Tan第五章目的基因的导入和重组子的筛选.pptx
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第5章 基因工程基本流程-筛选与鉴定
16
选择过程
1）从重组克隆中提取质粒（或基因组DNA） 2）用相应引物进行PCR反应 3）电泳PCR产物 4）检查是否有PCR产物 5）PCR产物的长度是否与外源基因一致 原理图p58
17
2. Southern blot杂交
原理： 从宿主细胞中提取 DNA （或质粒载体），再用特
异性探针（与目的基因同源）进行核酸杂交。只
3. western blotting 原理： 蛋白——蛋白杂交 选择过程
western blot过程
48
单抗blotting结 果
多抗Blotting结果
49
4. 蛋白凝胶电泳 原理： 待筛选克隆与非重组子同时进行蛋白质电泳，电泳 结束后通过染色对比相应条带辨识重组子。适合受 体蛋白表达种类较少，外源基因高效表达的体系。
9
选择过程
10
-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。
11
3. 营养缺陷型筛选法 原理 载体能够合成某些生长必须营养成分， 受体菌基因突变不能合成这种生长必须的营养物质。 在缺少该营养物质的培养板上涂布细菌，长出的菌落
均含有载体的，是否重组子需进行第二轮筛选。
12
选择过程
营养合成型载体
营养缺陷型受体
22
选择过程 在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性 的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA 双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。
23
缺点：需要电镜
24
5. Northern blotting
原理：
从宿主细胞中提取 RNA，
再用探针杂交。
主要检测插入片断是否
被转录。检测表达载体。
表型筛选加酶切筛选
T A A T
基因工程5-重组子筛选(中国药科大学生物工程所有课件)
二抗 二抗上联着一种酶
（碱性磷酸酶、过 氧化物酶、脲酶 等）。
显色反应：加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反 应转变成有色物质（或发光）。 比色：在特殊的分光光度仪 （酶标仪）上比色，打印出 结果。
3.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
四、原位杂交
1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中 的核酸进行杂交，称原位杂交。根据探针与待检核 酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交
探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目 的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
（1）菌落印记原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
待测基因 产物蛋白
一抗
二抗
酶
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察
2. ELISA检测的一般步骤
固定样品:将待测样品加入96孔微量滴定板 （microtiter plate）的孔中，干燥后就被固 定在孔底。 一抗结合：加入一抗，反应后冲洗掉未结合的 抗体。
孔底
一抗
加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二 二抗结合：抗冲洗掉。二抗只识别一抗。
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有 中止密码；（不破坏肽）。
IPTG诱导的结果： MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道 是否有DNA插入。
无质粒的 受体菌
-半乳糖苷酶 部分缺失，不 能分解Xgal； 无抗菌素抗性
（2)Southern blotting
重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
目的基因.ppt
与RNA聚合酶结合有关 -75区上游有一共有序列GGGCGC (GC框):结合某些转录因子 转录终止区:
（3）其他基因组基因的组成
质粒(无内含子) 、 病毒(重叠基因) 、 线粒体(缺少 SD序列) 、叶绿体(多顺反子) 。
一、目的基因的来源 二、获得目的基因的途径
一、目的基因的来源
目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基 因组，特别是人和动植物染色体基因组中蕴藏着大 量的基因，是获得目的基因的主要来源。
结构基因的组成
转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或 TAA或TGA)、终止转录区
（1）原核生物基因的组成
基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：
5’AGGAGGU3’，核糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的 DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。
原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。
（2）真核生物基因的组成
基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。
编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区： -20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)：解链，决定起录点 -75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)：
（3）应用范围
DNA合成仪
1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因
（3）其他基因组基因的组成
质粒(无内含子) 、 病毒(重叠基因) 、 线粒体(缺少 SD序列) 、叶绿体(多顺反子) 。
一、目的基因的来源 二、获得目的基因的途径
一、目的基因的来源
目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基 因组，特别是人和动植物染色体基因组中蕴藏着大 量的基因，是获得目的基因的主要来源。
结构基因的组成
转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或 TAA或TGA)、终止转录区
（1）原核生物基因的组成
基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：
5’AGGAGGU3’，核糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的 DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。
原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。
（2）真核生物基因的组成
基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。
编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区： -20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)：解链，决定起录点 -75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)：
（3）应用范围
DNA合成仪
1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因
2020秋季 基因工程 第5章 重组DNA分子的构建、导入及筛选
①提高插入片断的用量
连接反应体系中，插入片断比载体多：外源 DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 。
②载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团
载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。 但可以与插入片断以单链连接。
载体
5’
3’
插入片断
4、载体和外源DNA片段的连接结果 （1）插入片段互相连接 （2）载体自身环化连接 （3）一个载体与几个插入片段重组 （4）载体之间互相连接 （5）几个载体与一个插入片段重组
（2）在PCR产物两端添加限制性内切酶酶切位点，将 PCR产物连接至表达载体，用于目的基因的表达。
1. PCR产物直接连接T载体（克隆载体）
PCR产物两个3’端一般都有一个A
PCR反应中所使用的聚合酶（Taq）具有
5’
A
末端连接酶的活性，通常在3'加上A。
A
5’
T载体的两个3’端个含有一个T
5’T7
二、重组DNA分子导入大肠杆菌细胞的方法
转化（transformation）：感受态的大肠杆菌捕获 和表达质粒载体DNA分子的生命过程。
细菌细胞处于容易吸收外源DNA的状态叫做感受态 (competent)
转化子（transforment） ：导入外源DNA后获得 了新的遗传标志的细菌细胞。
连接产物
重组DNA分子：基因工程中人为地将来自不同的生物体的DNA片
段进行连接，产生的DNA分子。
• 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数
• 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% • 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大
简化DNA重组的后续筛选操作。
重组文库的构建与筛选讲义ppt课件
2019重组DNA的构建与筛选23感染
以噬菌体为载体，在体外将噬菌 体 DNA包装成病毒颗粒，使其 感染受lasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA
分子。大小约为
数 千碱基对。常
有 1 ~ 3个抗药
性 基因，以利于
筛 选。
2（克隆载体）
• 为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性 繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 • 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成 多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
质粒DNA 噬菌体DNA
病毒DNA2019 重组DNA的构建与筛选 202019 重组的发现
三位科学家由于限制
性核酸内切酶的发现 及其在分子遗传学中 的应用，为遗传工程 的产生拉开了序幕而 获得1978年诺贝尔生 源——基因载体
• 重组DNA技术中广泛应用的噬菌体是大肠杆菌的温和噬菌体λ，它是在1951 年由美国学者E．莱德伯基物材料作为RNA分离的出发材料,有些甚 至要经过特殊的诱导处理以提高所需 DNA的丰度。
分： 质粒 基因载体 噬菌体 病毒
直接分离 cDN限制性内切酶
目的基因
接：
粘端连接
连接酶
平端连接 尾接法
重组体
转： 转化 转染 带重组体的宿主
2019 筛：
体外包装表型筛选重组 DNA的构建与筛选 电泳法核酸杂交
33
一
目的基因的制备
反转录--应用得最多的获 取目的基因的方法。前提 是目的基因的序列已知， 至少部分已知。 真核细胞 的基因多 数为单拷 贝，难 于 分离到足 够的目的 基因。
广义的遗传工程包括细胞水平上的遗传操作（细胞工程）和分 子水平上的遗传操作，即重组DNA技术（有人称之为基因工 程）,狭义的遗传工程则专指术(Transgene technology)
以噬菌体为载体，在体外将噬菌 体 DNA包装成病毒颗粒，使其 感染受lasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA
分子。大小约为
数 千碱基对。常
有 1 ~ 3个抗药
性 基因，以利于
筛 选。
2（克隆载体）
• 为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性 繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 • 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成 多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
质粒DNA 噬菌体DNA
病毒DNA2019 重组DNA的构建与筛选 202019 重组的发现
三位科学家由于限制
性核酸内切酶的发现 及其在分子遗传学中 的应用，为遗传工程 的产生拉开了序幕而 获得1978年诺贝尔生 源——基因载体
• 重组DNA技术中广泛应用的噬菌体是大肠杆菌的温和噬菌体λ，它是在1951 年由美国学者E．莱德伯基物材料作为RNA分离的出发材料,有些甚 至要经过特殊的诱导处理以提高所需 DNA的丰度。
分： 质粒 基因载体 噬菌体 病毒
直接分离 cDN限制性内切酶
目的基因
接：
粘端连接
连接酶
平端连接 尾接法
重组体
转： 转化 转染 带重组体的宿主
2019 筛：
体外包装表型筛选重组 DNA的构建与筛选 电泳法核酸杂交
33
一
目的基因的制备
反转录--应用得最多的获 取目的基因的方法。前提 是目的基因的序列已知， 至少部分已知。 真核细胞 的基因多 数为单拷 贝，难 于 分离到足 够的目的 基因。
广义的遗传工程包括细胞水平上的遗传操作（细胞工程）和分 子水平上的遗传操作，即重组DNA技术（有人称之为基因工 程）,狭义的遗传工程则专指术(Transgene technology)
Tan第五章目的基因的导入和重组子的筛选
12/30/2020
欢迎同学们听课！
5
5.1.2 DNA片段之间连接的方式
• 具互补黏性末端片段之间的连接 • 具平末端DNA片段之间的连接 • DNA片段末端修饰后进行的连接 • DNA片段加linker or adaptor后的连接
12/30/2020
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6
5.1.3 DNA重组中需注意的问题
9
5.2.2 受体细胞选择的原则
• 外源DNA分子能稳定存在，限制酶缺陷型； • 重组基因缺陷型； • 易于转化/ 转导； • 易筛选 • 遗传稳定性高，易于扩大培养； • 安全性高； • 内源蛋白酶基因缺失或缺陷； • 遗传密码无明显偏好性； • 具有较好的转译加工机制； • 较高的理论和实践应用价值。
• 两端具相同粘性末端的DNA分子会发生自 身环化。
• 对于置换重组，需将切割的DNA分子经过 凝胶电泳分离，回收目的片段。
• 无论单酶切还是双酶切，目的DNA分子均 可能发生串联，必需检测重组DNA插入片 段的分子大小。
12/30/2020
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7
5.2 受体细胞及其选择的基本原则
5.2.1 受体细胞 5.2.2 受体细胞选择的基本原则
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16
表4—1 大肠杆菌常用转化方法的比较
转化方法 Ca 诱 导
原生质体转化 噬菌体转化 电穿孔法 结合转化
转化效率 107-8 105-6 107-8
106-9（<100Kb） 104-5
12/30/2020
欢迎同学们听课！
17
5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转 化法）
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18
5-目的基因的重组导入
转化 加入 1mLSOC 培养液
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
（3） 平板 培养细菌
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
4.转化率和影响转化率的因素
每gDNA转化成功的细菌克隆数 总受体细胞所获的转化成功的细菌数
（1）重组质粒
①环形质粒数 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片段进入细菌会被降解。
收DNA复合物，球状细胞复原并分裂增殖。在选择性培 养基平板上可挑选所需的转化子。简单，但转化效率不
高（106-108/gDNA）。
10ng载 体DNA 100L感 受态菌 10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42º C 1.5分钟
二乙氨乙基葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外 源DNA。
1
葡聚糖 DEAE
预处理
细胞
摄入
外源DNA
2
外源DNA
混合
细胞
吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可 以进入到细胞核里。 DEAE对细胞有毒!
本章思考题（3）
1、重组DNA分子在导入受体前如何保证插入的正确？ 2、受体的选择有什么要求？ 3、导入大肠杆菌受体的方法有哪些？ 4、导入植物细胞的方法有哪些？ 5、导入动物细胞的方法有哪些？ 6、简述各种重组DNA导入法的优缺点。
但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片段的用量
（2）用碱性磷酸酶处理载体
5’
3’ 插入片段
载体
载体和外源DNA插入片段的连接结果
受体细胞：
原核生物细胞
真核生物细胞 酵母菌细胞
重组子导入和筛选精美生物医学
[原理] 利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。
转化率： DNA分子转化宿主细胞获得转化子的效率 什么叫转化子？ 导入外源DNA分子后能稳定存在的宿主细胞 什么叫重组子？ 导入的外源DNA为重组DNA的转化子
LacZ基因
在X/gal培养基上呈现兰色
-半乳糖苷酶
-半乳糖苷酶 X-gal X(发色底物)+gal(半乳糖)
根据外源性DNA片段性状进行筛选 根据外源基因可能表达的蛋白质对缺 乏该蛋白的细菌的影响
第一章节
如果外源性DNA片段可编码产生蛋白质，并且该蛋白质为细菌生命活动所必需，可利用该蛋白质的性状进行筛选。
（二）个体水平
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
4 PCR反应进行鉴定
利用引物直接扩增外源基因进行检测
肺腺癌β-cat mRNA 原位杂交法×400
宿主细胞分为两大类：
01
原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等；
单击此处添加小标题
02
真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
单击此处添加小标题
单击此处可添加副标题
大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： 对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 有各类菌株和载体系列。 目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。 易培养，成本低。
重组子的筛选与鉴定.ppt
• 指编码的产物能够使转化或转染的细胞在有选择 剂或营养缺乏的情况下很好生长或表现出其他可 视特征的基因。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
Tan第五章目的基因的导入和重组子的筛选
5.3.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 5.3.2 重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 5.3.3 重组DNA分子转入真核细胞
9/23/2020
欢迎同学们听课！
13
5.3.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌
5.3.1.1 细菌转化的机制 5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法） 5.3.1.3 电激法（电穿孔转化法） 5.3.1.4 转化率的计算及其影响因素
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18
5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法）
• 感受态细胞制备： 感受态细胞：指处于能吸收周围环境
中DNA分子的生理状态的细胞。 处理。菌种活化、培养、收菌和进行CaCl2
• DNA分子转化感受态细胞：
冰浴、42ºC热激、37 ºC恢复、涂板培 养。
9/23/2020
9/23/2020
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14
5.3.1.1 细菌转化的机制
• 转化(transformation)：
重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体
细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为
转
化
。
自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主
要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的
转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和
9/23/2020
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11
• 宿主细胞进行正常的复制。因此，需要将 重组克隆鉴定出来。
• 把重组DNA导入受体细胞进行扩增
• 根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞
及选择适宜的重组DNA导入的方式：转化、
转染和转导。
9/23/2020
欢迎同学们听课！
9/23/2020
欢迎同学们听课！
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5.3.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌
5.3.1.1 细菌转化的机制 5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法） 5.3.1.3 电激法（电穿孔转化法） 5.3.1.4 转化率的计算及其影响因素
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5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法）
• 感受态细胞制备： 感受态细胞：指处于能吸收周围环境
中DNA分子的生理状态的细胞。 处理。菌种活化、培养、收菌和进行CaCl2
• DNA分子转化感受态细胞：
冰浴、42ºC热激、37 ºC恢复、涂板培 养。
9/23/2020
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5.3.1.1 细菌转化的机制
• 转化(transformation)：
重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体
细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为
转
化
。
自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主
要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的
转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和
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• 宿主细胞进行正常的复制。因此，需要将 重组克隆鉴定出来。
• 把重组DNA导入受体细胞进行扩增
• 根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞
及选择适宜的重组DNA导入的方式：转化、
转染和转导。
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目的基因的制备和基因克隆的筛选PPT教案
ardaddrtddrtpcrpcrestses原理与步骤酵母双杂交的原理与步骤分析讨论分析讨论试述分离和筛选目的基因的主要方法和原理试述分离和，从染色体DNA出发，直接克隆目的基 因非常困难。 高等生物具有大约104-5种基因，但在一定发育阶 段的单个细胞或个体中，仅15％左右的基因表达。可见由 mRNA出发反转录而产生的cDNA克隆，其复杂程度要比是同尾酶
I（5’GATC）牛牛文档分享4) 构建cosmid基生素标记，可在大
肠杆菌中复制；也含cos位点，可体外包装。重组Cosmid进 入大肠杆菌后，只按质粒DNA的方式复制，所得为30~45 kb）；②载体分子 很小（~5 kb），便于插入片段的限制酶图谱分析。 缺点：①筛选困难；②重组效率低； ③不易贮存。牛牛文档分享
7.4 利用PCR 扩增目的基因
如果知道目的基因的全序列或其两侧序列，可合成一对引 物， 利用PCR有效地扩增出所需片段。为了克隆操作的方便或 保证克隆后基因的方向正确性，常常对引物的5’-端作修饰，如 限制酶切点，启动子序列或起始或终止密码。经过PCR扩增后 ，添加的序列最终可整合到新合成的产物中，便于下一步的重 组克隆和基因的表达和调控研究(图)。
N = ln(1 片段的出现概率，一般期望值为 99％； f是某种 mRNA的，cDNA克隆是某些不经过DNA中间体的RNA病毒（ 如流感、脊髓灰质炎等病毒）基因组结构研究及有关基因的此法适用于已分离纯化且足以产生特定抗体的蛋白质。
多聚核糖 体制备
与一抗 保温
多聚核糖 体-一抗
多聚核糖 体-一抗体
-二抗
不连续蔗糖梯 度离心
纯化的多聚 核糖体-一抗
体-二抗
去除蛋白
特定 mRNA
cDNA
黄色葡萄球菌中的 protein A可以同IgG产生免疫反应而代替 第二抗体，由此发展出用protein A -Sepharose 4B作为亲和层析介 质，通过亲和层析分离特定的多聚核糖体的技术想的基因组：“全”，克隆群体包含基因组的所有
I（5’GATC）牛牛文档分享4) 构建cosmid基生素标记，可在大
肠杆菌中复制；也含cos位点，可体外包装。重组Cosmid进 入大肠杆菌后，只按质粒DNA的方式复制，所得为30~45 kb）；②载体分子 很小（~5 kb），便于插入片段的限制酶图谱分析。 缺点：①筛选困难；②重组效率低； ③不易贮存。牛牛文档分享
7.4 利用PCR 扩增目的基因
如果知道目的基因的全序列或其两侧序列，可合成一对引 物， 利用PCR有效地扩增出所需片段。为了克隆操作的方便或 保证克隆后基因的方向正确性，常常对引物的5’-端作修饰，如 限制酶切点，启动子序列或起始或终止密码。经过PCR扩增后 ，添加的序列最终可整合到新合成的产物中，便于下一步的重 组克隆和基因的表达和调控研究(图)。
N = ln(1 片段的出现概率，一般期望值为 99％； f是某种 mRNA的，cDNA克隆是某些不经过DNA中间体的RNA病毒（ 如流感、脊髓灰质炎等病毒）基因组结构研究及有关基因的此法适用于已分离纯化且足以产生特定抗体的蛋白质。
多聚核糖 体制备
与一抗 保温
多聚核糖 体-一抗
多聚核糖 体-一抗体
-二抗
不连续蔗糖梯 度离心
纯化的多聚 核糖体-一抗
体-二抗
去除蛋白
特定 mRNA
cDNA
黄色葡萄球菌中的 protein A可以同IgG产生免疫反应而代替 第二抗体，由此发展出用protein A -Sepharose 4B作为亲和层析介 质，通过亲和层析分离特定的多聚核糖体的技术想的基因组：“全”，克隆群体包含基因组的所有
目的基因导入受体细胞及重组子的筛选
活化菌种，扩大培养，使其 处于对数生长后期 （OD600=0.4）
3-4 ml菌液冰水浴中10 分钟，4 ℃离心集菌
转 入 37 ℃ 水 浴 上5 min， 加入 1 ml不含选择性 药 物 的 LB 培 养 基
转入42 ℃水浴 上 2 min ， 使 感受态细胞吸 收重组DNA。
0.2 ml新制备好 的感受细胞中加 入缓冲液溶解的 重 组 DNA ， 置 于冰水浴中1 h 以上，期间轻摇 几次
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受 体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能 进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含 有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或 一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所 致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中 筛选出来。 ■转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转 化子。 ■重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。 具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
3.各种类型受体细胞的优缺点
（1）原核细胞 ■优点 大 部 分 原 核 细 胞 没 有 纤 维 素 组 成 的 坚 硬 细 胞 壁 ， 便 于 外 源 DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA 与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外 源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料， 并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。
重组克隆的筛选与鉴定.ppt
②然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性， 来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素， 又能合成-半乳糖苷酶的细胞，就是重 组子细胞。
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③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很 灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、 IPDG的培养基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它 能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子 克隆因Lac Z基因被破坏，不能合成完 整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而 呈白色。
②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不 同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体 培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。 ④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培
养基上去找那些原始的克隆。 ⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就
是含有重组pBR322质粒的重组子。
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图 pBR322的结构图
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2. 同源序列
不同来源的核酸单链只要彼此之间有一 定程度的互补顺序，即某种程度的同源 性，就可形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与DNA（Northern blot） 或RNA与RNA（In situ）的二条单链之 间进行。
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3. 分子杂交法
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第四节 核酸的分子杂交
核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于70 年代建立，应用DNA或RNA探针，与 靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸 纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。
核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转 化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选 将转化后生长的菌落，复 印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落， 释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的 核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在 含有目的序列的菌落DNA上。
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③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很 灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、 IPDG的培养基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它 能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子 克隆因Lac Z基因被破坏，不能合成完 整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而 呈白色。
②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不 同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体 培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。 ④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培
养基上去找那些原始的克隆。 ⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就
是含有重组pBR322质粒的重组子。
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图 pBR322的结构图
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2. 同源序列
不同来源的核酸单链只要彼此之间有一 定程度的互补顺序，即某种程度的同源 性，就可形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与DNA（Northern blot） 或RNA与RNA（In situ）的二条单链之 间进行。
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3. 分子杂交法
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第四节 核酸的分子杂交
核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于70 年代建立，应用DNA或RNA探针，与 靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸 纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。
核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转 化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选 将转化后生长的菌落，复 印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落， 释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的 核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在 含有目的序列的菌落DNA上。
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10/27/2020
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5.2.1 受体细胞
• 受体细胞（receptor cell）：又称为宿 主细胞或寄主细胞（host cell）
• 从实验技术上讲：是能摄取外源DNA 并使其稳定维持的细胞。
• 从实验目的上讲：是有应用价值和理论 研究价值的细胞。
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本课程内容
• 第一章 绪论 • 第二章 基因克隆的工具酶 • 第三章 基因工程的载体 • 第四章 目的基因的制备 • 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 • 第六章 外源基因的表达 • 第七章 基因操作的基本技术 • 第八章 植物基因工程及应用 • 第九章 动物基因工程及应用 • 第十章 医学基因工程及应用
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表4—1 大肠杆菌常用转化方法的比较
转化方法 Ca 诱 导
原生质体转化 噬菌体转化 电穿孔法 结合转化
转化效率 107-8 105-6 107-8
106-9（<100Kb） 104-5
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5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转 化法）
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5.1.2 DNA片段之间连接的方式
• 具互补黏性末端片段之间的连接 • 具平末端DNA片段之间的连接 • DNA片段末端修饰后进行的连接 • DNA片段加linker or adaptor后的连接
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5.1.3 DNA重组中需注意的问题
5.3.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 5.3.2 重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 5.3.3 重组DNA分子转入真核细胞
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5.3.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌
5.3.1.1 细菌转化的机制 5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法） 5.3.1.3 电激法（电穿孔转化法） 5.3.1.4 转化率的计算及其影响因素
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DNA分子连接
不同的DNA片段（目的基因和载体）经适 当酶切后，在连接酶的作用下，连接在一起构 建成重组DNA分子 。
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5.1.1 DNA重组（连接）的类型
• 插入重组: 载体上只有唯一的酶识别位点 随机（非定向）插入
• 置换重组 (1) 载体上有两个同样的酶识别位点 随机（非定向）置换 (2) 载体上有两个不同的酶识别位点 定向置换
• 原理：0ºC、低浓度（50～100 mM）CaCl2，Ca2+改 变细胞膜的磷脂层结构，提高膜的通透性，而且增强 进入细胞的DNA分子抗DNase的能力。
特点：操作简便，不需特殊仪器，一般实验室均可进 行。转化率在5106～2 107个转化子/g质粒DNA范围 内，完全可满足常规克隆的需要。
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5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法）
• 感受态细胞制备： 感受态细胞：指处于能吸收周围环境
中DNA分子的生理状态的细胞。 处理。菌种活化、培养、收菌和进行CaCl2
• DNA分子转化感受态细胞：
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• 宿主细胞进行正常的复制。因此，需要将 重组克隆鉴定出来。
• 把重组DNA导入受体细胞进行扩增
• 根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞
及选择适宜的重组DNA导入的方式：转化、
转染和转导。
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5.3 基因转移（gene transfer）
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第五章 目的基因导入和重组子的筛选
5.1 DNA片段的连接重组 5.2 受体细胞选择的基本原则 5.3 基因转移 5.4 重组子的筛选
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5.1 DNA片段的连接重组
5.1.1 DNA连接类型 5.1.2 DNA片段之间连接的方式 5.1.3 DNA重组中需注意的问题
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5.3 基因转移（gene transfer）
• 载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分 子： a. 未连接的载体分子 b. 未连接的DNA片段 c. 载体的自连 d. 含有错误插入片段的重组DNA分子 e. 重组DNA分子 转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细 胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特 殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些DNA片 段。自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入
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5.3.1.1 细菌转化的机制
• 转化(transformation)：
重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体
细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为
转
化
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自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主
要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的
转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和
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5.2.2 受体细胞选择的原则
• 外源DNA分子能稳定存在，限制酶缺陷型； • 重组基因缺陷型； • 易于转化/ 转导； • 易筛选 • 遗传稳定性高，易于扩大培养； • 安全性高； • 内源蛋白酶基因缺失或缺陷； • 遗传密码无明显偏好性； • 具有较好的转译加工机制； • 较高的理论和实践应用价值。
吸收的代谢机制。正常条件下，大部分细菌包括大
肠杆菌，只能吸收有限的DNA，为了提高转a. 热激法转化感受态细胞
b. PEG介导的原生质体转化
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c. 高压电穿孔法转化 d. 显微注射法转化 e. 接合转化 f. 噬菌体转染
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• 两端具相同粘性末端的DNA分子会发生自 身环化。
• 对于置换重组，需将切割的DNA分子经过 凝胶电泳分离，回收目的片段。
• 无论单酶切还是双酶切，目的DNA分子均 可能发生串联，必需检测重组DNA插入片 段的分子大小。
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5.2 受体细胞及其选择的基本原则
5.2.1 受体细胞 5.2.2 受体细胞选择的基本原则