微生物操作培训大纲

微生物检验技术培训大纲一．玻璃器皿准备（1）玻璃器皿的清洗新购进玻璃器皿处理新构进的玻璃器皿，均含有游离碱，故应先浸于洗液或20ml/L盐酸内数小时，再用自来水冲洗干净。

待干燥后，灭菌备用。

日常清洗注意事项a.一切使用过得玻璃器皿，用完后先用清水冲洗干净，然后用热的肥皂水洗刷清洁，再用清水冲数次，蒸馏水冲洗两次，自然风干，备用。

如果肥皂水洗刷仍未清洁，可用洗液浸泡，洗出后用清水冲洗5次以上，再用蒸馏水冲洗两次。

b.吸管用完后应立即用清水和蒸馏水冲洗干净即可，如附有污物可用洗液浸泡。

c.附有油污的器皿，若用热的肥皂水不能洗净时，切不可用洗液浸泡，而应先用热的酒精、汽油或丙醇洗涤;或用氢氧化钠热溶液2（％）浸泡10-15分钟，然后再用稀盐酸洗一次，用水冲洗数次。

油污如仍未出去，再重复以上手续一次。

洗液的配制和使用：a.在35ml重铬酸钾饱和液（重铬酸钾180g溶于100ml水中，或63g重铬酸钾溶于35g水中），慢慢加入粗制浓硫酸1000ml玻璃器皿一般在这种洗液中浸泡2h以上即可除污。

如将其加热至80-100℃（但不可加热至发烟或煮沸，此时温度达240-250℃），浸泡10-15分钟，效力更大。

b.溶解80g重铬酸钾于1000ml温水中，待凉后，徐徐加入粗制浓硫酸100ml于水中即成含硫酸10％的清洗液，使用时，将玻璃器皿先浸于这种洗液中24h，然后清水和蒸馏水冲洗。

c.溶60g重铬酸钾于300ml热水中，慢慢加入粗制浓硫酸460ml，边加边用玻璃棒搅拌，因为此液产生大量热，在配制时应用耐热容器，并放在水槽中以便冷却。

一般玻璃器皿在此溶液中浸泡6h以上即可。

如何判定清洗干净既不聚成水滴，也不成股流下。

（2）微生物检测常用玻璃器皿及规格所用玻璃仪器及规格：吸管：1ml和10ml，标有0.1ml刻度平皿：皿底直径为9cm试管：15×150mm、18×180mm、20×200mm、酒精灯三角瓶：250ml、300ml广口瓶：用于采样大肠菌群：双料:、单料、复发酵单料乳糖胆盐发酵管：20g蛋白胨、10g乳糖、5g胆盐、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液0.6ml（0.04％溴甲酚紫水溶液25ml）、蒸馏水100 制法：将各成分溶于1000ml水中，溶解后将PH值调至7.4分装于18×180mm试管中，115C高压灭菌15分钟。

双料乳糖胆盐发酵管：单料除水外其他各成分加倍, 分装于18×180mm试管中. 乳糖发酵管：20g蛋白胨10g乳糖1.6％溴甲酚紫乙醇溶液0.6ml（0.04％溴甲酚紫水溶液25ml）蒸馏水1000ml PH值调至7.4取3ml分装于12×120mm试管中，1150C高压灭菌15分钟。

（3）玻璃器皿的准备、包扎、高压灭菌条件棉塞制备：用普通棉花纱布做成所需大小的棉塞，高压灭菌固定。

吸管：在吸管的上端塞上一小段棉花，防止吸管中的菌液、酸液、碱液等吸入口中。

塞入的棉花应与吸管口保持5mm左右的距离棉花全长不短于10mm，赛好棉花后用截成条的旧报纸包装，先把吸管的尖端放在纸条的一端，45度角折叠纸条，包住尖端。

以螺旋式包扎剩余的纸条折叠打结，也可把塞好棉花的吸管放入铁皮筒中，加盖密封1210C高压灭菌15分钟。

平皿：用过的培养皿中有废弃的培养基，为了防止杂菌传播污染环境，也应先经高压灭菌或沸水煮沸半小时后，倒掉污物洗涤。

新的培养皿可直接洗刷，洗净后用蒸馏水冲洗三次，培养皿全部向下，一个接一个压着皿边，然后扣在桌子上空净水。

用报纸包好或装在铁皮筒中，1210C15分钟。

三角瓶：洗刷干净的三角瓶塞上塞子用截成方块的旧报纸包好，用绳子捆住。

二．培养基选用、配制、成分作用、高压灭菌条件（表格）三．高压锅正确使用方法及注意事项使用规则1）松开紧固螺杆，将器盖翻开，放入消毒物后，为胆内注水，并观测水位至最高水位线即可，在顺时针方向拧紧螺杆后，消毒器就可以接通电源。

2）加热时，应把放气阀推向垂直放气的位置，使冷空气加热由筒内逸出。

3）等较急的蒸汽冒出时，关闭蒸汽阀直至压力表指针上升至消毒物所需压力后开始记消毒灭菌时间。

4）消毒完毕，切断电源，开启上边放气阀，待汽排尽压力表指针回到0时才能打开器盖，开启下面放水阀，排放胆内热水。

5）对瓶装溶液消毒完毕压力表指针回到0后，必须在放汽水咀打开下，等冷却20分钟左右，方能打开器盖，否则溶液瓶回因突然遇冷而发生爆炸事故。

6）每次使用完毕应擦干各部件，以防生锈。

注意事项1）严禁使用不在有效期内的或其它型号的压力表和安全阀2）该仪器使用一年时必须进行外部检查，使用三年时，必须进行内外部检查；使用六年时，必须进行全面检查。

3）严禁在消毒器内有压力时打开器盖。

4）盖上器盖时应轻旋，并在橡胶圈上涂上滑石粉，提高密封圈使用寿命。

5）不用时消毒器应放在通风处。

四．灭菌后培养基的存放注意事项最好及时用完，不宜保存过久，以免减低其营养价值或化学变化。

培养基在储存期间，因能吸收空气中的二氧化碳而变为酸性。

五．无菌室注意事项（人员、环境、灭菌要求）1.无菌室要保持清洁整齐，室内仅存放最必须的检验用品，如：酒精灯、酒精棉、火柴、镊子、接种针、接种环、记号铅等。

2.室内检验用具及桌凳应保持固定位置，不随便移动。

3.每2—3周用2%石碳酸水溶液擦拭工作台、门、窗、桌凳及地面，然后用2%石碳酸水溶液喷雾消毒空气，最后紫外灯杀菌半小时。

4.定期检查室内空气无菌状态，进行细菌和霉菌的检查。

5.无菌室杀菌前应将所有物品置于操作之部位，然后打开紫外灯杀菌半小时，时间一到，关闭紫外灯待用。

6.进入无均室以前，必须于缓冲间更换消毒过的工作服、工作帽及工作鞋。

7.操作应严格按照无菌操作规定进行，操作少说话，不喧哗，以保持环境的无菌状态。

六．无菌室常用消毒方式及消毒剂1.紫外线杀菌1）紫外线灯的安装一般悬空吊装在接种室或培养室的上方，吊装紫外灯的个数，应根据房间的大小而定，容1-2人操作的接种室，吊装一个30瓦的紫外灯就可以了。

如果有的接种室或培养室的空间较大，则除悬空吊装紫外灯之外，还可以在房间的不同角度，安装紫外线灯（开关需要设置在杀菌区室外），以达到比较彻底杀菌的目的。

2）紫外线灯的作用一般在接种室使用之前，应打开紫外灯，照射约20-30分钟，就基本上可以使室内空气和室壁表面上无菌。

3）使用紫外线应注意的事项紫外线对物质的穿透很小，对普通玻璃也不能透过，因此，紫外线只能进行空气和室壁表面的杀菌。

紫外线对人体皮肤，尤其是对人的眼睛具有杀伤力，所以，不要对着紫外线进行操作，以免眼睛受到伤害。

2.喷洒石炭酸1）常用浓度为50ml/L石炭酸（酚）溶液，配制时，可先将盛石炭酸的瓶放在水浴中，使之溶解，再用吸管吸取，配制为50ml/L的石炭酸溶液。

2）喷洒方式最后退出房间，关门，稍等片刻，即可使用，对于较大的房间，以背负式喷雾器较好，以利于房间死角的消毒。

3）注意事项石要接触炭酸对于皮肤有很强烈的毒害作用，使用时不皮肤。

喷洒石炭酸可以与紫外线杀菌结合使用，这样可增加其杀菌效果。

3.硫磺熏蒸1）用量每立方米空间需用硫磺3-4g，熏蒸前，须把硫磺放在金属容器内加热，利用产生的二氧化硫进行熏蒸。

熏蒸前需将地面和墙壁撒水少许，以增加灭菌效果，熏蒸完毕，房间需要密封过夜后才能使用。

次方法灭菌效果比较好，但比较麻烦。

熏蒸时，硫磺蒸汽刺鼻，影响操作和身体健康，应适当注意。

二氧化硫对金属器皿有腐蚀性，熏蒸前应把金属器皿事前搬出，以免发生腐蚀。

4.乳酸加热熏蒸按熏蒸空间计算，以1ml/m3的量，量取80%的乳酸溶液，盛在可加热的容器内，用铁架或其他加热架支好。

在酒精灯或酒精炉内加入适量酒精（以能蒸干所有乳酸溶液为宜，不要超过太多）。

确认待处理区域内没有生产原料、包装材料、成品及半成品，以及所有的生产用容器均以有效保护（盖紧或覆盖严密）。

关闭所有门窗，以及空调、通风系统。

点燃酒精灯或酒精炉，所有人员迅速撤离，关闭出口的门。

任乳酸溶液煮沸挥发。

酒精灯或酒精炉应能在乳酸蒸发完后即自行熄灭。

熏蒸后保持门窗关闭12h以上，再进行通风，放出剩余有刺激性的气体。

通风时间大约需要12h。

5.甲醛加热熏蒸甲醛使用量为2-6ml/m3，常用浓度为36%-40%。

方法步骤同乳酸加热熏蒸6.甲醛氧化熏蒸1）使用量：按甲醛加热熏蒸所需的用量量取定量的甲醛溶液。

按甲醛溶液用量的1/2称取高锰酸钾，置于一个非金属容器内。

2）使用方式：同乳酸加热熏蒸法，确认处理区域内准备完全后，把甲醛溶液到入盛有高锰酸钾的容器内，人员迅速撤离，关闭出口。

在与高锰酸钾作用产热下，甲醛溶液即沸腾挥发。

熏蒸后保持门窗关闭12h以上，再进行通风，防出剩余有刺激性的气体。

通风时间大约需要12h。

七．超净工作台工作原理、注意事项工作原理进风经过初、中效过滤器后（中效过滤器金属框架内饶无纺布制成，其过滤对象是1-10mm的尘埃，使用一段时间后积尘增多阻力增大效率降低要定期修理或更换;高效过滤器金属框架内饶超细玻璃纤维滤纸制成过滤对象为小于1um尘埃，为主要部件）吸入风机，经过风机加压后，经过顶部的高效过滤器过滤的洁净空气垂直送到工作区，然后一部分排至室内，大部分通过台面上的孔回风进行循环。

注意事项1）.超净工作台操作区为垂直层流区，因此出风面操作位置不应置多余的物品，以免防碍气流的正常流动，影响洁净度。

2）.操作人员应穿洁净的工作服，不宜在工作区附近快速行走，避免把工作区外的空气带入操作区，操作时手的动作要尽量减少洁净空气外流。

3）.超净工作台面板上的孔作为回风用，使用时要避免有液体或其它物漏入孔中。

4）打开风机后5分钟可以自净。

8．无菌操作、注意事项（酒精灯、接种针或环）无菌操作培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。

在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。

实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。

光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。

在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。

为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。

空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，打开培养皿的时间应尽量短。

用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。

接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。

（图３－４）然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。