试验四革兰氏染色法

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革兰氏染色法步骤及注意事项

革兰氏染色法是一种常用于细菌分类和鉴定的染色技术。以下是该方法的步骤和注意事项：步骤：
1. 准备细菌涂片：将待染菌株取一小滴放在玻璃片上，用铅笔头部画成细线，形成细菌涂片。
2. 固定：将细菌涂片在火焰上反面向上加热，使细菌附着在玻璃片上。 3. 染色： a. 涂上紫晶液：将细菌涂片浸入紫晶液中，静置 1 分钟。 b. 冲
1. 操作环境应保持干净，并采取无菌操作，以避免外界细菌污染。 2. 手套、眼镜和实验室外套是必需的个人防护装备。
3. 严格遵守安全操作规程，如避免将染料接触到皮肤或进入口鼻。
4. 使用优质的试剂和试验器材，以确保结果的准确性。
5. 注意控制染Βιβλιοθήκη 时间和冲洗时间，过长或过短都可能影响染色效果。
6. 在观察细菌涂片时，使用适当的显微镜镜头和光源，以获得清晰的图像。
洗：用蒸馏水或脱离水轻轻冲洗玻璃片，以去除多余的紫晶液。 c. 酒精洗涤：滴加酒精洗涤玻璃片，使其被酒精覆盖，持续洗涤 15-30 秒。 d. 再次冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除酒精。 e. 涂上碘液：滴加碘液覆盖细菌涂片，静置 1 分钟。 f. 冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除多余的碘液。 g. 酒精洗涤：滴加酒精洗涤玻璃片，使其被酒精覆盖，持续洗涤 15-30 秒。 h. 再次冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除酒精。 i. 涂上脱色剂：滴加脱色剂覆盖细菌涂片，持续涂覆 15-30 秒。 j. 冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除脱色剂。 4. 染色：将细菌涂片滴上红色染料（如苏丹三染料）覆盖细菌，静置 1 分钟。 5. 冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除多余的染料。 6. 干燥：将细菌涂片放在通风处晾干，或用吹风机低温吹干。 7. 观察：将干燥的细菌涂片放在显微镜下观察，细菌将呈现出紫色或蓝色的革兰氏阳性颜色，而其他微生物将呈现出红色的革兰氏阴性颜色。注意事项：

革兰氏染色法的过程及原理

革兰氏染色法的过程及原理革兰氏染色法是一种用于细菌分类和鉴定的重要染色方法。

该方法由丹麦细菌学家克里斯汀·革兰发现并发展起来，于1884年首次发布。

革兰氏染色法能够将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，具有重要的临床和实验室应用价值。

染色：将待检测的细菌接种于玻璃片上，用火焰烘烤杀灭细菌并固定在玻璃片上。

接着，将玻璃片放入甲醇中，用火焰加热将甲醇蒸发。

然后，将玻璃片浸泡在革兰之前的染色液中，染色液由紫色的亚甲基紫和碘化钾组成。

这一步骤的目的是通过紫色染料使细菌固定在玻璃片上。

洗涤：将玻璃片放入碘化钾溶液中洗涤。

碘化钾能与细菌细胞壁上的一些成分形成复合物，使细菌呈现蓝色。

固定：将玻璃片放入醇中洗涤。

醇有助于将紫色染料从革兰阴性菌的细胞壁中洗去。

显微观察：将玻璃片放入显微镜下观察。

在显微镜下，革兰阳性菌呈现紫色，而革兰阴性菌呈现红色。

根据这一特征，可以进行细菌的初步分类和鉴定。

革兰氏染色的原理是基于细菌细胞壁的差异。

革兰氏阳性菌具有较厚的细菌细胞壁，由于其壁中含有较多的肽聚糖和穿过壁的肽聚糖横向支链，革兰阳性菌在染色过程中能够较好地固定紫色染料，显示为紫色。

而革兰氏阴性菌则具有较薄的细菌细胞壁，壁中的肽聚糖和肽聚糖支链较少，使得革兰阴性菌无法固定紫色染料，而显示为红色。

革兰氏染色法的原理还与染色液中紫色染料的结构有关。

紫色染料中的亚甲基紫分子带有正电荷，而革兰阳性菌细胞壁中的较多的负电荷物质使其对亚甲基紫具有亲和力，从而固定了紫色染料。

而革兰阴性菌细胞壁中的负电荷物质相对较少，因此无法固定紫色染料，而被酒精洗去，再经过后续的红色染料染色，显示为红色。

然而，革兰氏染色法也存在一些局限性，比如一些细菌可能失去一些特性，导致染色结果不准确。

此外，一些细菌在真菌的单位时间染色效果不佳，也需要进行其他进一步的鉴定方法。

因此，在细菌分类和鉴定中，革兰氏染色法常常与其他染色方法和生化试验相结合使用，以提高鉴定的准确性和可靠性。

革兰氏染色的实验报告（共9篇）

革兰氏染色的实验报告(共9篇)革兰氏染色实验报告革兰氏染色法的原理及其练习摘要：革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，所以学习微生物学，进行革兰氏染色实验是很重要的。

为保证染色结果的正确性，采用规范的的染色操作方法是十分必要。

本实验主要对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）进行革兰氏染色，观察它们的染色特征，辨别是革兰氏阴性还是阳性，从而掌握其染色方法。

染色方法与过程很清晰，但实验结果中金黄色葡萄球菌(S.aureus Rosenbach）多组呈现假阴性。

本实验的主要目的是熟悉并掌握革兰氏染色方法及原理，但要想做出很好的染色得多加练习。

本实验还可以锻炼显微镜操作技术和无菌操作技术。

关键词：革兰氏染色大肠杆菌(E.coli) 金黄色葡萄球菌(S. aureus Rosenbach) 枯草杆菌(B.subtilis)引言革兰氏染色是微生物学中最重要的鉴别染色方法，它可以直接将细菌分为革兰氏阴性和革兰氏阳性。

革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构组成与结构的差异所决定的。

经过一定的染色过程后，革兰氏阳性的细菌会因为细胞壁肽聚糖的含量高，脂质含量低而保持第一次染色的蓝紫色。

革兰氏阴性细菌细胞壁的脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，蓝色被洗脱，复染后变为红色。

革兰氏染色原理很简单，染色时需注意要注意使用处在活跃生长期的细菌，涂片不宜过厚，严格控制脱色时间。

大肠杆菌(E.coli)是革兰氏阴性细菌，金黄色葡萄球菌(S. aureus Rosenbach)与枯草杆菌(B.subtilis)都是革兰氏阳性细菌，染色后在显微镜下容易区别。

同时它们的形态各异，可以根据具体颜色和形态差异来判断染色是否成功。

本实验还涉及到高倍油镜的使用。

革兰氏染色试验步骤

三、实验器材
1 、菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。
2 、试剂：革兰氏染液:草酸铵结晶紫染液、卢戈氏典液、 95%乙醇、番红复染液；芽孢染液:5%孔雀绿染色液、 0.5%番红水溶液。
染色结果：阴性细菌（G-）：染成红色
2 、芽孢染色原理
细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后又难以脱色这一特点，用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸，在加热条件下，延长染色时间，使染料不仅进入菌体也进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂番红复染后，芽孢仍保留初染剂的绿色，而菌体则被染成复染剂的红色。
内（扦在接种线上）培养：倒置平板，28℃培养5-7天。
镜检：拔出盖玻片，擦去背面培养物，将有菌的一面放在载玻片上，直接镜检或将有菌的一面朝下，放在滴有0.1%美蓝染色液载玻片中镜检。
1 盖玻片 2 培养基
酵母菌形态观察方法（美蓝浸片法）
载玻片中央加一滴0.1%美蓝染色液。挑取酵母菌苔少许，置美蓝染色液中混合均匀。用镊子取盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，以免产生气泡影响观察。用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况。
氏阳性菌。典型放线菌的菌丝体分化产生各种形态特征：
基内丝菌（较细、透明）
菌丝体气生菌丝（较粗颜色较深）有无气生菌丝
孢子丝（直、波曲、各种螺旋或轮生）等，是分类鉴定的重要依据孢子：分生孢子（球形，椭圆，杆状或柱状）、孢囊孢子、游动孢子

简述革兰氏染色法的实验步骤

简述革兰氏染色法的实验步骤一、准备工作1.1 准备细菌培养物：从培养基上取出革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的培养物，注意保证培养物的纯度和活性。

1.2 准备玻璃片：将玻璃片洗净，并用酒精炉烘烤杀菌，确保无菌。

1.3 准备染色试剂：包括革兰碘液、革兰酒精、洗净的蒸馏水和苏木精染色液。

二、制备细菌涂片2.1 取一支无菌的注射针，将其浸入细菌培养物中，沿着玻璃片上划出一条细菌涂片。

2.2 将涂片晾干，避免细菌在涂片上移动。

三、革兰氏染色3.1 将制备好的细菌涂片放在染色盘上，用革兰碘液滴在涂片上，静置一分钟。

3.2 用蒸馏水洗去多余的革兰碘液。

3.3 倾斜染色盘，用革兰酒精沿涂片滴流，停留时间约为30秒，直到滴落的酒精不再有颜色流出。

3.4 用蒸馏水洗去多余的革兰酒精。

3.5 将涂片放在苏木精染色液中，静置1-2分钟。

3.6 用蒸馏水冲洗涂片，直到冲洗液不再有颜色流出。

3.7 用纸巾轻轻吸干涂片上的水分。

四、观察和解读4.1 将制备好的革兰氏染色涂片放在显微镜下，使用100倍或1000倍镜进行观察。

4.2 革兰氏阳性菌：细菌的细胞壁含有大量的革兰染色复合物，因此在显微镜下呈紫色或蓝色。

4.3 革兰氏阴性菌：细菌的细胞壁较薄，不含革兰染色复合物，在显微镜下呈红色或粉红色。

4.4 根据颜色可以初步判断细菌的革兰氏染色特性。

五、注意事项5.1 实验过程中要注意无菌操作，避免外源细菌的污染。

5.2 染色时间要控制好，过长或过短都会影响染色效果。

5.3 在染色过程中要轻柔操作，避免细菌涂片的脱落或损坏。

5.4 染色后的涂片要及时观察，避免颜色的变化影响结果的解读。

通过以上实验步骤，可以使用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。

这对于临床医生和微生物学研究者来说具有重要意义，可以帮助他们快速鉴定细菌种类，并选择合适的治疗方法。

同时，革兰氏染色法也是微生物学实验中常用的基础技术，对于学习和理解细菌的结构和特性有着重要的作用。

革兰氏染色试验步骤

2 、增加显微镜的分辨率
D值愈小则表明分辨力愈强。
D=0.61λ/NA
分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离的能力。
NA=n· sinα/2
λ：光波波长 NA：物镜的数值孔径值
n：介质折射率
α：镜口角（总是小于180°）
三、实验器材
1 、标本：细菌三型玻片。
2 、试剂：香柏油、镜头清洗液（V乙醚:V酒精＝7:3）。
3 、器具：显微镜（有油镜）、擦镜纸、玻璃棒等。
四、实验步骤
1 、放置标本:将染色的细菌三型玻片置于镜台上。 2 、找合适的视野: 先用低倍镜寻找合适的视野并将欲观察的部位其移到视野中央。 3 、转换油镜：将油镜转到工作位置。 4 、调节聚光器与油镜数值孔径一致：将聚光器上升到最高位置，可变光阑开到最大。 5 、加香柏油：使油镜镜头浸入香柏油中。注意油镜镜头千万不要压在玻片标本上。 6 、调焦：转动粗调焦螺旋，再缓慢地提升油镜调焦至物像清晰。注意下降或上升镜筒或载物台绝不可用力过猛。 7 、观察: 仔细观察细菌的三种基本形态 8 、显微镜用毕后的处理: 上升镜筒，取下玻片，清洁油镜
四、实验步骤
1 、革兰氏染色
涂片：用接种环挑取少许菌苔于水滴中混匀后，再挑取2-3 环菌悬液至另一载片上涂开。
干燥：室温自然干燥或电吹风吹干固定：涂片朝上，通过火焰2-3次，
初染：滴加草酸铵结晶紫覆盖涂片区域染色2min，水洗。
染色
媒染：滴加卢氏碘液，染色1min，水洗。脱色：用滴管加95%乙醇冲洗脱色约30秒，立即水洗。复染：滴加番红液复染约2min，水洗。
实验一显微镜（油镜）的使用和细菌的三种基本形态观察
一、实验目的 1、学习并掌握油镜的基本原理和使用方法。 2、观察和识别细菌的三种基本形态。

革兰氏染色法

革兰氏染色法革兰氏染色法方法概述细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。

为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染。

阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。

有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。

革兰氏阳性菌对青霉素敏感，革兰氏阴性菌对链霉素敏感。

可根据革兰氏染色法鉴别不同菌种并对症下药。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。

现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。

另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。

所以染色时的条件要严格控制。

例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。

此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。

所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。

染色原理G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。

呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

操作流程革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：１）涂片固定。

在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。

２）草酸铵结晶紫染1分钟。

革兰氏染色法详细步骤

革兰氏染色法详细步骤革兰氏染色法革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，用于鉴别细菌的类型，也是临床和实验室细菌学检查的重要手段。

以下是革兰氏染色法的详细步骤：1. 涂片：取一张洁净的载玻片，用移液器或毛细管将菌液滴在载玻片上，涂布均匀。

涂片时，应先滴少量菌液，涂布均匀后再滴加剩余菌液。

涂片时需注意不要将菌液涂成条状或块状，以免影响染色效果。

2. 固定：涂片完成后，将载玻片置于酒精灯火焰上方，用镊子夹住，用外焰固定约30秒至1分钟。

固定时需注意不要将玻片烧焦，以免影响染色效果。

3. 初染：用移液器或毛细管取少量结晶紫溶液，滴加在涂片菌膜上，染色3分钟至5分钟。

结晶紫是一种碱性染料，能够与细菌中的核糖核酸结合，使其呈现紫色。

4. 媒染：用移液器或毛细管取少量沙黄溶液，滴加在初染后的菌膜上，染色1分钟至2分钟。

沙黄是一种酸性染料，能够使革兰氏阳性菌被染成红色，革兰氏阴性菌被染成绿色。

5. 脱色：用移液器或毛细管取少量95%乙醇溶液，滴加在媒染后的菌膜上，轻轻摇动玻片，使菌膜上的染料脱色。

脱色时需注意不要将菌膜洗脱或出现折痕。

6. 复染：用移液器或毛细管取少量番红溶液，滴加在脱色后的菌膜上，染色3分钟至5分钟。

番红是一种碱性染料，能够使革兰氏阳性菌被染成红色，革兰氏阴性菌被染成蓝色。

7. 镜检：染色完成后，用吸水纸吸干菌膜上的染料，盖上盖玻片，显微镜下观察细菌的革兰氏染色结果。

革兰氏阳性菌呈现红色或紫色，革兰氏阴性菌呈现蓝色或绿色。

以上是革兰氏染色法的详细步骤。

操作时需注意安全，避免酒精灯等高温物品烫伤。

同时需注意每一步操作的准确性和一致性，以保证染色结果的准确性和可比性。

革兰氏染色法操作规程

革兰氏染色法操作规程一、实验准备1.工作台、培养瓶、试管、移液器等必需设备材料的清洁和消毒。

2.需要的培养基、试剂和染色剂的准备。

3.微生物实验室内的操作区域消毒。

4.需要检测的细菌样本，应是新鲜培养的活菌。

二、实验步骤1.将培养的细菌接种物涂布于平板培养基上，培养时间一般为16小时到24小时，以获得足够数量的活菌。

2.取一到两个细菌菌落，用无菌吸铬钢线将菌落挑取，加入到新鲜制备的无菌蒸馏水中制备细菌悬浮液。

3.将细菌悬浮液分装到无菌试管中，并对其进行标记以便辨别。

4. 将试管放入无菌离心机进行离心处理，离心速度一般为3000rpm，离心时间约为5分钟。

5.取出离心后的试管，将离心液倾倒掉，保留细菌沉淀。

6.用无菌注射器吸取一定量的蒸馏水，在细菌沉淀中做三次洗涤，每次洗涤后进行离心处理。

7.吸尽洗涤液后，用吸水纸吸去残余水分，使细菌沉淀尽量干燥。

8.用火焰消毒的铅笔划定干净试验玻片两侧的带标记区域。

9.取少量细菌沉淀用铅笔将其在试验玻片上涂成条状。

10.将涂有菌液的玻片放置在火焰中加热烘干，将菌液固定在玻片上。

11.将固定好的玻片依次进行以下操作：(1)滴加革兰氏碘液，静置1分钟。

(2)用蒸馏水清洗草绿色的碘液，盖过玻片的边缘。

(3)滴加酒精洗涤剂(80%)，使玻片浸泡在酒精中，30秒内亮紫色的溢出。

(4)用蒸馏水冲洗玻片，直至玻片溢出无色为止。

(5)滴加索式葡萄染料，使玻片完全覆盖，静置30秒。

(6)用蒸馏水冲洗玻片，直至落出少量菌落。

12.用吸水纸将玻片表面水分吸干，然后放置在通风处晾干。

13.晾干后的玻片放到显微镜下，用油镜检测。

14.观察和记录细菌的形态特征，包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的结构差异。

三、实验注意事项1.所有的试剂和设备都要经过严格消毒处理，防止外部污染。

2.操作过程中要注意无菌操作，避免细菌受到污染。

3.离心过程中要注意离心机的平衡，以免产生震动。

4.细菌沉淀尽量干燥，以便于后续染色步骤。

革兰氏染色试验

革兰氏染色实验革兰氏染色(Gram Staining)是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同,可将细菌分成两类,即革兰氏阳性(Gram Positive)与革兰氏阴性(Gram Negative).(这种染色法是由一位丹麦医生汉斯•克里斯蒂安•革兰于1884年所创造).未经染色之细菌,由于其与周围环境折光率差异甚小,故在显微镜下极难观察.染色后细菌与环境形成鲜明比照,可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征,而用以分类鉴定.革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌:革兰氏阳性菌：葡萄球菌属(主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等)、链球菌属(肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等)、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽抱杆菌等,其中,金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要的病原菌.革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸檬酸菌属、假单胞菌属〔绿脓杆菌等〕、莫拉菌属〔卡他莫拉菌等〕、奈瑟菌属〔淋球菌、脑膜炎双球菌等〕、不动杆菌属〔鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等〕、克雷伯菌属〔主要是肺炎克雷伯杆菌〕、沙门氏菌属、志贺氏菌属〔痢疾杆菌等〕、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属〔杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等〕、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等.革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中占了大约65%,且大多菌株容易对抗菌药物耐药,产生“新德里金属酶" 〔NDM-1〕的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌〔主要是大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌〕.革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌.大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌,它们能产生外毒素使人致病,而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌,它们产生内毒素, 靠内毒素使人致病.细胞形态和结构细胞的根本结构包括细胞壁和原生质体两局部.原生质体位于细胞壁内,包括细胞膜〔细胞质膜〕、细胞质、核质和内含物.另外细胞还含有有些特殊结构,主要有荚膜、芽抱、鞭毛和菌毛等4种.1 .细胞壁革兰氏染色的机理主要是抓住了革兰氏阳性细菌与阴性细菌在细胞壁的结构与组成上的不同,具体比拟见下表：进一步的,革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖和包括磷壁酸的酸性多糖构成,细胞外表整体带负电的局部原因就是由于磷壁酸带负电.同时,磷壁酸赋予了革兰氏阳性细菌以特异的外表抗原.总的说来,细胞壁结构的差异导致了染料吸收的差异,也导致了很多生理特性的不同.2 .非细胞壁结构性性一兰早明性郛菌•兰氏阴性细菌外壁层结构Hl# nm)Z-J0三房飞三、M配/F冬吟日T5%汪单位交联,正箔益密上图华巳翔阳碑位空於瞬曲城沱=1阴m性美系腾箍二汩性1毛『|』口%福如5%; “ D%土蜜〔龄一蛔王五宅法天五蛋E五一或无无fi指雪龙三存11S-22%在非细胞壁结构中,革兰氏阳性细菌和阴性细菌主要的区别在于是否有芽抱和鞭毛与性菌毛的不同上.芽孢是某些细菌菌体发育过程中的一个阶段,在一定的环境条件下由于细胞质和核质的浓缩凝集形成的一种特殊结构.革兰氏阴性细菌中没有会形成芽抱的菌种,而局部革兰氏阳性细菌可以.另外,在鞭毛和性菌毛方面两者也有不同.鞭毛和性菌毛都是附属物.某些细菌外表伸出的细长、波曲的附属物称为鞭毛.革兰氏阳性细菌的鞭毛上根本着生两个环,革兰氏阴性细菌那么根本着生四个环.性菌毛只见于革兰氏阴性菌,参与细胞间称作接合作用的交配过程.生理特性以下是关于革兰氏阳性细菌和阴性细菌在生理特性方面的比拟. 两者的不同从本质上来说,还是主要是由细胞结构的不同所决定的.用日虽兰对日性细菌革兰氏阴性和菌对机械力的抗性强弱至1胞壁抗花菌南弱〔砂感〕理〔不原感,*对青毒春、磷胺钻感不勘感*对链霉素、氯霉素、哩F素八城魅前感对碱性霜的抑菌作用强弱*对阴离子去污剂敏感不敏感*对叠氨叱论颍感不勖感对一曜血性强疝件弱代卅抱壁最外层中脂务雄阻碍流阕诙、亩牛叁.染料、去污各I等式十分千番入步骤：革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤,具体操作方法是：〔1〕制片.取菌种培养物常规涂片、枯燥、固定.要用活泼生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热〔以玻片不烫手为宜〕.〔2〕初染.滴加结晶紫〔以刚好将菌膜覆盖为宜〕染色1-2min,水洗.〔3〕媒染.用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约1min,水洗.〔4〕脱色.用滤纸吸去玻片上的残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加95%的乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节：脱色缺乏,阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度,阳性菌被误染成阴性菌.因而脱色时间一般为 20-30S.〔5〕复染.用番红液复染约2min,水洗.〔6〕镜检.枯燥后,用油镜观察.菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌, 被染成红色的为革兰氏阴性菌.明第名燃料S扇港U疑isr：i生五丸红匕用说也染#1；i月等红化江电韭闲箱状.亚色t用酒新瑞色原理:通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,再用95%乙醇脱色.革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇或丙酮脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色 [1].染色的差异主要是阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的.①革兰氏阳性细菌的细胞壁G+细菌细胞壁具有较厚〔20-80nm〕而致密的肽聚糖层,多达50层,占细胞壁成分的40%〜95%,它同细胞膜的外层紧密相连〔图2-9〕.有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸〔teichoic-acid〕,也称胞壁质〔murein〕,它是甘油和核糖醇的聚合物,磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在.由于磷壁酸带负电荷,它在细胞外表能调节阳离子浓度.磷壁酸与细胞生长有关,细胞生长中有自溶素〔autolysins〕酶类起作用,磷壁酸对自溶素有调节功能,阻止胞壁过度降解和壁溶.如果细胞壁的肽聚糖层被消溶,G+细胞成为原生质体(protoplasts),细胞壁不复存在,而只存留细胞膜.除链球菌外, 大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质.②革兰氏阴性细菌的细胞壁G一细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄(15〜20nm)而结构较复杂, 分外膜(outer membrane)和肽聚糖层(2〜3nm)(图2-10).在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间,称为壁膜间隙(periplasmic space).外膜G—细菌细胞壁外膜的根本成分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),它同细胞质膜相同之处也是双层类脂,但除磷脂外还含有多糖和蛋白质.LPS的多糖局部包括核心多糖和O-特异多糖.O-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成,含有已糖(葡萄糖、半乳糖和鼠李糖) 和二脱氧已糖.由于糖的种类不同,使各种G—细胞具有不同特性的LPS.核心多糖(core polysaccharide)的主要组分是酮脱氧辛酸(ketodeoxyoctonate, KDO).外膜中还含有几种蛋白,如脂蛋白、通透蛋白.有些蛋白具有通孔作用(porin),调控外界分子进入细胞；有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体；许多G—细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的,它的毒性组分常称为内毒素(endotoxins).肽聚糖层G—细菌细胞壁的肽聚糖层很薄,在大肠杆菌和其它细菌中仅有单层.肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来.壁膜间隙G—细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙,一层薄的肽聚糖处于其间,肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽,肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄.大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12〜15nm,呈胶胨态.其间含有三类蛋白质：水解酶,催化食物的初步降解；结合蛋白,启动物质转运过程；化学受体(chemoreceptors), 在趋化性中起作用的蛋白.染色结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色,革兰氏阴性菌呈红色.。

革兰氏染色的机理和步骤

1.革兰氏染色的机理和步骤机理：G+、G-主要由其CW化学成分的差异而引起对乙醇的通透性，抗脱色能力的差异。

主要有肽聚糖的厚度和结构所决定。

G+的CW:肽聚糖层厚，脂质含量低。

乙醇脱色时CW脱水，孔径减少，透性降低，不易脱色，呈初染得蓝紫色。

G-的CW：肽聚糖层薄，脂质含量高。

乙醇脱色时，类脂被乙醇溶解，透性升高，细胞被复染显红色。

步骤：①涂片：在干净的载玻片上滴一滴水，用接种环挑取菌体均匀涂布于水中。

②固定：将玻片靠近酒精灯火焰，蒸干水分，但不要烤焦。

③初染：用碱性颜料结晶紫对菌液涂片进行初染。

④媒染: 以碘液媒染1min，水洗，吸干水分。

(细胞内形成结晶紫与碘的复合物，增强相互作用）⑤脱色(关键步骤）：以95%的乙醇脱色30s，应适当振荡均匀，是乙醇脱色完全。

⑥水洗，吸干。

⑦复染：??(第2张）复染30s，水洗吸干。

⑧干燥镜检。

2、用渗透皮层膨胀学说解说芽孢耐热机制。

芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种失水的核心才赋予芽孢极强的耐热性。

3、引起微生物培养过程中PH变化的几种可能反应，并说明如何能够维持微培PH稳定。

答：培养过程中，由于营养物质被分解利用，代谢产物的形成与积累，会导致PH变化。

（第2张中的图）还与培养基的C/N比有关，C/N高，经培养基后PH显著下降，C/N 低，经培养基后PH明显上升。

PH调节：①加入缓冲剂--------常用:一氢二氢磷酸盐，K2HPO4 呈碱性，KH2PO4 酸性，只在一定的PH范围内调节（6.4--7.2）②大量产酸的菌株，加CaCO3调节，CaCO3难溶于水，不会使培养液的PH过度增加，但可不断中和微生物产的酸。

③培养液中存在天然的缓冲系统，如AA，肽，Pr均属两性电解质，也起缓冲的作用。

④过酸：治标------加NaOH、Na2CO3中和，治本-----加适量氮源：NaNO3、Pr、NH3·H2O；增加通风量。

革兰氏染色法

普通光学显微镜的使用及微生物形态观察与革兰氏染色法付伟伟200900140022 微生物实验北楼314摘要本实验选用金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和大肠杆菌为标本，进行革兰氏染色，并在油镜下观察其生物形态。

实验过程属于无菌操作。

关键词革兰氏染色；油镜；无菌操作引言现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又称为复式显微镜。

它们由机械装置和光学系统两大部分组成。

在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，他直接影响着显微镜的分辨率。

在普通光学显微镜配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要，与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间加滴镜油。

镜油一般选用香柏油。

镜油有两个方面的作用：增加照明亮度和增加显微镜的分辨率。

革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G—）两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。

首先用草酸铵结晶紫初染，所有的细菌都会染上结晶紫的蓝紫色。

然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘和结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了结晶紫在菌体中的滞留能力。

之后用95%酒精作为脱色剂经行处理时，两种细菌的脱色效果不同。

格兰仕阳性细菌的细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。

而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物很容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又染上复染剂颜色（红色）。

本实验之所以采用金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌，是因为他们代表了微生物的两种基本形态：球状和杆状细菌，而且枯草芽孢杆菌具有微生物重要的内含物—芽孢，与普通杆菌有所不同。

革兰氏染色法的判断标准

革兰氏染色法的判断标准革兰氏染色法是微生物学中常用的染色技术，用于区分细菌的革兰氏阳性和革兰氏阴性的分类。

该方法是由丹麦微生物学家Christian Gram于1884年提出的。

革兰氏染色方法的判断标准是根据细菌细胞壁的结构差异来区分细菌是否为革兰氏阳性或革兰氏阴性。

在该染色方法中，革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌的细胞壁更厚，含有更多的多聚醇。

这些差异导致了染色时的不同反应结果。

以下是革兰氏染色法判断标准的相关参考内容：1. 革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌在经过革兰氏染色后，细菌细胞呈现紫色（靛蓝色）或深紫色，形状圆形或椭圆形。

这是由于革兰氏阳性菌的细胞壁由厚重的胞内和胞外层组成，胞内层含有多肽和脂多糖，因此在革兰氏染色过程中保留了紫色的染色剂。

革兰氏阳性菌中的常见细菌有链球菌、葡萄球菌和梭菌等，这些细菌在革兰氏染色法中不易失去紫色染色剂，因此在显微镜下呈现为紫色或深紫色的圆形或椭圆形细胞。

2. 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌在经过革兰氏染色后，细菌细胞呈现红色或淡红色，形状多样。

这是由于革兰氏阴性菌的细胞壁相对较薄，胞内脂多糖含量高，革兰氏染色过程中会失去紫色染色剂，并被红色染色剂（如伊红或卡波拉菲琼脂）染色。

革兰氏阴性菌中的常见细菌有大肠杆菌、沙门氏菌和肺炎克雷伯菌等。

这些细菌在革兰氏染色法中失去了紫色染色剂，因此在显微镜下呈现为红色或淡红色的细胞，形状多样。

需要注意的是，革兰氏染色法虽然可以初步判断细菌的革兰氏阳性或革兰氏阴性，但并不能确定细菌的种类。

因此，在进行细菌的鉴定和分类时，需要进行进一步的鉴定试验，例如生理生化试验、分子生物学方法等。

总结起来，革兰氏染色法的判断标准是根据细菌细胞壁的结构差异来区分细菌是否为革兰氏阳性或革兰氏阴性。

革兰氏阳性菌在染色后呈现紫色或深紫色，形状为圆形或椭圆形；而革兰氏阴性菌在染色后呈现红色或淡红色，形状多样。

虽然革兰氏染色法可以初步判断细菌的分类，但不能确定具体种类，需要进一步的鉴定试验来确定细菌的种类。

革兰氏染色实验报告

革兰氏染色实验报告一、实验目的1.了解革兰氏染色的原理2.掌握革兰氏染色的操作方法二、实验原理根据细菌的细胞壁结构和成分不同，可用革兰氏法将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

阳性菌由于细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能酒精脱色，仍呈紫色；阴性菌由于肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，乙醇将细胞壁脱色，细胞无色，碱性品红复染后呈红色。

三、实验材料及仪器1.实验材料：枯草芽孢杆菌（或大肠芽孢杆菌）、草酸铵结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、碱性品红染液、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、废水缸、胶头滴管、酒精灯2.仪器：油镜、接种环四、实验步骤1.涂片：挑一环蒸馏水于载玻片中央，再用接种环挑取少量芽孢杆菌与玻片上的水滴均匀混合，并涂成约1cm^2的薄菌膜；2.固定：将涂片在空气中干燥，手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上快速通过3次，以让菌膜更加牢固地贴在玻片上，待冷却后滴加染料；3.染色：（1）初染：手持玻片一端，滴加草酸铵结晶紫染液染色2min后，倾去结晶紫染液，将玻片倾倒一定角度，用细小的水流小心地冲洗，直到玻片上的水流无色，再用吸水纸小心将水吸干；（2）媒染：滴加碘液染色2min后，按照上述步骤用细小水流小心冲洗；（3）脱色：滴加95%乙醇，将玻片稍微摇晃几下后立即倾去乙醇，如此重复2～3次，立即水洗，再用吸水纸吸干，以终止脱色；（4）复染：滴加碱性品红染色3min，水洗后用吸水纸吸干；（5）镜检：先在4倍、10倍、40倍的低倍镜下分别观察细菌，找到最好的视野，再在载玻片上滴加香柏油，转到100倍的高倍镜，使镜头完全浸在油中，观察细菌，使用完毕后用二甲苯擦洗镜头。

五、实验结果细菌呈现紫色，较分散，个别聚集成链状，为革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌）。

项目四金黄色葡萄球菌检测-革兰氏染色

2、染料种类 • 染料按其组成成分可以分为天然染料和人工染
料 • 染料按其电离后染料离子所带电荷的性质分为
酸性染料、碱性染料、中性（复合）染料和单纯染料四大类
3、染色方法（1）单染色法用一种染料使微生物染色，如美蓝
、孔雀绿、碱性番红、结晶紫和中性红等。
（2）复染色法又称鉴别染色法是用两种或两种以上染料进行染色，有协助鉴别微生物的作用。最常用的鉴别染色法为革兰氏染色法。
Baird-parker鉴定-菌落形态特征
灰色到黑玉色，圆形，光滑突起，湿润，边缘常为淡色（米黄色或灰色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。
Why?
鉴定-革兰氏染色镜检
革兰氏阳性菌，球形，组成葡萄状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.Fra bibliotek μm～1 μm
鉴定-血浆凝固酶试验试管法
血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1 个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 ℃±1 ℃培养18 h～ 24 h。吸取1：4兔血浆0.5ml放入灭菌试管中，再加入培养后的的BHI肉汤0.5ml，振荡均匀，放在 36℃±1 ℃水浴锅，每半小时观察一次，至少观察6小时。
外膜
-
脂蛋白 -
脂多糖 -
革兰阴性菌
11%22% + + +
1、G+细菌的细胞壁。厚而致密，由肽聚糖和磷壁酸组成，以金黄色葡萄球菌为代表。
2、 G-细菌的细胞壁。分两层，外层为脂蛋白和脂多糖层，内层为肽聚糖层，以大肠杆菌为代表。
三、常用的染色方法
1、染色的基本原理主要是通过细胞及细胞物质对燃料的毛细现象、渗透、吸附等物理因素，以及各种化学反应进行的。

革兰氏染色法

革兰氏染色法革兰氏染色法(Gram's stain)是最常用的细菌染色法，本实验要求同学能正确掌握此染色方法的操作技术，理解其在鉴别细菌上的重要意义。

【原理】细菌经结晶紫初染染成蓝色。

革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。

而革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。

【材料】【方法】按涂片→干燥→固定→染色→镜检的顺序进行。

准备载物玻片：用镊子从载物片缸中取出经3％盐酸酒精脱脂的载物玻片，用擦片布擦净，然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.5~2.0cm的圆圈，做为涂膜的标记范围。

1．涂片：按无菌操作取材法进行，具体步骤如下：用肉汤培养物涂片：①右手拿接种环的黑色塑料柄部分，左手托持试管。

②将接种环按15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝烧红(图1-2)，然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。

③用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞，并立即将试管口用火焰烧灼灭菌。

④用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料(图1-3)，此时注意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。

⑤将试管口再次灭菌，棉塞也要在火焰上略加烧灼（时间要短以免点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。

⑥将接种环上之材料涂于载物片上，随后立即将接种环用火焰烧灼灭菌。

为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。

用斜面培养物涂片：用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载物片上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔，在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜。

无菌操作取材步骤同前。

革兰氏染色实验步骤

革兰氏染色一．实验流程：1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈(用来大致确定菌液滴的位置）。

涂菌的部位在火焰上烤一下,除去油脂.2、涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环,在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌.固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上,使其薄而均匀。

3、晾干:让涂片在空气中自然干燥。

4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2—3次固定（以不烫手为宜）。

5、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min.6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液,用吸水纸吸干。

简单染色结束可观察细胞形态。

7、媒染：滴加1滴碘液，染1min,水洗。

8、脱色:吸去残留水，连续滴加95％乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。

9、复染:滴加蕃红复染3-5min，水洗。

至此，革兰氏染色结束。

二．染色结果:革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。

备注:1.革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等)、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等)、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌.2.革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆菌等)、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等)、克雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属(杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。