人脐血间充质干细胞体外分离、培养与鉴定

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人脐血间充质干细胞的体外培养

１１材料．
无菌条件下取本院正常足月剖腹产胎
的ＭｓｃｋＴｅｅｕＭ进行培养，ｎ观察细胞贴壁延伸及原代培养时间。⑤观察首次换液时间对细胞生长的影响：行以上研究时，进分别于接种后第２—７ｄ首次换液，将换下的液体转人新瓶继续培养至少６ｄ观，察是否仍有贴壁细胞，以确定首次换液时间。⑥观察不同培养基对细胞生长的影响：８份脐血，取以
１ｎ分离，获得的单个核细胞均分，１×１５ｍｉ将以０／
ｍｌ１×１。ｌ１×１ｍｌ１×１ｍｌ种于ＦＳ包、０ｍ、０／、０／接Ｂ
性，为其在组织工程方面的应用进行初步探索。
１材பைடு நூலகம் 与方法
被的培养瓶中。首次换液时间３ｄ用含１％ＦＳ，０Ｂ
液面清晰，稀释脐血与淋巴细胞分离液的柱高比为
３— ：。用Ｆｃｌ以适当的速度及时问离心，５】ｉ法ｄ取中间界面白膜层，ＰＳ后吹打，１５０ｒｍｉ加Ｂ以０／ｎ离
心５ｍｎ弃上清，ｉ，共洗涤２次，后加入培养基；以一定密度接种于培养瓶中，３置７℃ 、积分数为５％体的ＣＯ饱和湿度的孵箱中培养，细胞到８％融合时０用０２％胰酶和００％乙二胺四乙酸（：）．５．４１１消化，１：传代培养。２１２方法 ①不同离心速度及时间分离脐血单个．
以往研究 ¨ 表明，血中存在间充质干细胞脐

无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞

无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【摘要】目的用体外无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞.方法取1例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织块贴壁培养,使用无血清培养体系培养获得人脐带间充质干细胞.通过形态学观察,成脂、成骨、成软骨诱导分化能力检测及流式细胞术免疫表型检测进行鉴定.结果组织块贴壁培养6天后可见细胞从组织块边沿爬出;培养15天后,达到80％汇合,生长状况良好,细胞呈梭形,为典型的成纤维细胞形态,极性整齐排列,集落呈涡旋状,形态较均一.传代培养的第三代细胞CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性表达,不表达CD34和CD45,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力.结论无血清培养体系组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞法成功率高,其生物学特性稳定,并能消除由未确定的病原体引起的风险.【期刊名称】《皮肤病与性病》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】3页(P4-6)【关键词】脐带间充质干细胞;分离;贴壁培养【作者】张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【作者单位】昆明医科大学基础医学院,云南昆明650500;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101【正文语种】中文【中图分类】R392-33人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs）是从人脐带组织中分离的间充质干细胞，具有增殖能力，如：神经元样细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞及少突胶质细胞分化的能力，由于脐带体外细胞能迅速扩增，生物性能稳定，取材比较容易并且细胞来源相对广泛，在细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的前景，已经成为治疗的一种新的种子细胞来源[1、2]。

“三阶段法”分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞

＿ＬＡ，Ｕｒｍｑ３００，Ｃｈｎ）Ｐｕｉ８００ｉａ
Ａｂｔａｔｓｒｃ：ＯｂｅｔｖＴｏｃｌｕｒｎｄｎｉｙｈｕａｍｂｌｃ１ｃｒｏｄＭＳＣｓ（ｅｅｈｙａｔｍｅｌ）ｉｃｉｅｕｔｅａｄｉｅｔｆｍｎｕｉｉａｏｄｂｌｏｍｓｎｃｍｌｓｅｃｌｓ
ｔｈｈｉｄｇｎｒｔｏｏｒｉｅｔｆｎ．ＲｅｕｔＴｈｒｅｇｏｕｆＭＳＣｓｗｅｅｓｐｒｔｄｆｏ４ｇｒｕｏｔｅｔｒｅｅａｉｎｆｄｎｉｙｉｇｓｌｓｅｒｐｓｏｒｅａａｅｒｍｏｐｓｏｆｓｍｐｌｓａｅ．Ｂｙｌｗｃｔｍｅｒａｌｓｓｎｇ，ｃｌｓｘｅｓｄｆｏｙｏｔｙｎａｙｉｉｅｌｅｐｒｓｅＭＳＣｓｕｒａｅａｋｒｏＣＤ２ｓｆｃｍｒｅｓｆ９，ＣＤ４ａ４ｎｄＣＤ１ｏｉｉｅｙａｐｓｔｖｌｎｄＣＤ３ｇａｉｅｙＴｈｅｒｓｌｆｔｆｅｅｉｔｏｎｏｓｅｂｌｓ —ｉｅｌｅｉｅｒｍ０５４ｎｅｔｖｌ．ｅｕｔｏｈｅｄｉｆｒｎｔａｉｆｏｔｏａｔｌｋｅｃｌｓｄｒｖｄｆｏｈｕｍａｍｂｌｃｌｃｒｏｏｓｐｉｉｅａｓｎｕｉｉａｏｄｂｌｄｗａｏｓｔｖｌｏ．ＣｏｌｉｎＷｅｃｎｅｓｌｎｆｅｔｖｅｙｓｐｒｔＳＣｓｎｃｕｓｏａａｉｙａｄｅｆｃｉｌｅａａｅＭｆｏｅｐｐｏｃ．ｒｍｍａｌｌＣｏｄＢｌｏｈｒｅｐｓｓａｒａｈｃＫｅｒｓ：ｈｕｍａｍｂｌｃｌｃｒｏｄ；ｍｅｅｈｙａｔｍｅｌ；ｉｉｒｕｔｒｙｗｏｄｎｕｉｉａｏｄｂｌｏｓｎｃｍｌｓｅｃｌｓｎｖｔｏｃｌｕｅ

人脐血间充质干细胞来源的外泌体_分离鉴定及生物学特性_张娟

中国组织工程研究第18卷第37期 2014–09–03出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH5955www.CRTER.org张娟，女，1988年生，河北省玉田县人，汉族，内蒙古医科大学免疫学在读硕士，医师，主要从事干细胞的基础与临床应用研究。

通讯作者：王彩生，硕士，主任医师，内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031并列通讯作者：魏来，博士，教授，北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.37.009 []中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05955-06 稿件接受：2014-07-31Zhang Juan, Studying for master’s degree, Physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, ChinaCorresponding author: Wang Cai-sheng, Master, Chief physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, ChinaCorresponding author: Wei Lai, M.D., Professor, Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, ChinaAccepted: 2014-07-31人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性张娟1，刘峰2，张薇2，丛旭2，王彩生1，3，魏来2(1内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；2北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044；3呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031)文章亮点：1 研究发现间充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复作用。

脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

ｌｓｏｌａｔｉｏｎ，ＣｈａｒａＣｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ
ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃａｎｄａｄｉｐｏｇｅｎｉｃｄＩｆｆｅｒｅｎＩＩａｌ０ｎｐｏｔｅｎｔｉａ１ｗｉｔｈｐｒｏｐｅｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ．ＭｅｔｈｏｄｓＵｍｂｉｌｉｃａＩ
・
基础研究・
・
论著・
脐血问充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究
潘丽杰，陈妍，袁杰
（哈尔滨医科大学附属口腔医学院口腔预防保健科黑龙江哈尔滨１５０００１）
［摘要］目的：分离培养人脐血间充质干细胞（ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｂ１ｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍ
１５０００１，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｓｏｌａｔｅａｎ（】（：ｕｌｔｕｒｅｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｂｌｏｏｄ — ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍ

人脐血间充质干细胞体外向神经元样细胞分化的实验研究

ｍｅｉｍ．Ａｆｅｒａｅｔ０ｆｌＬｒｔｏｃａｉｎ１／／ａｉｉｒｂａｔｇｏｈｆｃｏ，ｄｕｔｒｔｅｔｄｗｉｈ３ｌ／ｅｉｉｃｄａｄＬＬｂｓｃｆｏｌｓｒｗｔａｔｒｍｏｎ０ｇｂ
ｓｅｃｌｓｉｕｃｄｉｏｎｅｒｔｍｅｌｎｄｅｎｔｕｏｎ—ｉｅｌ．ＭｅｈｏｓＭｏｎｕｌａｅｌｒｒｐｒｄｆｏｈｐｒｎｉｅｌｋｅｃｉｓｔｄｎｏｃｅｒｃｉｓｗｅｅｐｅａｅｒｍｅａｉｚｄｈｕｎｍｂｌｃｌｏｄｂｌｏｄｓｍｐｅｅｒｆｇａｉｏｅｍａｕｉｉａｃｒｏａｌｓｂｙｃｎｔｉｕｔｏｎｖｒＬｙｍｐｈｒｐａｄｃｌｕｒｄｎＭｅｅＣｕｌｏｐｅｎｕｔｅｉｓｎｔ
［ｓｒｃＡｂｔａｔ］ＯｂｅｔｖｎｅｔｇｔｈｅｓｂｌｙｏｕｎｕｉｃｌｃｒｌｏｓｎｈｍａｊｃｉｅＴｏｉｖｓｉａｅｔｅｆａｉｉｔｆｈｍａｍｂｌａｏｄｂｏｄｍｅｅｃｙｌｉｉ
离心方法分离人脐带血单个核细胞，ＭｅｅＣｈ培养液体外扩增生长传代培养，用ｓｎｕ于倒置显微镜下观察其生长特性。取第３代的脐血间充质干细胞，１ｇＩ成纤维细胞生长因子和３ｍｏ／反式维甲酸诱导培养的细胞向神经细胞分用０／０ｂｌＩ全ｃ

人脐带血间充质干细胞的分离培养研究与展望

获取的单个核细胞，经椎虫蓝染色进行活细胞计数，每毫升脐血收集的单个核细胞（．２２１）０，Ｏ４～．２ ×１
但由于骨髓源性ＭＳ存在高度病毒污染或其他污Ｃｓ染的可能，随着年龄的不断增长其细胞数量和扩且增、分化能力出现明显下降趋势，因此，找一种能替寻
维普资讯
四川解剖学杂志２００７年
第１卷
第２期
・
・２・９
综述・
人脐带血间充质干细胞的分离培养研究与展望
苏维祥杨静爱麦秋萍，，综述，解继胜瑞雅。黄审校
（．江民族医学院２０临床医学系本科生；．１右０４级２右江民族医学院组胚教研室；
平均为（．６．５ ×１肝素钠采血体积３￣５１４士０２）０，５５ｍｌ经密度梯度离心法分离新鲜脐带血，取的单个，获核细胞，经椎虫蓝染色进行活细胞计数，毫升脐血每收集的单个核细胞（．１．５ ×１平均为（．１２３～４０）０，３１ ±０３）０，者相比差异具有显著性意义（一．１ ×１两ｔ００１Ｐ．５，．１，（００）即肝素钠抗凝获取的单个核细胞数明显高于枸橼酸钠所获取的细胞数。１２不同抗凝剂对获取的单个核细胞细胞生长状．
代骨髓ＭＳｓ并可弥补其缺陷的间充质干细胞来Ｃ，源，越来越受到各国学者的关注。人脐带血已（ＨＵＣ）Ｂ是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，有丰富的干细胞和祖细胞，含主要包含造血干细胞和ＭＳｓＣ。ＨＵＣＢ优势［在于：１脐血】］（）从分娩后的胎盘、脐带残端收集，其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单。对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，于接受。（）血受胎盘屏障的易２脐保护，其成分被病毒、细菌污染的几率低。（）血免３脐疫系统的原始性，降低了移植后受体的排斥反应。（）血包含丰富的ＭＳｓ仅可用于造血系统疾４脐Ｃ不病，也可用于非造血系统疾病的治疗。（）血中含５脐有ＭＳｓ为原始，Ｃ更具有更强的分化能力。（）涉６不及社会、伦理及法律方面的诸多争论。（）７收集的脐血不仅可做异基因移植的供体，而且还可将之低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病。（）８随着世界各国脐血库的建立完善及脐血体外扩增技术的成熟，为脐血的临床应用奠定了坚实的基础。故脐血干细胞的作用越来越突出，可作为一种新的替代细胞来源用于各系统疾病的细胞移植及基因治疗。１人脐带血的采集选择健康足月产或早产妇，儿娩出后（胎胎盘仍在宫腔内）在距胎儿５ｃ的脐带处进行双结扎，，￣７ｍ剪断脐带，消毒母侧脐带断端，刺脐静脉抽取脐带穿血，经抗凝剂抗凝，℃冰箱保存，４并于１２ｈ内进行分离。１１不同抗凝剂对获取的单个核细胞数的影响．国内学者孙海梅等［分别用复方枸橼酸和肝素２］钠两种抗凝剂各采集人脐血６份，复方枸橼酸采血体积３￣８，密度梯度离心法分离新鲜脐带血，０２ｍｌ经

干细胞提取和分离方法总结

干细胞提取和分离方法总结干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型能力的细胞，因其在再生医学和疾病治疗方面的巨大潜力而备受关注。

干细胞的提取和分离是开展干细胞研究的关键步骤，本文将总结几种常用的干细胞提取和分离方法。

1. 胚胎干细胞提取和分离胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)具有广泛的分化潜能，可以分化为体内所有的细胞类型。

目前，主要有两种方法用于胚胎干细胞的提取和分离：体外受精和体细胞核移植。

- 体外受精方法：该方法从捐赠人体内获取受精卵，通过体外培养获得兔囊胚，并将兔囊胚的内质体提取出来，形成胚胎干细胞系。

这种方法可以大规模获取胚胎干细胞，但受到伦理等因素的限制。

- 体细胞核移植方法：该方法通过将一个成体细胞的细胞核移植到一个空卵子中，得到克隆胚胎。

然后从克隆胚胎中提取胚胎干细胞。

这种方法可以避免使用受精卵，但技术难度较大且效率较低。

2. 间充质干细胞提取和分离间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)存在于骨髓、脐带血、脂肪组织等多种组织中，具有自我更新和多向分化能力。

提取和分离间充质干细胞的方法主要有以下几种：- 骨髓采集法：该方法通过穿刺骨髓髓腔，用针收集骨髓组织，然后经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。

这种方法具有高效、简便的优点，但操作有一定难度。

- 脐带血提取法：该方法通过脐带血采集脐带中的干细胞，经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。

相较于骨髓采集法，脐带血提取法更为简单和无创，但提取的间充质干细胞数量和质量较低。

3. 诱导多能干细胞提取和分离诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是通过使用转录因子或化学物质将成熟的体细胞重新编程为干细胞的一种方法。

主要有两种方法用于诱导多能干细胞的提取和分离：细胞外基质和转录因子。

- 细胞外基质法：该方法在细胞培养基内添加适当的细胞外基质，提供合适的生长环境，帮助细胞重新获得干细胞特性。

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离_培养_鉴定及冻存_复苏

MSCs 消化后以 1×106/ml 密度冻存，冻存液 DMSO∶ FBS∶DMEM 为 1∶1∶8，将冻存细胞放入 4 ℃预冷的程序冷冻盒内，直接将程序冷冻盒放入-80 ℃冰箱，第 2 天放入-196 ℃液氮保存。冻存 6 个月后将程序冷冻盒从-80 ℃冰箱取出，细胞直接放入 37 ℃预热的水浴锅内，用 4 ℃预冷的 PBS 洗涤细胞 2 遍，将细胞接种于含 10%胎牛血清的 DMEM 培养瓶内，放入 37 ℃、5%CO2 培养箱中培养。待细胞传代至 P3 代时，用流式细胞仪检测 CD14、CD45、CD79a、CD90、 CD34、CD73、CD105、HLA-DR，并进行成骨细胞、成脂细胞诱导分化，方法同前。
YANG Xiaoqing1**, ZHANG Mu2, YANG Bing3, ZGANG Hu3, ZHANG Yuquan1***
(1Department of Gynaecology and Ob-
sterics, Affiliated Hospital of Nantong University; 2Department of Clinical Medical class 071, Medical College of Nantong U-
来源 MSCs 具有来源广泛、取材方便、相对纯净、含量丰富及免疫原性低等优点，正逐渐成为 MSCs 研究领域的热点之一。人脐带 MSCs 的来源有 4 种，其中华通氏胶(WJ)来源的 MSCs 含量丰富但对其分离培养的研究相对较少，本文就探讨从人脐带华通氏胶中分离出脐带间充质干细胞 (umbilical cord mesenchymal stem cells， UC-MSCs)并进行体外培养、鉴定及定向分化，为 MSCs 的应用提供更广泛的来源。

人脐血间充质干细胞分离培养及向成骨细胞分化的研究

２００８年１０月
人脐血间充质干细胞分离培养及向成骨细胞分化的研究
农丕地黄海玲解继胜，，（．广东省佛山市南海区桂城医院，东南海５８０；１广２２０２．右江民族医学院组织胚胎学教研室，西百色５３０）广３００
ＲｅｕｔＴｈｓｌｓｅＨＵＣ —ｄｒｅｎｎｃｅｒｃｌ，ｗｈｎｐａｅｕｔｒ，ｇｖｉｅｔｄｅｅｔｃｌ，ｗｈｃｘｉｉＢｅｉｄｍｏｏｕｌａｅｌｖｓｅｌｃｄｉｃｌｅａｅｒｓａｈｒｎｅｌｎｕｏｓｉｈｅｈｂｔ — ｅｉｅｂｏｌｓ — ｌｅｏｓｎｈｍａ — Ｉｅｐｅｏｙｅｄｅｔｒａｆｒｂａｔｉｒｍｅｅｃｙｌｉｈｎｔｐ．ＴｈＳｓｉｄｃｄｃｌｒｈｗｅｈｉｋｋｅＭＣｉｕｅｕｔｅｓｏｄｉｕｏｙｏｈ — ｎｎｕｍｍｎｃｔｃｅｍｉａｓａｎｎｒＡＬｃｌｔｉｉｇｆＰ．ＣｏｃｕｉｎＴｈＵＣＢ— ｄｒｖｄＭＳａｅｃｌｒｄａｄｄｆｒｎｉｔｄｉｔｓｅｂａｔｏｎｌｓｏｅＨｅｉｅＣｓｃｎｂｕｔｅｎｉｅｅｔａｅｏｏｔｏｌｓｓｕｆｎ
ｃｕｉｇｄｘｍｅｈｓｎ，ｉｍｉｎ？一ｇｙｅｏｈｓｈｔ．Ａｎｉｖｒｅｃｏｃｐ，ｉｌｄｎｅａｔａｅｖｔｎＣａｄｏａｌｃｒｐｏｐａｅｅｔｄｍｉｒｓｏｅｍｍｕｏｙｏｈｍｉｌｔｉｉｇｎｎｃｔｃｅｃａｎｎａｓ

人脐血间充质干细胞体分离、培养及向脂肪细胞分化的实验研究

ＭＳＣｓｄｉｆｒｎｔａｅｉｏｄｐｏｙｅｓｎｄｌｐｄｒｌｔｗｅｅｃｒｅｒｄｆｅｅｉｔｄｎｔａｉｃｔａｉｉｄｏｐｅｓｒｓａｌｔｅｂｙｏｉｅｌｄ０ｓａｎｎｈｅ４ｈａｙｎｒｔｉｏｔ１ｔｄｉ

摘要目的：讨脐血间充质干细胞（ＢＭＳｓ探ＵＣ — Ｃ）的分离培养及向脂肪细胞的分化潜
能。法：足月儿脐血中获得间充质干细胞，外培养传代，方从体流式细胞检测细胞表面及抗原细胞
周期；１Ｍ地塞米松、０ｇｍｌ１甲基一一丁基一嘌呤（ＢＭＸ）５ｇｍｌ坏血酸的予Ｏ１０￣／一３异黄Ｉ、０￣／抗
ＤｅａｔｅｄａｒｃＧｕａｇｘｐｒｍｎｔｏｆＰｅｉｔｉｓ，ｎｉＺｈｕｎｇＡｕｔｏｍｏｏｅ’ ｓｔｌ（ｎｎｎｇ５０）ａｏｎｕｓＰｅｐｌｓＨｏｐｉａＮａｉ３０２１
ＤｅｇＹｉｅＴａａｌｎｇｎｎｙｏＹｎｉＡＢＳＴＲＡＣＴＯｂｅｔｖｊｃｉｅ：Ｔ０ｅｔｂｉｈｍｅｈｄｏｓｐｒｔｍｅｅｃｙｌｔｍｅｌｆＯＴｈｕｎｓａｌａｓｔｏｔｅａａｅｓｎｈｍａｓｅｃｌｒ１ｍａｓＩ
ｕｂｌａｏｄｂｏｄＵＣ— Ｓ）ｕｔｒｍｉｉｌｒｌｏ（ｃｃＭＣｓ，ｃｌｕｅＵＣ— Ｓｎｖｔｏ，ａｄｓｕｙｉｓｂｏｏｉａｃａａｔｒｓｉｓＭＣｓｉｉｒｎｔｄｔｉｌｇｃｌｈｒｃｅｉｔｃ．Ｍｅｈｄ：ｔｏｓ

人脐血及脐带间充质干细胞的分离培养及表面标记分析

ｃｒｓｃｔｉｔｉｌｉｓｅｂｏｋａｄｔｅｔｓｅａｔｃｍｅｔｃｌｕｅｍｅｈｄｗａｓｄｔｂａｎｄＭＳ．Ａ１ｔｅｅｏｄｗａｕｎｏｌｔｔｓｕｌｃｎｈｉｕｔｈｎｕｔｒｔｏｓｕｅｏｏｔｉｅＣｓｔｅｓａ１ｈｓ
（．ｅｏｔｅｔｆｅｉｒｓｒ￣ａｏｄＭｅｉｎｅｔ，８ｅｏｄＡｆｌｅｓｉｌｈｎｏｎｅｓｙＭｅｉｌ１ＤｐｒｎＰｄａｉ，２ＴａｌｉｄｃｅＣｎｒｍｏｔｃｒｔｎｉｅｃｎｉａｄＨｏｔ，ＳａｔＵｉｒｉｄａＳｆｉｔｐａｕｖｔｃ
ｍａｋｒｆＭＳ．ＭｅｈｄＮｏｍａｒｓｕｎＵＣＢｃｌｒｕｔｒｄｉｌｅｃ＇ｍｏｉｅｇｅＳｍｅｉｍｒｅｓｏＣｓｔｏｓｒｌｆｈｈｍａｅｅｌｗｅｅｃｌｅｎＤｕｂｅｏｓｓｕｄｆｄＥａｌｄｕｉ
瞄床儿科杂志，０２３（）５７５０２１，０６．７－８１
文章编号：１０ — ６６２１）６０７ — ４００３０（０２０ — ５７０
中图分类号：Ｑ８３１
文献标志码：Ａ
Ｉｏｌｔｏｎ，ｃｔｅａｓａｉｕｌｕｒｎｄｄｅｅｔｏｎｆｍｏｌｃａｍａｒｒｆｍｅｅｈｙａｓｅｅｌｒｍｔｃｉｏｅｕｌｒｋｅｏｓｎｃｍｌｔｍｃｌｓｆｏｈｕｍａｎｕｂｉｉａｌｍｌｃ及脐带间充质干细胞的分离培养及表面标记分析

脐带血间充质干细胞分离培养体系的优化筛选

临床
医
学
ＣｌＯＥＮＭＤＡＨＡＦＲｌＥＩＬＮＧＣ
匿固
脐带血间充质干细胞分离培养体系的优化筛选 ①
李学军
（湖南益阳医学高等专科学校
【要ｌ目的摘
湖南益阳４０）１００３
在无茵条件下用密度梯度离心的方法获得脐
对人脐带血问充质干细胞的分离方法，养条件进行优化筛选。法培方
血单个核细胞，种含ｌ％接Ｏ胎牛血清的ＤＥ培养基中。ＭＭ单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，制细胞生长曲线，绘分析细胞周
期，测细胞表面抗原。检结果采用Ｐｒｌ１０３ｇｍ）离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，形或星形的成纤维细胞样细胞。ｅｅｌ．７／Ｌ分ｏ（梭细胞生长曲线测定表明接后第５天细胞进入指数增生期，第９至天后数量减少Ｉ式细胞检测表明５％０细胞为Ｃ２和Ｃ４阳性。流０～７％Ｄ９Ｄ５结论体外分离培养脐血问充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。【键词】脐带血干细胞分离培养关
形态，～５后可达８％融合。４ｄ０
间充质干细胞（ｓｎｈｍａｓｍｅｓＭＳｓ一定条件下具ｍｅｅｃｙｌｔｃｌ，Ｃ）ｅｌ在有多向分化的潜能，组织工程研究中重要的种子细胞来源。是本研究将探讨人ＵＣ－Ｃ体外培养的方法、ＢＭＳｓ细胞的生长曲线、殖周期增和细胞表面标志等方面，析ＵＣ－Ｃ作为间充质干细胞来源的可分ＢＭＳｓ

人脐带血多能干细胞的体外分离培养及其生物学特性

中国初级卫生保健２ｔ００年３月第２４卷第３期（第２１）总９期
人脐带血多能干细胞的体外分离培养及其生物学特性
史军①，陈锦阳① ，李洁① ，曹利红① ，张潇月① ，马小秀① ，陶毅①
关键词：间充质干细胞；人脐带血；原代培养；生物学特性
ＵＢＣ，并进行了生物学特性鉴定，得到的ＵＢＣ将ＣＭＳｓＣＭＳｓ
用于后续研究。
表ｌ两组患者一般情况比较
门冬氨酸钙在人体内分布迅速，可快速发
挥作用，３ｈ后即排泄。钙离子能增加毛细血管的致密度，降低其通透性．减少渗出，钙在形成抗体的显微结构中具有重要意义。能减轻炎症和非特异性抗过敏作用。观察组使用门冬氨酸钙注射液有效率为８．：对照组口服息７５％斯敏片进行治疗，有效率为７．％，两组有效１４
潜能以及它们所具有的低免疫原性和免疫抑制的作用．为临
床应用的安全性和有效性提供了可靠的理论依据，同时大大扩展了其临床适应症的选择范围，即不仅可用来进行各种推行性和衰竭性疑难病症的替代治疗，也可以用来进行辅助的免疫治疗１３］。ＭＣＳｓ主要取白骨髓，由于骨髓源性ＭＣＳｓ存在高度病

人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定目的分离培养人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMSCs），体外观察其生长特性。

方法采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞，倒置显微镜下观察其形态及生长情况；流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物。

结果纯化的hBMSCs 贴壁生长，呈均一梭形，具有较强的增殖能力，流式细胞仪分析P3代hBMSCs 稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73，CD90和CD105等。

结论本实验分离培养的hBMSCs具有较强的增殖能力，表达间充质干细胞的表面标记。

Abstract：Objective To isolate and culture human bone marrow derived mesenchymal stem cells（hBMSCs），and to observe biological characteristics of hBMSCs. Methods Bone marrow mononuclear cells were separated by the method of density gradient centrifugation and MSCs were obtained by adhere culture.The cell morphology and their growth characteristics in vitro were observed under an inverted phase contrast microscope and the cell cycles were tested by flowing cytometry. Mesenchymal like stem cells were identified by surface marker with flow cytometry.Results hBMSCs were adhered like a fibroblast morphology and with pool like growth alinement.Flow cytometry showed that the third passage cells were positive for CD73，CD90and CD105 expression.Conclusion The MSCs from bone marrow in this study show great capability of proliferation.Key words：Bone marrow mesenchymal stem cells；Separation；Culture and identification间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞。

脐带间充质干细胞培养操作细则

脐带间充质干细胞分离培养操作细则一、样本接收1.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。

2.查看客户信息是否与交接表一致。

3.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，传入洁净区准备制备。

二、脐带间充质干细胞分离与接种1）准备耗材试剂：10cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml 移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、50ml注射器针头、封口膜、灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、生理盐水、75%酒精（已过滤）。

2）仪器设备准备及预热：电动移液枪、生物安全柜、离心机3）将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。

4）将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，电动移液枪、移液管、离心管、离心管架喷酒精擦拭放入生物安全柜中，无菌棉球放入到广口瓶中加75%酒精放入生物安全柜中。

50ml、15ml离心管放到离心管架上，10cm皿5-7个。

将装有灭菌器械的灭菌盒喷酒精擦拭放入生物安全柜中。

5）取5个10cm皿依次摆开，1，2，4，5号皿依次加入适量的生理盐水，3号皿加入适量的已过滤的75%酒精。

拿出灭菌盒中已灭菌的止血钳，将脐带从保存瓶中取出放到第一个皿里，并取适量样本保存液留样送检支原体。

使用两个止血钳将脐带在第一个皿里清洗尽量去除脐带外表面的血污以及动静脉的血液和血凝块，将脐带转移至2号皿中，同样的方法再次清洗一次并测量其长度。

6）将清洗干净的脐带转移到装有已过滤75%酒精的3号皿中浸泡1min左右（不要超过两分钟），计时结束后，将脐带转移至4号皿中，同样的洗涤方法去除酒精。

清洗结束后将脐带剪成1-2cm短节，放入5号皿中，再次洗涤尽量去除血管内的血污。

再次拿两个10cm皿，加入适量的生理盐水，去一皿的盖子加少许盐水湿润底部及可。

7）将1-2cm的脐带小段转移到新的皿里，用带齿口的镊子取一段脐带，将脐带展开，再按血管走势剔除脐带的两条动脉，一条静脉。

不同分离方法及培养条件对人脐带间充质干细胞生物活性的影响

不同分离方法及培养条件对人脐带间充质干细胞生物活性的影响人脐带间充质干细胞（Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一种来源于人类脐带间充质组织的多能干细胞，具有很强的自我更新和多向分化能力。

WJ-MSCs在干细胞治疗、再生医学以及组织工程等领域具有广阔的应用前景。

在临床应用中，WJ-MSCs的分离和培养条件对其生物活性可能产生影响。

本文旨在探讨不同分离方法及培养条件对WJ-MSCs生物活性的影响。

一、不同分离方法对WJ-MSCs生物活性的影响1.1 酶解法分离酶解法是目前分离WJ-MSCs最常用的方法之一。

其步骤主要包括切碎脐带样本、用胰酶或胰蛋白酶对组织进行酶解、过筛筛选WJ-MSCs。

酶解法分离的优点是分离效率高，但可能对WJ-MSCs的表面标记物和细胞形态产生影响，进而影响WJ-MSCs的生物活性。

1.3 不同分离方法对WJ-MSCs生物活性的比较一项研究对比了酶解法和机械法对WJ-MSCs生物活性的影响，结果显示机械法分离的WJ-MSCs在表面标记物的表达和多向分化能力上均优于酶解法分离的WJ-MSCs。

机械法分离在临床应用中可能更有利于保持WJ-MSCs的生物活性。

2.1 不同培养基对WJ-MSCs生物活性的影响培养基中的成分对WJ-MSCs的生物活性具有重要影响。

一般来说，培养基中含有较高浓度的胎牛血清或胎牛血清替代物、生长因子和细胞因子等成分，能够更好地维持WJ-MSCs的生物活性。

2.2 氧气浓度对WJ-MSCs生物活性的影响WJ-MSCs在体内生存环境中处于较低氧气浓度环境下，因此较低氧气浓度对WJ-MSCs 的生物活性更有利。

一项研究表明，在较低氧气浓度条件下培养的WJ-MSCs更具有自我更新和多向分化能力。

三、结论与展望通过上述分析可以得出，不同分离方法和培养条件对WJ-MSCs的生物活性具有重要影响。

在临床应用中，应优先考虑采用机械法分离WJ-MSCs，并在含有较高浓度胎牛血清或胎牛血清替代物、适宜培养基和较低氧气浓度的条件下进行培养，以保持WJ-MSCs的生物活性。