病毒分子生物学
分子病毒学 3病毒受体
（二）受体和配体在共同进化过程中的相互影响
与受体发生完全结合的大分子通常被称为配体(ligand)。 由于病毒可以和特定的受体结合，因此，亦可以把病毒―― 受体间的关系看作是配体与受体的关系。 从一些配体与受体对的共进化关系来推测病毒与受体关系的 发生和发展过程。 蛋白质与蛋白质的相互作用所导致的氨基酸分子变异，本 身就是进化过程中的一个主要作用因素。提出这样一个问题， 即病毒与宿主细胞之间的关系是否是一个由于相互之间在一 定时期内作用和接触而导致的接触表面相关氨基酸置换，最 终形成相互适应和吻合的作用部位，亦就是受体和病毒的特 异结合位点。
病毒进化的基本特征
1、新病毒不断产生，而且基本上是从另一种宿主的 病毒演化而来。 2、新病毒产生后，在新的宿主以较快的速度进行变 异分化。 例如：
犬细小病毒是新病毒，猫的细小病毒是老病毒，两者差异不大， 但是犬细小病毒进化速度较快。 对流感病毒而言，人的流感病毒是新病毒，禽流感病毒是老病 毒；人流感病毒进化较快。 对慢病毒而言，人免疫缺陷病毒是新病毒，猴免疫缺陷病毒是 老病毒，人的免疫缺陷病毒进化比猴的免疫缺陷病毒快。
3、新病毒稳定后，病毒的毒力大多处在中等水平。
如： 兔黏液病病毒在澳大利亚释放之后的10几年的跟踪研究，发 现强毒株逐步演变为以中等毒力为主的病毒。 副粘病毒引起的禽NDV在我国开始流行时，毒力很强，这 些年来逐渐产生了一些弱毒株，但整体上既不是以强毒为主， 也不是以弱毒为主，而是以中等毒力为主。
结合后病毒的基因组是如何进入细胞?
多数有包膜病毒往往一经接触后就与宿主细胞的多个受体立 即发生不可逆的结合，通过毒粒包膜与细胞膜融合进入胞浆， 在这个融合过程或多或少会有一部分病毒的核衣壳要进入到胞 浆。无包膜病毒则不同，只有当受体移行至毒粒，才能发生不 可逆性的结合，而且发现核衣壳在这个过程中并不进入胞浆。 有包膜病毒与无包膜病毒在不可逆结合上存在明显差异，可 能原因：有包膜病毒受体是糖蛋白，在细胞膜表面的分布十分 丰富，而无包膜病毒的受体虽然也可能是糖蛋白，但在细胞膜 表面的分布不十分丰富。对于那些较大的，结构较复杂的病毒， 如Reo病毒，痘病毒等也是通过受体介导的内吞作用使完整的病 毒进入到细胞内。而对大多数病毒而言，单纯的吞噬作用仅仅 是病毒与宿主细胞间一种简单的结合，这种简单的结合并不能 造成感染的发生。可能是一种特殊的形式吞噬作用，而决定能 否进入细胞，病毒的特异性受体起到关键性作用 。
分子生物学基础
分子生物学基础
b.专一性终止蛋白 E.coli 中由 tus gene 编码 通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用
ter
分子生物学基础
分子生物学基础
4、DNA损伤与修复 • 光复活 • 切除修复 • 重组修复 • SOS修复
分子生物学基础
（一）photo reactivation（光复活）
2、半保留复制 3、半不连续复制 4、DNA复制具有高度的忠实性
DNA聚合酶的自我校正功能
5、多种酶和蛋白因子协同作用
分子生物学基础
1，复制起点
分子生物学基础
θ 复制或重新起始（ de novo initiation ）或复制 叉式（ replication fork ）
双链环状DNA的复制眼可以形成一种θ结构，形 状像希腊字母θ
分子生物学基础
1）、与转录调控有关的DNA序列
• －10区pribnow框（TATAAT）：RNA聚合酶的牢固 结合位点
• －35区Sextama框（TTGACA）：RNA聚合酶的识别 位点
• 一般来说，对于给定的启动子，其特异性序列趋于启动子 共有序列时－10与－35区之间的间距趋于17bp时，启 动子的转录效率可能就高
• 真核基因：
1、复杂的染色体结构：着丝点、 端粒，与DNA复制起点一起构成 染色体不可缺少的三要素
2、DNA重复顺序 重复序列的存在是真核生物 DNA区别于原核生物DNA的一 个重要特征
分子生物学基础
3、基因的不连续性 （外显子、内含子）
４、真核生物基因组中有许多来源相 同、结构相似、功能相关的基因组成 为单一的基因簇或基因家族（gene Family） Alu序列家族
定位 转录产物 α-鹅膏蕈 碱的影响
分子生物学完整版
非编码的中度重复序列，在进化中起着重要的作用。
SINE--Alu家族
人类基因组中存在最广泛的中度重复序列，平均长度约300bp，拷贝数30～50万，均匀地散布在整个基因组中。
低度重复序列（2-10次）每一种在基因组中的重复次数为2～10，多为编码蛋白质的基因
存在复杂的RNA加工反应，包括切割，顺式-，反式-剪接，RNA的编辑和降解。
某些重复序列的核苷酸顺序不完全相同
单拷贝序列(single copy sequence)
在基因组中只存在一个拷贝，复性最慢。
编码真核生物绝大部分蛋白，表达具有时空特异性。
基因家族（gene family）：一组功能类似、结构具有同源性的基因。
细胞器基因组
1950s,为了解释某些表型特殊的遗传方式，提出了extra-chromosomal genes。1960s早期（1962年〕，Ris and Plant通过电镜首次证明叶绿体中含有DNA，用DNA酶处理，超薄切片的2.5~3.0m的纤丝消失，进一步在电镜下观察到环状DNA分子。几乎所有的真核生物有线粒体基因组；所有的光合真核生物含有叶绿体基因组；一般来讲，细胞器基因组DNA呈环状，也有线状（一些真核微生物酵母等的线粒体基因组都呈线状；有的环状和线状并存，叶绿体中还有小环DNA分子存在.
分子生物学
The Coming of Wisdom With Time
Though leaves are many, the root is one
Through all the lying days of my youth
I swayed my leaves and flowers in the sun;
猪瘟病毒的分子生物学及其猪瘟的分子发病机理
• CSFV另一种可能的受体是低密度脂蛋白受体(lowdensity lipoprotein, LDL), 因为已证实黄病毒科的许多不 同种类的成员如：HCV、BVDV、GBV和HGV均可通过 LDL受体的介导以细胞内吞作用的方式进入到细胞中。
(三) CSFV的非结构蛋白
• NS3具有蛋白消化酶(催化从NS3 到 NS5B 各个蛋白的切 割)、解链酶和NTPase酶活性，与病毒基因组的复制有 关。但在一些瘟病毒生物型中，NS2-3并不发生裂解， 而是以融合形式存在。如：在非细胞病变型BVDV中， 主要以NS2-3融合蛋白形式存在，而在细胞病变型 BVDV感染的细胞中，却有高水平的NS3存在，并且与 病毒RNA在细胞中的增多相关，这说明细胞内NS3浓度 与病毒的复制能力相关。而细胞病变型BVDV的NS2-3 能得到有效切割，NS3的多种功能均能充分得以发挥， 而病毒复制能力，能大量生成病毒粒子而导致细胞病变。 在CSFV中， NS2、NS3以什么形式存在还有待研究。 除有缺损颗粒的病毒外，CSFV均不能产生细胞病变。 这是否与非细胞病变形式BVDV一样，感染细胞中只有 NS2-3融合蛋白，病毒的繁殖能力不强所致还有待研究。
猪瘟病毒的分子生物学及 猪瘟的分子发病机理
一、病 原
• 猪瘟病毒（CSFV）属于黄病毒科瘟病毒属。 • 与同属的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、羊边
界病毒(BDV)之间，基因组序列有高度同源性， 抗原关系密切，存在交叉反应。与同科的乙脑、 登革、丙肝等病毒基因组结构相似。 • 野毒株毒力差异很大
一、CSFV
病毒感染的微生物学检查方法
朊病毒分子生物学
一、朊病毒（virino）的发现
1982 年,美国的Pruisner 博士和他的同 事分离纯化出一种高度感染性的特殊糖蛋 白,称为抗蛋白酶蛋白( PrP) , 经实验认为羊 痒病的感染因子可能是一种不含核酸的蛋 白质,并取名为朊病毒蛋白。
二、朊病毒的来源
朊病毒一直存在于世界，是正常基因在 129位编码缬氨酸或甲硫氨酸位置发生突 变。
• Prion的结构模型，左PrPc，右PrPSc
朊病毒的核磁共振图谱
四、人和动物朊病毒病
人阮病毒病：
1：克雅氏综合症(CJD)
克雅氏病是罕见的早老性痴呆病，其潜伏期可长达十年， 发病后期人的大脑被毁损，最后昏迷死亡。在欧洲、美洲、 大洋洲等各地的发病率约为百万分之一。
2：库鲁病（Ku—rmm)
2、结晶假说
该假说认为PrP蛋白在有PrPSc分子的情 况下形成结晶时，晶格中的PrPc分子有α螺 旋构象转变成PrPSc的β折叠构象.由此可见 PrP蛋白的构象转变并无核酸活动的参与。
3、构型诱变假说
PrPSc可诱导正常的PrPc转变成PrPSc，这一转 变完全是翻译后过程，为蛋白质的二级结构发生 变异。正常的PrPc主要由4个α螺旋环组成，其氨 基端有15个氨基酸是PrPSc 的结合区域；当有 PrPSc 与之接触后，PrPc就会发生构象改变，α 螺旋减少，β折叠增多 ，继而转变成PrPSc。改 变前后在蛋白质特异性方面存在较大差异。
1、逆中心法则假说
Prion发现之前，我们认为所有的病原体都 是通过核酸进行复制的。
Protein hypothesis阐述，蛋白质结构也可 以不依赖核算进行复制，这一假设完全颠 覆了中心法则中遵循的核酸是复制信息的 中心
Central dogma of molecular biology
【大四 必修】分子生物学第十五章 病毒的分子生物学教案
第十五章病毒的分子生物学第一节、研究内容概念：分子病毒学是用现代分子生物学的新理论、新技术和新方法对病毒基因组的结构和功能，基因组的复制、表达和调控，病毒与宿主的相互作用等进行研究的一门学科。
主要内容如下：一、病毒基因组的结构与功能核酸类型： DNA病毒——腺病毒、乙型肝炎病毒等RNA病毒——反转录病毒、丙型肝炎病毒等核酸结构：单链、双链、线状、环状正链RNA单链负链RNA病毒核酸的分子量与细菌相比要小病毒基因组的结构与功能病毒基因组的复制和表达调控病毒对宿主细胞的影响病毒与肿瘤发生病毒基因工程疫苗及病毒载体二、病毒基因组的复制和表达调控１、释放到细胞外 ２、 表达：转录、翻译 （1） 正链RNA 病毒：直接作为模板,复制RNA同时共有mRNA 作用→翻译单一大分子肽链→修饰（蛋白酶降解）结构或非结构蛋白（2） 负链RNA 病毒：不能直接行使mRNA 功能→cRNA(互补RNA) →作为模板 必须自身携带依赖RNA 的RNA 聚合物 （3） 反转录病毒：正单链RNA 、以双体形式存在 含有依赖RNA 的DNA 聚合酶双链DNA宿主细胞DNA 中 子代病毒核酸（4） D NA 病毒：大多数为双链DNA利用宿主细胞本身的转录酶来转录mRNA早期转录：病毒DNA 复制所需要的酶及调节蛋白调节蛋白 抑制宿主细胞核酸转录和翻译 调控早期或晚期基因的表达转录 整合复制晚期转录：病毒的衣壳蛋白或包膜糖蛋白 病毒翻译的部位：宿主细胞核糖体 所需的原料由宿主细胞提供三、病毒对宿主细胞的影响宿主细胞形态、结构的影响 宿主细胞功能1、病毒对细胞形态、结构的影响（1）在受体细胞表面表达病毒基因编码的糖蛋白→宿主细胞之间发生融合→巨核合胞体（2）肿瘤相关病毒癌蛋白 宿主细胞抑癌基因失活激活细胞癌基因(3)引起细胞凋亡（Apoptosis ）：如HIV →CD 4死亡 2、病毒对宿主细胞功能的影响特点：①病毒感染细胞后：利用宿主细胞相应的系统完成自身的复制、转录和翻译②病毒早期产物： 抑制宿主细胞的转录促进病毒早、晚期基因的转录③降解细胞mRNA 或与宿主细胞竞争翻译系统来抑制宿主细胞mRNA 的进一步翻译→增加病毒mRNA 与核糖体亚基的结合效率表达 肿瘤宿主四、病毒与肿瘤发生 乙肝病毒→肝癌 EB 病毒→鼻咽癌 HIV →kaposi’s 肉瘤五、病毒基因工程疫苗及病毒载体基因工程疫苗的概念：利用基因工程的方法（基因重组），将病原微生物的一段基因序列（有较强的免疫原性、无致癌性）克隆在表达载体中，所表达的产物作为抗原，称之为疫苗。
病毒的结构和分子生物学
病毒的结构和分子生物学病毒是一种微生物，它可以感染人体细胞并导致疾病。
病毒的结构与其他微生物有很大不同，它不具备细胞结构，无法自行繁殖和生长，需要寄生在宿主细胞内完成其生命周期。
病毒研究的分子生物学让我们更好地了解病毒的结构和工作机制，有助于预防和治疗病毒感染。
病毒的结构病毒主要由三个部分组成：遗传物质、蛋白质衣壳和部分病毒还有宿主细胞膜的包装。
病毒的遗传物质是其最重要的组成部分，它包括病毒基因组或RNA（核糖核酸）。
病毒的基因组是具有脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）的遗传物质，它存储病毒的遗传信息。
病毒基因组的大小和形状都不同，它可以是单链或双链DNA或RNA，也可以是环状或线性形态。
蛋白质衣壳也是病毒的重要组成部分，它由多种不同的蛋白质组成，与遗传物质包裹在一起。
这些蛋白质衣壳具有传染性，可以保护病毒在宿主体内存活，并让病毒侵入宿主细胞。
一些病毒还有宿主细胞膜的包装，它会影响宿主细胞对病毒的感染和内禀免疫回应。
病毒的分子生物学病毒的分子生物学主要研究病毒的遗传物质和蛋白质的组成和功能，以及病毒与宿主细胞的相互作用。
这些研究不只可以帮助人类更好地理解病毒的生命周期，更可以提高我们对病毒的防范和治疗能力。
病毒基因组和RNA的研究是病毒分子生物学的重要部分，它可以告诉我们关于病毒遗传特征的信息。
这些信息被用于开发治疗和疫苗，使得我们更好地和病毒斗争。
相比之下，病毒的蛋白质组成更容易分离和检测。
研究人员可以通过这些蛋白质的结构和功能来推导出病毒的作用机制，并利用这些信息来设计更好的药物和疫苗。
宿主细胞的相互作用对于病毒的研究也非常重要。
病毒依赖于宿主细胞的进入、生长和繁殖，因此研究病毒的感染过程与宿主细胞之间的相互作用可以帮助我们更好地了解病毒与宿主细胞之间的交互，并为研究新的治疗手段和疫苗提供基础。
结论病毒的分子生物学研究帮助我们更好地了解病毒的结构和其在人类细胞中的分子生物学机制。
病毒的分子生物学包括病毒基因组、蛋白质组成和宿主细胞的相互作用，这些都为我们开发新的治疗手段和疫苗提供了信息。
病毒的分子生物学特征
病毒的分子生物学特征病毒是一类非常小的微生物，其大小只有细菌的几分之一甚至更小。
不同于细菌和真菌等自主生长繁殖的微生物，病毒不能独立存在，必须寄生于宿主细胞内才能生存。
这种非常独特的特性，决定了病毒在其生理、生态和流行病学特征中都具有相应的特殊性。
本文将着重探讨病毒的分子生物学特征。
1. 病毒的组成结构病毒的组成结构相对简单，一般可以分为两个基本部分：核酸和外壳。
核酸是病毒遗传物质的主要组成部分，可以是DNA或RNA，大小在数千到数百万个核苷酸之间不等。
外壳由外膜和壳蛋白构成，可保护病毒的核酸不受环境影响，并在宿主细胞上特异性结合到受体蛋白上，进而释放出核酸，完成病毒寄生的生命周期。
2. 病毒的复制过程病毒的复制过程可以分为两个基本环节：感染和复制。
病毒依靠其外壳上的结构蛋白和其他因素，特异性地结合到宿主细胞表面受体上，然后进入细胞内，释放出核酸。
核酸会在宿主细胞内复制、转录、翻译，生成新的病毒核酸和外壳蛋白，再经过自组装等机制，形成新的病毒颗粒，最终释放出来，再重复感染新细胞，完成病毒生命周期。
3. 病毒的基因组组成病毒的基因组组成既简单又复杂。
一方面，其基因组体积相对较小，且没有细胞具有的许多生物合成、代谢等功能基因。
另一方面，病毒基因组具有相当的遗传信息、高度致病性和易突变性，这使其能够在病毒和宿主之间的共进化过程中适应和演化，不断产生新的病原体种类和变种。
4. 病毒的变异与进化机制病毒的变异主要源于其高度易突变的基因组，以及在复制过程中的随机失误和复合错误等原因。
由于病毒的短生命周期和大量繁殖，使得其遗传多样性远高于其他生物，这也为病毒变异和进化开辟了更多的途径。
一些病毒的变异可以导致其致病性和传播能力的改变，从而对公共卫生和人类健康带来新的威胁。
5. 病毒的检测方法病毒的检测手段因其非常微小和非细胞性质而与其他微生物不同。
其中，最常用的方法是分子生物学技术，主要包括核酸杂交、聚合酶链反应（PCR）、逆转录-PCR等。
分子生物学技术在植物病毒检测中的应用
※农业科学农业与技术2021,%l.41,No.1123分子生物学技术在植物病毒检测中的应用董芳娟魏增云薄一览（忻州师范学院,山西忻州034000）摘要：为了实现植物病毒的预防和控制，需要建立起快速、高灵敏度、高通量的检测技术，对植物病毒进行高精度的检测。
随着分子生物学技术的发展，其在植物病毒检测领域获得了重要应用，当前植物病毒检测领域常用的分子生物学技术包括核酸杂交技术、反转录PCR技术、荧光定量PCR技术和DNA微阵列技术，本文对这几种技术及其在植物病毒检测技术中的应用进行探讨。
关键词：分子生物学；植物病毒；检测；应用中图分类号：S-3文献标识码：A植物病毒在全球范围内的危害越来越大，植物病毒能够导致农作物和经济作物发病，造成产量下降甚至绝收的情况出现，给农业带来极大的损失。
近年来，发现的植物病毒种类越来越多，当前发现的植物病毒分为18个科，共76个属，总数量超过1000种。
随着我国与国际贸易规模不断扩大，境外植物病毒通过口岸的输出风险不断扩大，因此加强植物病毒的检测效率和准确性就显得更为重要。
为了防止植物病毒的危害，需要做好病毒预防和综合防治工作，而建立快速、高灵敏度、高通量的病毒检测体系是做好上述工作的前提。
植物病毒的检测技术经历了多年发展，起初常用的检测技术包括生物学鉴定和电子显微镜技术，随后酶联免疫吸附反应成为植物病毒常用的手段。
随着分子生物学的发展，在植物病毒检测领域，分子生物学方法已经获得了广泛的应用，包括核酸杂交技术、反转录PCR技术、荧光定量PCR技术和DNA微阵列技术等，本文对这几种技术及其在植物病毒检测领域的应用进行介绍。
1核酸杂交技术根据碱基互补配对原理，互补的核酸单链可以相互结合，核酸杂交技术就是利用了这一原理，通过对一段病毒特异的核酸序列进行标记，制成探针，将其和待测样品的核酸进行杂交，若发生杂交则表示病毒存在。
这种方法可以应用于DNA、RNA病毒及类病毒的检测，该方法具有较高的灵敏度，同时还具有特DOI：10.19754/j.nyyjs.20210615007异性强、通量高等方面的优点。
8病毒感染的分子生物学检验
6、DNA病毒一般比RNA病毒大，生活周期较复杂
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RNA病毒基因组特点
1. RNA病毒基因组：多为ssRNA，少数dsRNA 2. 基因组所携带的遗传信息都在同一条链上 3. 许多哺乳动物retro-V为双倍体(+) RNA，它可与宿
主基因重组，干扰宿主基因表达调控 4. 变异率很高 5. 复制和转录常独立于宿主细胞核 6. 均需经逆转录完成基因组复制，错误率高
毒基因表达有关
27
HBV基因组编码产物
病毒颗粒装配，基因组复制，基因表达调控
➢ S基因区→ 外膜蛋白(HBsAg等) ➢ C基因区 → e抗原（HBeAg）
pre-C → 前-C蛋白 C区→ C蛋白(HBcAg)
➢ P基因区→ HBV多聚酶蛋白 ➢ X基因区→ X蛋白（HSxAg）
28
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HBV耐药性分析
➢ 抗HBV药物：核苷酸类似物（拉米夫定lamivudine，阿德
福韦adefovir等） 服拉米夫定0.5-1年，20%患者产生耐药，服2年，38%耐
药，服4年，66%耐药…
➢ HBV发生耐药突变后肝功能恶化的比例显著增高 ➢ 耐药原因：HBV变异较高
病毒复制须经过RNA中间体的逆转录过程，DNAP具逆转 录酶性质，缺乏严格的校正功能
病毒复制水平下降，病毒蛋白合成减少，血清中 标志物滴度下降 ➢ 功能复杂，能直接或间接损害宿主细胞，导致肝 细胞凋亡、死亡、癌变
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HBV的分子生物学检验
➢ 病毒核酸的检测 ➢ 病毒的耐药性分析 ➢ 病毒的基因分型
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HBV核酸检测
HBV DNA是病毒复制和传染性的直接标志 ➢ 普通PCR：特异性引物（保守区） ➢ 荧光定量PCR：灵敏度高，量化 ➢ 支链DNA：灵敏度较低，检测范围较窄 ➢ 核酸杂交：特异性高，灵敏度较低 ➢ 基因芯片：多位点（保守区）
分子生物学的现况和今后的发展资料讲解
分子生物学的现况和今后的发展分子生物学的现况和今后的发展唐宇轩MSN摘要分子生物学是利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，从而为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据的一门学科。
近些年其发展迅速，并渗透到了多门学科的研究领域。
分子生物学的发展前景是相当可观的。
关键字分子生物学现状及发展基因治疗蛋白质工程分子生物学的发展及其在临床医学上的应用已经走过了半个多世纪的路程,随着国际交往的增加,近年来我国分子生物学技术有了突飞猛进的发展。
目前在医学院校和省级以上的医院均建立了临床分子生物学实验室。
随着分子生物学的兴起和向各方面的渗透，生物科学的各分支学科也经历着兴衰更替的变化。
从目前的发展状况来看，分子生物学仍将保持带头分支学科的地位，分子生物学带动了整个生物科学的全面发展。
就分子生物学现状来看，现代生物科学是生物科学与众多学科之间相互交叉、渗透和相互促进的结果。
例如：分子生物学渗入到发育生物学产生了分子发育生物学(molecdar developmental biology), 生活周期短的一些动植物如线虫、果蝇、拟南芥已成为发育生物学的重点研究对象,它们的发育过程很多已从分子水平得到了解。
分子生物学与细胞生物学关系密切,已形成一门新的分子细胞生物学(molecdar cell biology)。
许多细胞生物学问题如细胞分裂、细胞骨架(cytoskeleton)、细胞因子(cytoldne)的研究都进入了分子水平。
免疫学与分子生物学结合,产生了分子免疫学(molecular immunology)。
病理学与分子生物学结合,产生了分子病理学(molecular pathology〉,其中病毒学与分子生物学结合,就是分子病毒学(molecular virology〉其他相关科学推动了生物科学对生命现象和本质的研究不断深入和扩大，生物科学的发展也为其他相关科学提出了许多新的研究课题，开辟了许多新的研究领域。
病毒中和试验-病毒蚀斑技术-分子生物学技术
单层法主要步骤：
（1）先将敏感细胞在培养瓶或平皿内培养成单层
（2）倾弃或吸弃营养液加入Earle氏洗液冲洗单层细胞
或者加入不含血清的维持液（pH7.4-7.6）的0.5％乳白蛋白水
解物Earle氏液，37℃浸泡1 h后倾弃，洗去脱落的死亡细胞，
并可将细胞间隙中残留的血清充分洗出，以减少血清对某些
基因组DNA探针、cDNA探针、RNA
探针和人工合成的寡核苷酸探针
① 按标记物划分
放射性标记和非放射性标记（生物素
和地高辛）
➢ DNA探针（DNA probe） 技术
基本原理
✓ DNA探针是带有标记物的已知序列的DNA片段
✓ DNA探针技术的基本原理是碱基配对
✓ 在变性而成为单链的被检DNA中加入变性的探
1. 病毒中和试验
2. 病毒蚀斑技术
3. 分子生物学技术
1. 病毒中和试验
1.1 中和试验概念、方法和应用
概念：
病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去
对易感动物的致病力，谓之中和试验
以测定病毒感染力为基础，以病毒受免
疫血清中和后的残存感染力为依据在，
来判定免疫血清中和病毒的能力
方法：
① 固定血清－稀释病毒法（病毒中和试验）
1先将敏感细胞在培养瓶或平皿内培养成单层2倾弃或吸弃营养液加入earle氏洗液冲洗单层细胞或者加入不含血清的维持液ph7476的05乳白蛋白水解物earle氏液37浸泡1h后倾弃洗去脱落的死亡细胞并可将细胞间隙中残留的血清充分洗出以减少血清对某些病毒可能有的非特异性抑制作用3接种病毒以不含血清的维持液将病毒作连续的10倍稀释选择适当稀释度的病毒悬液接种培养瓶或孔内的单层细胞接种量约为原营养液的110120每个稀释度至少接种3瓶或孔置37感作12小时使病毒充分吸附4中性红营养琼脂覆盖平放3060min待其凝固置37培养黑纸或黑布盖住中性红是光动力活性染料遇光时产生对病毒呈现毒性作用的物质分子生物学技术31核酸探针技术32单克抗体隆技术33核酸扩增34核酸电泳35免疫印迹技术311核酸探针种类31核酸探针技术按来源及性质划分基因组dna探针cdna探针rna探针和人工合成的寡核苷酸探针按标记物划分放射性标记和非放射性标记生物素和地高辛dna探针dnaprobe技术基本原理在变性而成为单链的被检dna中加入变性的探针随着温度的降低探针便可与被检dna中的互补序列形成双链这一过程称杂交通过捕捉探针标记物释放出的信号便可知被检dna中有无与探针序列相同的dna每一种病原体都具有独特的dna片段通过分离和标记这些片段就可制备出探针用于疾病的诊断等研究dna探针的标记物及标记用于dna探针标记的有效射性同位素和非放射性标记物常用的放射性同位素有32非放射性标记法可将生物素地高辛连接在dntp上然后象放射性标记一样掺入到核酸链中制备标记探针dna杂交固相杂交技术目前较为常用先将待测核酸结合到一定的固相支持物上再与液相中的标记探针进行杂交固相支持物常用硝酸纤维素膜nitrocellulosefiltermembrane简称nc膜或尼龙膜nylonmembrane通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上ii
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1、腺病毒
1953年，Rowe等人从外科手术摘除的儿童腺体中分离到一种致病因子 ，可以使培养的细胞发生慢性进行性病变，称之为腺体退化因子，后来证明 这种致病因子是病毒，1956年，Enders等建议命名为腺病毒。
1.3 病毒对宿主细胞的影响
病毒只能在活细胞中存活，因此，病毒与宿主细胞之间有着十分密切的关系 。病毒利用宿主细胞的细胞器、能量和酶等进行自身的复制，并通过宿主细胞的 蛋白表达系统来表达自身所需的蛋白质，这些过程都将会对宿主细胞的形态和功 能产生重大的影响。
病毒对宿主细胞的影响主要体现在病毒对宿主细胞形态和结构的影响以及病 毒对宿主细胞功能的影响两个方面。
腺病毒的侵染过程
纤毛
受体
非整合
感染宿主细胞 腺病毒
复制 (细胞中的)溶酶体
翻译
病毒蛋白
转录
2、乙型肝炎病毒
乙 型 肝 炎 病 毒 简 称 乙 肝 病 毒 。 是 一 种 DNA 病 毒 ， 属 于 嗜 肝 DNA 病 毒 科 （ hepadnaviridae），基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。根据目前所知， HBV就只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙肝病毒成颗 粒状，也会被称为丹娜颗粒（Dane）。1965年由丹娜发现，直径为42纳米，颗 粒分为外壳和核心两部分。
腺病毒的毒粒结构
腺病毒是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈二十 面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约 含4.7kb，两端各有长约100bp的反向重复序列。由于每条DNA链的5'端同相 对分子质量为55X103 Da的蛋白质分子共价结合，可以出现双链DNA的环状 结构。
病毒分子生物学
目录
病毒分子生物学研究的内容 DNA病毒的分子生物学 RNA病毒的分子生物学
一、病毒分子生物学研 究的内容
1.1 病毒基因组的结构
不同类型的病毒，其基因组有很大差异。在核酸类型上，有DNA病毒(如 腺病毒)，有RNA病毒(如HIV病毒)，但对每一种病毒来说，它只能含有一种 核酸。
表面抗原
不同大小的 表面蛋白
核心抗原
乙型肝炎E抗原
乙型肝炎病毒的六大症状
1、乙肝的全身症状主要表现为体力不支，疲劳，没精神。 2、乙肝患者的消化道症状主要表现为食欲不振，厌油，恶心，腹胀，上腹 部不适等症状。
1.4 病毒与肿瘤发生
人类和动物肿瘤的形成除了与遗传和环境因素相关外，某些DNA和RNA病 毒也可以通过不同的机制诱发恶性肿瘤。
有些病毒直接作用于细胞的基因组，使细胞增殖，最终导致肿瘤形成；有些 病毒则通过抑制机体的免疫系统，诱导细胞恶性转变，形成肿瘤。
有些病毒常伴随一些特定肿瘤的发生，但它们与肿瘤的关系还未得到确认. 例如在艾滋病病人中引发的Kaposi‘s肉瘤。
由于基因工程疫苗具有安全性好、产量高、成本低，以及良好的免疫原性， 它必将成为传统疫苗的有效替代疫苗。
二、DNA病毒的分子 生物学
DNA病毒：是生物病毒的一种，属于一级。
繁殖：是专性活细胞内寄生物。它不可单独进行繁殖，必须在活细 胞内才可。
繁殖方式：复制。
繁殖过程：吸附(病毒粒子借衣壳上的受体与宿主细胞“粘附”在一 起，否则，病毒粒子将不能侵入宿主细胞)。注入遗传物质，接着就是利 用寄主细胞的营养进行DNA的复制和蛋白质的翻译，然后就是装配，最 后就释放。
从核酸结构上看，有的是单链核酸，有的是双链核酸，有的是线状，有 的是环状。
相对于能独立生活的微生物来说，病毒的基因组非常简单。完整的病毒 颗粒包括外壳蛋白和内部的基因组DNA或RNA。外壳蛋白（或被膜）的功能 是识别和侵袭特定的宿主细胞并保护病毒基因组不受核酸酶的破坏。
1.2 病毒基因组的复制和表达调控
病毒不能独立地复制，必需进入宿主细胞中借助细胞内的一些酶类和细胞 器才能使病毒得以复制。
病毒基因的表达包括转录和翻译两个过程。 正链RNA病毒的基因组除了作为模板复制出子代RNA之外，还有mRNA的 作用。作为翻译的模板，一般先翻译出单一的大分子肽链，然后再由蛋白酶降 解为不同功能的结构蛋白等。 负链RNA病毒的基因组无mRNA的功能，必须由复制出的互补 RNA(cRNA)来发挥mRNA的作用。
总之，大约15%的恶性肿瘤与病毒有关，因's肉瘤肉瘤（KS）又称多发性特发性出血性 肉瘤，临床特点：以皮肤特发性，多发性，色素性肉瘤 ，在四肢多发的大小不同的结节。可分为四型：慢性或 经典型；非洲地方型；医源性免疫抑制型；艾滋病相关 型。目前认为新型人类疱疹病毒（HHV-8）可能是所有 亚型的诱导因素。
腺病毒分布十分广泛， 从各种胎生哺乳动物、鸟类和两栖类动物中都已 分离到。
腺病毒能引起呼吸系统，消化系统，泌尿系统等多个系统的感染。腺病 毒感染细胞后可关闭宿主细胞某些基因的表达，大量合成病毒蛋白质，致使 细胞的功能失常。
患者和隐性感染者是腺病毒感染的主要传染源，主要通过呼吸道飞沫近 距离传播，在相对密闭，通风不畅的场所容易发生传播。
乙型肝炎病毒 (HBV) 的抵抗力较强，但65℃10小时、煮沸10 分钟或高压蒸 气均可灭活HBV。含氯制剂、环氧乙烷、戊二醛、过氧乙酸和碘伏等也有较好的 灭活效果。
乙型肝炎病毒的结构图
完整的HBV颗粒，直径42 nm，由包膜和核心组成。包膜是HBV最外边 的部分，由表面抗原、糖蛋白和细胞脂质构成。核心部分由核心蛋白（ HBcAg）构成的二十面体核衣壳包裹环状双股DNA、DNA聚合酶（DNAP)构 成，是病毒复制的主体。
1.5 病毒基因工程疫苗与病毒载体
基因工程疫苗是指用基因工程的方法，表达病原微生物的一段基因序列，将 表达产物(多数是无毒性、无感染能力，但具有较强的免疫原性)用作疫苗，例如 正在使用的大多数乙型肝炎疫苗就是基因工程疫苗。
常见的基因工程疫苗包括亚基疫苗和肽疫苗两类。以流感疫苗为例，其途径 就是把病毒的免疫原蛋白(HA抗原、NA抗原)的mRNA提取出来，再制备cDNA， 克隆到大肠杆菌中，高效表达该抗原。