 传统药物治疗
哌拉西林，替卡西林 头孢他啶，头孢哌酮 哌拉西林/他唑巴坦 替卡西林/克拉维酸 头孢哌酮舒巴坦 环丙沙星，左氧氟沙星 多粘菌素类（多粘菌素类B、E）
新研发的抗假单胞菌药物
多利培南（Doripenem） 西他沙（sitafloxacin） 比阿培南（Biapenem）
铜绿假单胞菌耐药研究进展
主要内容
1.铜绿假单胞菌的流行病学、病原学、临床意义 2.铜绿假单胞菌的实验室检查 3.铜绿假单胞菌感染的治疗方案 4.铜绿假单胞菌的耐药机制 5.研究进展
流行病学
本菌为条件致病菌，广泛存在于自然界、土壤、水、空气， 在正常人皮肤（如腋下、会阴部和耳道内）、呼吸道和肠 道均存在。 其生存的重要条件是潮湿环境，对外界环境抵抗力较强， 湿热55℃ 、1h方能杀灭，对紫外线不敏感。 儿童带菌率比成人高,应用抗生素治疗者带菌率增高。 住院病人，特别是使用抗生素、糖皮质激素或免疫抑制剂
相关耐药性的最新 研究
铜绿假单胞菌（ＰＡＥ）的多药耐药机制复杂，产β－内酰胺酶是其重要机制之 一。研究表明，ＴＥＭ、ＯＸＡ－１０、ＣＡＲＢ３种β－内酰胺酶基因在PAE 中检出率高。产ＶＩＭ 型金属β－内酰胺酶是医院ＰＡＥ耐亚胺培南的主要机制 之一。细菌外膜孔蛋白ＯｐｒＤ２缺失与ＰＡＥ耐亚胺培南的关系有待进一步研 究。
氨基糖苷类修饰酶（AMEs）能将氨基糖苷类抗生
素的游离氨基乙酰化，将游离羧基磷酸化、核苷化， 使氨基糖苷类抗生素发生钝化，不易进入菌体内， 也不易与细菌内靶位（核糖体30S亚基）结合，从而 失去抑制蛋白质合成的能力，因此细菌在抗生素存 在的情况下仍能存活。
4. 产生灭活酶（ β
内酰胺酶BLA ）
1. 外膜通透性障碍
PA外膜蛋白中的OprC、OprD、OprE是小分子亲水性 抗生素进入细菌的通道，OprF形成大孔通道。孔蛋白 数量的减少或基因突变影响外膜对抗生素的通透性。 孔蛋白形成的通道部分具有特异性，如OprD2孔道是 亚胺培南选择性快速进入菌体的特异性通道，如果 OprD2蛋白缺失或者表达减少是导致PA对亚胺培南耐 药的机制之一，但对美罗培南却无影响。
PA耐药的控制策略
政府：加强药政管理
医院：合理应用抗菌药物，严格掌握用药适应征 及早做出病原学诊断，有针对性地使用抗生素 加强细菌耐药性检测，限制某些抗菌药物使用 严格执行消毒隔离制度 药企：新抗菌药物和质粒消除剂的研制
铜绿假单胞菌对以下药物具有天然耐药性： 氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、第一、 二代头孢菌素、头孢噻肟、头孢曲松、萘啶酸和甲 氧嘧啶等。
耐药机制
耐药机制
1.外膜通透性减低
2.主动外排泵系统
3.抗菌药物作用的靶位的改变
4.产生灭活酶 5.生物膜（BF）的形成
1. 外膜通透性障碍
抗生素通过两种途径进入细菌外膜，亲水性抗生素的孔蛋 白通道和疏水性抗生素的脂质介导通道。如果这些通道改 变或缺失，抗生素将不能进入细菌到达作用靶位，从而使 细菌产生耐药性。 PA的外膜通透性极低，仅为大肠埃希菌的1%-8%，这是 PA对多种抗生素天然耐药的重要原因之一。β内酰胺类、 四环素、氯霉素、喹诺酮类只能通过孔蛋白提供的水通道 跨越外膜。
革兰染色
电镜
分离培养
• 专性需氧、营养要求不高 • 普通培养基： 18-24h圆形 、大小不一、 边缘不整 扁平、 湿 润 、金属光泽常呈融合态， 琼脂被染成绿或黄绿 。 • MAC：微小无光泽半透明 48h后菌落呈棕色 • 血平版：扁平 湿润 有金属光泽 琼脂被染成蓝绿或灰绿 有透 明溶血环 • 有特殊生姜气味
治疗的病人，呼吸道内该菌的寄植增多。
流行病学
感染途径：
内源性：自身上呼吸道、肠道、皮肤、生殖道等
外源性：其他病人或带菌的健康工作人员，经手、飞沫或 污染的医疗器械而传播。
病原学
革兰氏阴性杆菌，单个、成对或短链状排列。
多数菌株分泌绿脓菌素和荧光素，呈蓝绿色，故名绿脓杆菌。 菌体一端有1～3根鞭毛，故有动力，较活泼，无荚膜或芽胞。 专性需氧菌，生长要求不高，在普通培养基上生长良好，最 适宜温度为35℃。 有很强的蛋白分解能力，但发酵糖类能力低。
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs） 金属β-内酰胺酶（MBLs）
又称金属酶或碳青霉烯酶，MBLs通过半胱氨酸、组氨酸、天冬氨 酸等活性位点的氨基酸与锌离子结合，锌再结合水分子使其活化，成 为亲核试剂，从而水解包括碳青霉烯类在内的几乎所有β-内酰胺类 抗菌药物，其活性不能被克拉维酸、他唑巴坦等常见的β-内酰胺酶 抑制剂抑制。主要由假单胞菌属、脆弱拟杆菌属、产黄菌属、沙雷菌 属及嗜麦芽黄单胞杆菌属产生。
常见非发酵菌初步分群鉴定
试验 假单胞 不动杆 产碱杆 黄杆 莫拉 菌属 菌 属 菌 属 菌属 菌属
氧化酶 葡萄糖O/F 动力 MAC平板生长
+ O/+ +
O/+
+ + +
+ O/F +/-
+ -
鉴定
• 初步鉴定 菌体形态 菌落特征 产色素 气味 氧化酶 • 最终鉴定 非发酵菌生化鉴定系统 API-NE试条
外排泵由三部分组成：
①外膜蛋白：形成门通道，有利于底物通过外膜； ②膜融合蛋白或连结蛋白，连接内、外膜蛋白；
③内膜蛋白，为主要的泵出蛋白，具有识别底物的作用， 但不具特异性。
3.药物作用靶位的改变
青霉素结合蛋白（penicilin binding proteins,PBPs）
PBPs数量、结构的改变导致其与抗生素亲和力降低，产生 缓慢结合的PBPs或者诱导性PBPs增多均能导致PA对β内酰 胺类抗生素产生耐药。
致病性
致病物质
菌毛 荚膜多糖（藻酸盐 ）
生物学活性
对宿主细胞具有粘附作用 抗吞噬作用 致发热，休克，DIC等 抑制蛋白质合成 有杀白细胞素等，能损伤细胞和组织
毒素
内毒素 外毒素A 细胞溶解毒素
蛋白分解酶
胞外酶S 弹性蛋白酶
碱性蛋白酶 磷酸酯酶C
分解蛋白质，损伤多种细胞和组织
人类肺部感染的重要因子 损伤血管，抑制中性粒细胞功能
脓液 痰 尿液等
血液 环境用品 分离培养 直接涂片染色
肉汤增菌
血平板、MAC
37 ℃18-24h
可疑菌落（金属光泽、β-溶血、产绿色素、特殊气味）
初步鉴定
最后鉴定
菌落 色素
革兰阴性杆菌 氧化酶(+)
非发酵菌鉴定系统鉴定
血清分型
检验程序
直接检镜
为革兰阴性菌，菌体大小（1.5～5.0)um×宽(0.5～1)um，细长且长短不 一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，无 芽胞
◆ DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ位点改变
◆ 此外，二氢叶酸合成酶发生结构改变，可使磺胺类 药物的亲和力降低，从而引起对磺胺类药物耐药；
◆ 氨基糖苷类抗生素的作用靶位16SrRNA发生基因突变 也可导致PA对氨基糖苷类抗生素耐药。
3. 产生灭活酶（ 氨基糖苷类修饰酶）
AMEs由质粒编码，可分为乙酰转移酶、磷酸转移 酶和核苷酸转移酶三类。
1. 外膜通透性障碍
氨基糖苷类和多粘菌素E并不通过外膜孔蛋白进入细 胞内，而是先粘附在外膜的脂多糖上，再促进自身 被细菌摄入，干涉细菌核糖体蛋白质的合成，进而 产生抗菌作用。OprH的过度表达可防碍氨基糖苷类 和多粘菌素E的粘附作用，从而导致耐药，但是这种 耐药形式尚未在临床菌株中广泛发现。
2.主动外排泵系统
ＰＡＥ对氨基糖苷类抗菌药物耐药是因为产氨基糖苷类修饰酶（ＡＭＥ ｓ）和作用靶位１６ＳｒＲＮＡ基因突变而致。 阿米卡星修饰酶ａａｃ（６′）和核苷转移酶ａｎｔ（２′）较常见。ａａ ｃ（６′）－Ⅰｂ引起对阿米卡星、妥布霉素耐药， ａａｃ（６′）－Ⅱ引起对庆大霉素、妥布霉素耐药，ａｎｔ（２′）－Ⅰ 引起对庆大霉素、妥布霉素耐药。 普通组PAE ａａｃ（６′）－Ⅰｂ、ａａｃ（６′）－Ⅱ检出率为100%， ａｎｔ（２′）－Ⅰ检出率为52.2％，但铜绿假单胞菌对阿米卡星、庆大 霉素、妥布霉素敏感。 泛耐药组基因检出率与耐药性成正比。产生ＡＭＥｓ不是细菌耐氨基糖 苷类抗菌药物的决定性因素。
损伤组织，抗补体，灭活IgG，抑制中性粒细胞功能 组织损伤
Biblioteka Baidu 临床意义
• 经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎 等。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败 血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。 • 本菌所致感染的临床表现取决于受累部位。
化脓性内 眼炎
继发性铜 绿假单胞 菌感染
普通平板
MAC平板
血平板
生化实验
• 该菌氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖和木糖，产酸不产气， 但不分解乳糖和蔗糖。液化明胶、可分解尿素，还原硝酸 盐为亚硝酸盐并产生氮气，吲哚阴性，利用枸橼酸盐，精 氨酸双水解酶阳性。 • 生长实验：该菌在4℃不生长而在42℃可以生长
分型 • （1）噬菌体分型：所应用的噬菌体现有24株，分型率达90%。 • （2）血清学分型：利用O抗原进行分型，可分20个血清型。 • （3）核酸检测：质粒指纹图谱分型、脉冲场凝胶电泳分型、其他快 速分子生物学（基因芯片、PCR技术、16SrDNA分型）鉴定
头孢菌素酶（AmpC酶）
AmpC酶作用于头孢菌素，但不被β-内酰胺酶抑制剂抑制。PA中 的AmpC酶是典型的诱导酶。产生菌主要是革兰阴性菌，如假单胞菌、 肠杆菌、不动杆菌和克雷伯杆菌等，由染色体介导。
5. 生物膜（BF）的形成
生物膜是指细菌吸附于生物材料（气管插管）或 机体腔道表面，分泌胞外多糖（EPS)、纤维蛋白、 脂蛋白等，将自身包绕其中而形成的膜样物质。
药物治疗
• 传统药物治疗
哌拉西林，替卡西林 头孢他啶，头孢哌酮 哌拉西林/他唑巴坦 替卡西林/克拉维酸 头孢哌酮舒巴坦 环丙沙星，左氧氟沙星 多粘菌素类（多粘菌素类B、E）
新研发的抗假单胞菌药物
多利培南（Doripenem） 西他沙（sitafloxacin） 比阿培南（Biapenem）
铜绿假单胞菌耐药研究进展
主要内容
1.铜绿假单胞菌的流行病学、病原学、临床意义 2.铜绿假单胞菌的实验室检查 3.铜绿假单胞菌感染的治疗方案 4.铜绿假单胞菌的耐药机制 5.研究进展
流行病学
本菌为条件致病菌，广泛存在于自然界、土壤、水、空气， 在正常人皮肤（如腋下、会阴部和耳道内）、呼吸道和肠 道均存在。 其生存的重要条件是潮湿环境，对外界环境抵抗力较强， 湿热55℃ 、1h方能杀灭，对紫外线不敏感。 儿童带菌率比成人高,应用抗生素治疗者带菌率增高。 住院病人，特别是使用抗生素、糖皮质激素或免疫抑制剂
相关耐药性的最新 研究
铜绿假单胞菌（ＰＡＥ）的多药耐药机制复杂，产β－内酰胺酶是其重要机制之 一。研究表明，ＴＥＭ、ＯＸＡ－１０、ＣＡＲＢ３种β－内酰胺酶基因在PAE 中检出率高。产ＶＩＭ 型金属β－内酰胺酶是医院ＰＡＥ耐亚胺培南的主要机制 之一。细菌外膜孔蛋白ＯｐｒＤ２缺失与ＰＡＥ耐亚胺培南的关系有待进一步研 究。
氨基糖苷类修饰酶（AMEs）能将氨基糖苷类抗生
素的游离氨基乙酰化，将游离羧基磷酸化、核苷化， 使氨基糖苷类抗生素发生钝化，不易进入菌体内， 也不易与细菌内靶位（核糖体30S亚基）结合，从而 失去抑制蛋白质合成的能力，因此细菌在抗生素存 在的情况下仍能存活。
4. 产生灭活酶（ β
内酰胺酶BLA ）
1. 外膜通透性障碍
PA外膜蛋白中的OprC、OprD、OprE是小分子亲水性 抗生素进入细菌的通道，OprF形成大孔通道。孔蛋白 数量的减少或基因突变影响外膜对抗生素的通透性。 孔蛋白形成的通道部分具有特异性，如OprD2孔道是 亚胺培南选择性快速进入菌体的特异性通道，如果 OprD2蛋白缺失或者表达减少是导致PA对亚胺培南耐 药的机制之一，但对美罗培南却无影响。
PA耐药的控制策略
政府：加强药政管理
医院：合理应用抗菌药物，严格掌握用药适应征 及早做出病原学诊断，有针对性地使用抗生素 加强细菌耐药性检测，限制某些抗菌药物使用 严格执行消毒隔离制度 药企：新抗菌药物和质粒消除剂的研制
铜绿假单胞菌对以下药物具有天然耐药性： 氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、第一、 二代头孢菌素、头孢噻肟、头孢曲松、萘啶酸和甲 氧嘧啶等。
耐药机制
耐药机制
1.外膜通透性减低
2.主动外排泵系统
3.抗菌药物作用的靶位的改变
4.产生灭活酶 5.生物膜（BF）的形成
1. 外膜通透性障碍
抗生素通过两种途径进入细菌外膜，亲水性抗生素的孔蛋 白通道和疏水性抗生素的脂质介导通道。如果这些通道改 变或缺失，抗生素将不能进入细菌到达作用靶位，从而使 细菌产生耐药性。 PA的外膜通透性极低，仅为大肠埃希菌的1%-8%，这是 PA对多种抗生素天然耐药的重要原因之一。β内酰胺类、 四环素、氯霉素、喹诺酮类只能通过孔蛋白提供的水通道 跨越外膜。
革兰染色
电镜
分离培养
• 专性需氧、营养要求不高 • 普通培养基： 18-24h圆形 、大小不一、 边缘不整 扁平、 湿 润 、金属光泽常呈融合态， 琼脂被染成绿或黄绿 。 • MAC：微小无光泽半透明 48h后菌落呈棕色 • 血平版：扁平 湿润 有金属光泽 琼脂被染成蓝绿或灰绿 有透 明溶血环 • 有特殊生姜气味
治疗的病人，呼吸道内该菌的寄植增多。
流行病学
感染途径：
内源性：自身上呼吸道、肠道、皮肤、生殖道等
外源性：其他病人或带菌的健康工作人员，经手、飞沫或 污染的医疗器械而传播。
病原学
革兰氏阴性杆菌，单个、成对或短链状排列。
多数菌株分泌绿脓菌素和荧光素，呈蓝绿色，故名绿脓杆菌。 菌体一端有1～3根鞭毛，故有动力，较活泼，无荚膜或芽胞。 专性需氧菌，生长要求不高，在普通培养基上生长良好，最 适宜温度为35℃。 有很强的蛋白分解能力，但发酵糖类能力低。
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs） 金属β-内酰胺酶（MBLs）
又称金属酶或碳青霉烯酶，MBLs通过半胱氨酸、组氨酸、天冬氨 酸等活性位点的氨基酸与锌离子结合，锌再结合水分子使其活化，成 为亲核试剂，从而水解包括碳青霉烯类在内的几乎所有β-内酰胺类 抗菌药物，其活性不能被克拉维酸、他唑巴坦等常见的β-内酰胺酶 抑制剂抑制。主要由假单胞菌属、脆弱拟杆菌属、产黄菌属、沙雷菌 属及嗜麦芽黄单胞杆菌属产生。
常见非发酵菌初步分群鉴定
试验 假单胞 不动杆 产碱杆 黄杆 莫拉 菌属 菌 属 菌 属 菌属 菌属
氧化酶 葡萄糖O/F 动力 MAC平板生长
+ O/+ +
O/+
+ + +
+ O/F +/-
+ -
鉴定
• 初步鉴定 菌体形态 菌落特征 产色素 气味 氧化酶 • 最终鉴定 非发酵菌生化鉴定系统 API-NE试条
外排泵由三部分组成：
①外膜蛋白：形成门通道，有利于底物通过外膜； ②膜融合蛋白或连结蛋白，连接内、外膜蛋白；
③内膜蛋白，为主要的泵出蛋白，具有识别底物的作用， 但不具特异性。
3.药物作用靶位的改变
青霉素结合蛋白（penicilin binding proteins,PBPs）
PBPs数量、结构的改变导致其与抗生素亲和力降低，产生 缓慢结合的PBPs或者诱导性PBPs增多均能导致PA对β内酰 胺类抗生素产生耐药。
致病性
致病物质
菌毛 荚膜多糖（藻酸盐 ）
生物学活性
对宿主细胞具有粘附作用 抗吞噬作用 致发热，休克，DIC等 抑制蛋白质合成 有杀白细胞素等，能损伤细胞和组织
毒素
内毒素 外毒素A 细胞溶解毒素
蛋白分解酶
胞外酶S 弹性蛋白酶
碱性蛋白酶 磷酸酯酶C
分解蛋白质，损伤多种细胞和组织
人类肺部感染的重要因子 损伤血管，抑制中性粒细胞功能
脓液 痰 尿液等
血液 环境用品 分离培养 直接涂片染色
肉汤增菌
血平板、MAC
37 ℃18-24h
可疑菌落（金属光泽、β-溶血、产绿色素、特殊气味）
初步鉴定
最后鉴定
菌落 色素
革兰阴性杆菌 氧化酶(+)
非发酵菌鉴定系统鉴定
血清分型
检验程序
直接检镜
为革兰阴性菌，菌体大小（1.5～5.0)um×宽(0.5～1)um，细长且长短不 一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，无 芽胞
◆ DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ位点改变
◆ 此外，二氢叶酸合成酶发生结构改变，可使磺胺类 药物的亲和力降低，从而引起对磺胺类药物耐药；
◆ 氨基糖苷类抗生素的作用靶位16SrRNA发生基因突变 也可导致PA对氨基糖苷类抗生素耐药。
3. 产生灭活酶（ 氨基糖苷类修饰酶）
AMEs由质粒编码，可分为乙酰转移酶、磷酸转移 酶和核苷酸转移酶三类。
1. 外膜通透性障碍
氨基糖苷类和多粘菌素E并不通过外膜孔蛋白进入细 胞内，而是先粘附在外膜的脂多糖上，再促进自身 被细菌摄入，干涉细菌核糖体蛋白质的合成，进而 产生抗菌作用。OprH的过度表达可防碍氨基糖苷类 和多粘菌素E的粘附作用，从而导致耐药，但是这种 耐药形式尚未在临床菌株中广泛发现。
2.主动外排泵系统
ＰＡＥ对氨基糖苷类抗菌药物耐药是因为产氨基糖苷类修饰酶（ＡＭＥ ｓ）和作用靶位１６ＳｒＲＮＡ基因突变而致。 阿米卡星修饰酶ａａｃ（６′）和核苷转移酶ａｎｔ（２′）较常见。ａａ ｃ（６′）－Ⅰｂ引起对阿米卡星、妥布霉素耐药， ａａｃ（６′）－Ⅱ引起对庆大霉素、妥布霉素耐药，ａｎｔ（２′）－Ⅰ 引起对庆大霉素、妥布霉素耐药。 普通组PAE ａａｃ（６′）－Ⅰｂ、ａａｃ（６′）－Ⅱ检出率为100%， ａｎｔ（２′）－Ⅰ检出率为52.2％，但铜绿假单胞菌对阿米卡星、庆大 霉素、妥布霉素敏感。 泛耐药组基因检出率与耐药性成正比。产生ＡＭＥｓ不是细菌耐氨基糖 苷类抗菌药物的决定性因素。
损伤组织，抗补体，灭活IgG，抑制中性粒细胞功能 组织损伤
Biblioteka Baidu 临床意义
• 经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎 等。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败 血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。 • 本菌所致感染的临床表现取决于受累部位。
化脓性内 眼炎
继发性铜 绿假单胞 菌感染
普通平板
MAC平板
血平板
生化实验
• 该菌氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖和木糖，产酸不产气， 但不分解乳糖和蔗糖。液化明胶、可分解尿素，还原硝酸 盐为亚硝酸盐并产生氮气，吲哚阴性，利用枸橼酸盐，精 氨酸双水解酶阳性。 • 生长实验：该菌在4℃不生长而在42℃可以生长
分型 • （1）噬菌体分型：所应用的噬菌体现有24株，分型率达90%。 • （2）血清学分型：利用O抗原进行分型，可分20个血清型。 • （3）核酸检测：质粒指纹图谱分型、脉冲场凝胶电泳分型、其他快 速分子生物学（基因芯片、PCR技术、16SrDNA分型）鉴定
头孢菌素酶（AmpC酶）
AmpC酶作用于头孢菌素，但不被β-内酰胺酶抑制剂抑制。PA中 的AmpC酶是典型的诱导酶。产生菌主要是革兰阴性菌，如假单胞菌、 肠杆菌、不动杆菌和克雷伯杆菌等，由染色体介导。
5. 生物膜（BF）的形成
生物膜是指细菌吸附于生物材料（气管插管）或 机体腔道表面，分泌胞外多糖（EPS)、纤维蛋白、 脂蛋白等，将自身包绕其中而形成的膜样物质。