电镜观察固定方法

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扫描电镜SEM制样步骤

扫描电镜S E M制样步骤-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN扫描电镜观察制样步骤固定：1、用灭菌镊子挑出少量的的样品（碳粒/碳毡）,放入 5ml 的离心管中,2、加入2.5%戊二醛, 加量为淹没碳粒/碳毡样品为宜,室温固定1小时3、置于 4℃冰箱中固定12小时。

冲洗：用 0.2mol pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗 3 次，每次 10 分钟。

每次冲洗时先用注射器缓慢吸走上一步骤的冲洗液。

Or 离心脱水：分别用浓度为30%， 50%，75%，90%, 95%, 100% v/v 的乙醇进行脱水，每次10分钟，干燥：将样品放在离心管里，置入干燥器中干燥 12 小时。

粘样：用双面胶将样品观察面向上粘贴在扫描电镜铜板上预处理好的样品放入干净离心管中待检。

SEM上机测样--测定条件参数设置分子克隆实验指南第三版，1568页：25度下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制；先配0.1mol/L K2HPO4，0.1mol/L KH2PO4配PH7.4，100ml磷酸钾缓冲液需：0.1mol/L K2HPO4，80.2ml0.1mol/L KH2PO4，19.8ml混合即是，不用酸碱调PH。

参考文献：DOI:?10.1021/es902165yMicrobial fuel cell?based on Klebsiella pneumoniae biofilmSelecting?anode-respiring bacteria based on?anode?potential: phylogenetic, electrochemical, and?microscopic?characterizationA severe reduction in the cytochrome C content of?Geobacter sulfurreducens?eliminates its capacity for extracellular electron transfer2。

细菌及细胞电镜观察样品制备方法

细菌及细胞电镜观察样品制备方法
1) 取样：取大量样品离心（转速3000r~4000r），去除上清液，加入适当PH（7.2~7.4）的0.1 M PBS清洗三遍；清洗时菌体温柔悬浮。

2) 固定：2.5%戊二醛固定3h（此步时间非绝对，1~12h都可），用PBS清洗两遍，每遍10min。

再用纯水清洗两遍。

3) 梯度脱水：用乙醇的水溶液按30%、50%、70%、80%、90%的浓度梯度对样品进行脱水，每步15min，之后在100%乙醇的水溶液中脱水15min×2 次；再将样品置于乙醇与叔丁醇1:1混合液中15min；最后置样品于叔丁醇中15min×2次。

（此步也能够尝试不做）4) 冷冻干燥：滴加处理好的样品于5*5 mm的盖玻片上，置-80度冰箱冷冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。

5) 电镜观察：样品充分干燥后，进行扫描电镜观察。

2.5%戊二醛：
Step 1:
0.2M磷酸缓冲液的配制：（0.1M的就是稀释2倍）取50mL定容100mL
---------------------
磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克
双蒸馏水加至500毫升
pH调至7.4
Step 2:
戊二醛固定液的配制：
---------------------
25% 戊二醛1ml
双蒸馏水4ml
0.2mol/L磷酸缓冲液5ml
戊二醛最终浓度 2.5%
pH值7.3-7.4。

sem的实验方法

sem的实验方法
SEM（扫描电子显微镜）是一种常用的显微镜技术，用于观察和分析样品的表面形貌和微观结构。

下面是SEM实验的基本方法：
1. 样品制备：根据需要观察的物体或材料，选择合适的样品制备方法。

常见的方法包括金属蒸发覆盖、碳薄膜覆盖、冷冻断裂、超声清洗等。

2. 样品固定：将样品固定在SEM的样品台上。

通常可以使用导电胶或双面导电胶带将样品固定在样品台上，并确保样品与样品台之间有良好的电导性。

3. 真空处理：将样品放入SEM的真空室中，并进行真空处理，以确保在SEM观察过程中减少气体干扰。

4. 调节参数：在开始观察之前，需要根据样品的性质和要观察的目标，设置适当的加速电压、束流亮度、探针电流等参数。

5. 扫描观察：调整SEM的对焦和扫描参数，使电子束在样品表面扫描。

观察过程中可以通过调整探针电流和探针尺寸来获得所需的表面细节。

6. 图像获取：使用SEM中的二次电子或反射电子检测器，捕捉样品表面反射出的电子信号，并将其转换成图像。

可以通过调整对比度、亮度等参数来优化图像质量。

7. 数据分析：对获得的SEM图像进行分析和解读，可以使用图像处理软件进行形貌特征、颗粒分布、晶体结构等的测量和分析。

需要注意的是，SEM操作需要在专门的实验室环境下进行，并且
需要遵循安全操作规程，以确保操作人员和设备的安全。

此外，不同样品的性质和要求可能需要不同的处理方法和参数设置，因此在实验前应充分了解样品的特性和研究目标，以便选择合适的实验方法。

电镜观察固定方法

电镜观察固定方法固定：1、取材；取新鲜拟南芥组织2-3mm2或花苞，迅速放入约5ml固定液中（2.5%戊二醛），针筒抽气（抽干细胞液泡内空气）至材料沉入固定液（如抽气2小时，材料还没有沉入固定液中，可不用抽了）换液5ml戊二醛，4度冰箱中保存至少7天。

若效果不好，可在管口塞团棉花；漂洗：2、吸出固定液及悬浮未沉下的材料，用1ml磷酸缓冲液（4℃保存PH7.2）冲洗，每半小时一次反复3次，将花苞用小镊子分开；固定，染色：3、吸出磷酸缓冲液，加500ul锇酸（有毒，带手套，避光，用锡箔包裹；渗透力很弱，楼下加）过夜染色（打开抽湿机操作）；漂洗，脱水：4、磷酸缓冲液洗去锇酸，开始酒精脱水过程如下：30%10min 50%10min 70%10min 到70%酒精可存放至晴天脱水较好；（注意：以上均为4℃条件即放在冰上进行，以下几步都在室温下进行）80%15min 90%15min 95%15min 100%30min 100%30min（晴天秋季为宜）包埋:环氧丙烷20min 环氧丙烷20min 包埋剂：环氧丙烷1：3过夜，500ul(注意：100%乙醇和环氧丙烷在使用时，要提前用无水硫酸钠或无水硫酸铜过滤，除去里面水分)5、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比1：1），过夜；6、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比3：1），过夜；（以上包埋放在摇床上，以便均匀渗透）聚合7、在橡胶小板上加入纯包埋剂，用牙签把材料分别移入橡胶小板的空格内摆放整齐，一般放2个花苞，过夜。

（注意：多余的包埋剂置于4℃保存，防止凝固）8、直接把橡胶小板置于65℃条件下聚合48h；9、切片（先切厚片看看，以免重复切片，再切薄片）；10、染色：醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，双氧水漂洗1-2秒；（注意：染色期间不要说话，避免CO2造成切片污染）。

电镜使用方法说明书

电镜使用方法说明书注意：以下是电镜的使用方法说明书，请仔细阅读并按照指示进行操作。

一、产品介绍：电镜（Electron Microscope，简称EM）是一种利用电子束来增大样品特征的科学仪器。

它具有高分辨能力和放大倍数，可用于观察微观结构，广泛应用于材料科学、生物学等研究领域。

二、安全须知：在操作电镜前，请务必了解以下安全须知：1. 请确保仪器连接正确的电源，并接地，以避免电击和其他安全事故；2. 严禁在潮湿环境下使用电镜；3. 请佩戴防护眼镜，在操作过程中避免直接接触电镜等部件。

三、操作步骤：1. 打开电源开关，并确保连接到仪器的计算机已经启动；2. 调节透镜，使图像清晰可见；3. 将待观察的样品装载到样品台上，并固定好；4. 调节样品到最佳的焦距；5. 使用电镜软件进行图像采集和处理，可以根据需要更换不同的放大倍数；6. 观察完毕后，将样品从样品台上取下，并关闭电镜和计算机。

四、常见问题与解决方法：1. 图像模糊：请检查透镜是否调节到最佳焦距，或者更换更高品质的样品；2. 电源无法启动：请检查电源是否连接正常，并确保电源开关处于打开状态；3. 电脑无法识别电镜设备：请检查连接电脑的USB线缆是否插紧，并重启计算机。

五、维护与保养：1. 在使用完电镜后，切记关闭电源开关，并将电镜与计算机断开连接；2. 定期清理电镜表面的灰尘和污渍，可以使用干净的软布擦拭，避免使用化学溶剂；3. 若电镜出现故障，请及时联系专业人员进行维修。

六、附录：本使用方法说明书仅适用于常规电子显微镜的操作，若使用其他型号或有特殊要求，请参考相应的使用手册。

感谢您使用本电镜，希望本说明书能够帮助您顺利操作电镜，获取到准确的观察结果。

如有任何疑问或需要进一步帮助，请随时联系我们的客服。

祝您工作顺利！。

免疫电镜观察方法

免疫电镜观察方法
免疫电镜是一种结合了免疫学和电镜学的技术，用于观察细胞和组织中的特定蛋白质。

其主要步骤包括样品制备、抗体标记、电镜观察等。

样品制备包括固定、切片、染色等步骤。

固定方法根据不同的细胞和组织类型可以选择不同的固定剂，比如戊二醛、硫酸铜等。

切片和染色方法也会根据样品类型的不同而有所差异。

抗体标记是免疫电镜的关键步骤之一。

该步骤主要包括一次抗体和二次抗体标记。

一次抗体是用于识别目标蛋白的抗体，通常是从动物中提取的。

二次抗体是一种针对一次抗体的抗体，通常会被标记上金粒子等物质以便于观察。

电镜观察是最终的步骤，其中需要使用电子显微镜观察样品中的金粒子标记。

由于金粒子的直径很小，通常需要使用高分辨率的电子显微镜来观察。

观察时需要注意样品的厚度和金粒子的分布情况。

免疫电镜技术具有高分辨率、高灵敏度和高特异性的优点，可以在细胞和组织水平上观察蛋白质分布和亚细胞结构等信息，对研究细胞和组织功能及其相关疾病具有重要意义。

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透射电镜观察线粒体形态结构的检测方法

透射电镜观察线粒体形态结构的检测方法透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）是一种高分辨率的显微镜技术，能够观察细胞和细胞器的超微结构。

线粒体是细胞内的重要细胞器之一，具有双层膜结构、内部结构复杂的特点。

下面将介绍透射电镜观察线粒体形态结构的检测方法。

1. 样品制备：在透射电镜观察线粒体结构前，需要对样品进行制备。

通常可选用动物组织或细胞培养物作为观察对象。

制备样品时，可以选择冷冻切片法、固定切片法或原位切片法，具体方法根据研究目的和实验要求而定。

2. 组织固定和切片：固定切片法是常用的线粒体形态观察方法之一。

固定剂可选用2.5%的戊二醛或4%的Paraformaldehyde进行组织固定。

固定后，将组织或细胞进行脱水、浸渍和包埋等步骤，最终制备得到切片。

切片的厚度通常在40-60 nm之间，较薄的切片能够提供更高的分辨率。

3. 阴极溅射：为了提高观察效果，切片通常会被阴极喷镀金属薄层。

这一步骤称为阴极溅射，目的是增加切片的导电性，提高电子显微图像的对比度和分辨率。

4. 透射电镜观察和拍摄图片：将制备好的切片放入透射电镜的样品台中，透射电子束通过样品，形成具有高对比度的投射图片。

观察者可以通过目镜或摄像系统观察到由电子束击中样品后的散射电子形成的图像。

利用透射电镜的高分辨率特点，我们可以观察到线粒体的形态、双层膜结构以及内部结构，如内膜、外膜、基质、结构内的小体等。

5. 图像处理和分析：获得的TEM图像可以通过图像处理软件进行处理和分析。

可以使用软件测量线粒体的大小、形状、内膜的厚度、小体的分布和数量等参数。

同时，还可以进行三维重建，通过将多张切片图像进行叠加，得到线粒体的三维结构。

6. 结果分析和论述：通过透射电镜观察，我们可以了解线粒体的形态和结构，为深入研究线粒体的生理功能和病理变化提供重要的依据。

例如，我们可以观察到线粒体的肿胀或变形现象，内膜的断裂等。

细胞的固定方法有哪些

细胞的固定方法有哪些
细胞的固定方法有以下几种：
1. 急速冻固定法：将细胞迅速冷冻至极低温，使细胞结构不发生变化，常用于电镜观察。

2. 热固定法：将细胞置于80-90C的温度中进行固定，使细胞蛋白发生变性。

3. 醇固定法：使用醇固定剂（如乙醇、甲醇等）对细胞进行固定，可以保持细胞形态和某些细胞组分的活性。

4. 有机溶剂固定法：使用有机溶剂（如乙醚、醋酸等）对细胞进行固定，可以得到较好的细胞形态。

5. 酸性固定法：使用酸性溶液（如醋酸、甲酸、盐酸等）对细胞进行固定，可以保持细胞形态和结构。

6. 碱性固定法：使用碱性溶液（如NH4OH、NaOH等）对细胞进行固定，可以保持细胞核的形态。

7. 中性缓冲液固定法：使用中性缓冲液（如磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液等）对细胞进行固定，可以保持细胞形态和某些细胞组分的活性。

不同固定方法适用于不同的研究目的，选择适当的固定方法有助于保持细胞的形态、结构和功能。

细胞扫描电镜制样方法

细胞扫描电镜制样方法：
1.清洗：某些生物材料表面常附血液、细胞碎片、消化道内的食物残渣、细菌、淋巴
液及粘液等异物，掩盖着要观察的部位，因而，需要在固定之前用生理盐水或等渗缓冲液等把附着物清洗干净。

亦可用5%碳酸钠冲洗或酶消化法去除这些异物。

2.固定：通常采用醛类（主要是戊二醛和多聚甲醛）与四氧化锇双固定，也可用四氧
化锇单固定。

四氧化锇固定不仅可良好地保存组织细胞结构，而且能增加材料的导电性和二次电子产额，提高扫描电子显微图象的质量。

为增强这种效果，可用四氧化锇-单宁酸或是四氧化锇-珠叉二胼等反复处理材料，使其结合更多的重金属锇，这就是导电染色。

3.干燥：固定后通常采用临界点干燥法。

其原理是：适当选择温度和压力，使液体达
到临界状态(液态和气相间界面消失)，从而避免在干燥过程中由水的表面张力所造成的样品变形。

对含水生物材料直接进行临界点干燥时，水的临界温度和压力不能过高（37.4℃,218帕）。

通常用乙醇或丙酮等使材料脱水，再用一种中间介质，如醋酸戊酯，置换脱水剂，然后在临界点干燥器中用液体或固体二氧化碳、氟利昂13以及一氧化二氮等置换剂置换中间介质，进行临界干燥。

4.喷镀金属：将干燥的样品用导电性好的粘合剂或其他粘合剂粘在金属样品台上，然
后放在真空蒸发器中喷镀一层50～300埃厚的金属膜，以提高样品的导电性和二次电子产额，改善图象质量，并且防止样品受热和辐射损伤。

如果采用离子溅射镀膜机喷镀金属，可获得均匀的细颗粒薄金属镀层，提高扫描电子图象的质量。

电子显微镜使用方法说明书

电子显微镜使用方法说明书一、简介电子显微镜（Electron Microscope，简称EM）是一种利用电子束来观察样品细微结构的强大工具。

相比传统光学显微镜，电子显微镜具有更高的放大倍数和更好的分辨率。

本说明书旨在介绍电子显微镜的使用方法，包括仪器的操作流程、样品的制备及观察技巧等。

二、仪器操作步骤1. 准备工作在使用电子显微镜之前，确保仪器已经接通电源并处于稳定的工作状态。

检查真空系统是否正常运行，以确保样品在低压环境中观察。

2. 打开电子显微镜软件将电子显微镜软件（如FEI Amira）打开，并通过USB或网络连接与显微镜主机进行链接。

3. 加载样品将待观察的样品放置在样品台上，并固定好。

根据样品的特性以及观察目的，可进行一些必要的预处理，如切片、腐蚀、染色等。

4. 调整参数根据样品的特性及所需观察的细节，适当调整电子束的加速电压、束流强度以及焦点等参数。

通过直接调整软件界面上的相应滑块或输入框来实现。

5. 对焦和定位利用显微镜软件中的对焦功能，通过调节样品台的高度和微调焦距来使样品清晰可见。

此外，通过在显微镜软件中的光学影像观察界面，可对样品在显微镜视野中的位置进行微调。

6. 观察和记录在样品清晰可见且位于所需位置后，可以开始观察并获取所需图像。

可以通过调整对比度、亮度、缩放等参数来优化图像质量。

同时，可以通过显微镜软件进行图像的实时保存和记录。

三、样品制备技巧1. 样品选择根据所需观察的目的，选择与其性质和尺寸相适应的样品。

常见的样品包括金属、细菌、细胞、纤维等。

2. 样品固定根据样品的特性，采用合适的固定方法，例如冰冻法、固定液固定法等。

确保样品在固定过程中不会失去结构和形态。

3. 制备薄切片对于较大的样品，需要进行薄切片制备。

使用合适的切片工具，如超薄切片机，将样品切割成足够薄的切片，以便电子束穿透。

4. 表面处理对于某些样品，如纤维或材料表面，可能需要进行特殊的处理。

例如，可以采用金属镀膜技术来提高样品的导电性。

细菌及细胞电镜观察样品制备方法

细菌样品冷冻干燥制样方法
1) 取样：取大量样品离心（转速3000r~4000r），去除上清液，加入适当PH（7.2~7.4）的0.1 M PBS清洗三遍；清洗时菌体温柔悬浮。

2) 固定：2.5%戊二醛固定3h（此步时间非绝对，1~12h都可），用PBS清洗两遍，每遍10min。

再用纯水清洗两遍。

3) 梯度脱水：用乙醇的水溶液按30%、50%、70%、80%、90%的浓度梯度对样品进行脱水，每步15min，之后在100%乙醇的水溶液中脱水15min×2 次；再将样品置于乙醇和叔丁醇1:1混合液中15min；最后置样品于叔丁醇中15min×2次。

（此步也可以尝试不做）4) 冷冻干燥：滴加处理好的样品于5*5 mm的盖玻片上，置-80度冰箱冷冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。

5) 电镜观察：样品充分干燥后，进行扫描电镜观察。

电镜实验操作步骤

电镜实验操作步骤
一、样品准备
1. 选取具有代表性的样品，确保样品无污染或损坏。

2. 将样品切成薄片，厚度一般小于100纳米。

3. 用导电胶将样品固定在电镜的样品台上。

4. 如果样品不导电，需进行镀膜处理，以增加样品的导电性。

二、样品装载
1. 将样品台推入电镜的样品室。

2. 调整样品台的位置，使样品位于电镜的视场中心。

3. 关闭样品室，开始进行实验。

三、仪器校准
1. 开启电镜，进行预热和校准。

2. 根据实验需求，调整电镜的加速电压、分辨率等参数。

3. 对准样品，调整焦距，确保样品清晰。

四、样品观察
1. 观察样品的表面形貌和结构。

2. 根据观察结果，调整样品的倾斜角度和位置。

3. 记录观察到的图像和数据。

五、数据分析
1. 对观察到的图像进行定量和定性分析。

2. 根据分析结果，得出样品的物理和化学性质等信息。

3. 将分析结果整理成实验报告。

六、仪器维护
1. 在实验结束后，关闭电镜。

2. 对电镜进行清洁和维护，确保仪器的正常运行。

3. 定期对仪器进行检查和保养，确保仪器的稳定性和精度。

透射电镜组织处理

透射电镜组织处理
透射电镜（Transmission Electron Microscope，TEM）是一种高分辨率的显微镜，可以用于观察和分析材料的微观结构和成分。

在使用透射电镜进行样品观察之前，需要对样品进行适当的处理。

以下是透射电镜组织处理的一般步骤：
1. 固定样品：将要观察的组织样品进行固定处理。

常用的固定剂有醛固定剂，如戊二醛或葡萄糖醛固定剂。

固定的目的是停止细胞功能，保存细胞和组织的原貌。

2. 切片：将固定的样品块切割成非常薄的切片。

通常使用超薄切片机或者离心机来获得薄片。

厚度通常为50到100纳米左右，以保证透射电镜的有效穿透。

3. 染色：对切片进行染色以增强对细胞结构的观察。

常用的染色剂有重铀酸、铅酸等。

染色的目的是使细胞结构在电子束中的对比度增强。

4. 上膜：在切片的背面电镜网格上涂上薄膜，以便将切片固定在透射电镜的样品架上。

5. 透射电镜观察：将处理好的样品放置于透射电镜中观察。

通过调整电子束的聚焦和缩放，可以观察到组织和细胞的微观结构。

透射电镜组织处理的目的是保持样品的原始结构和形态，并使其适应电子束的穿透性观察。

注意，在进行透射电镜观察之前，样品必须成为极度干燥状态，因为电子束对水分很敏感。

通过透射电镜观察和分析组织样品，可以获得高分辨率和高对比度的图像，从而进一步了解组织和细胞的微观结构和功能组织。

这对于生物学研究、药物开发和疾病研究具有重要意义。

细胞电镜步骤

细胞电镜步骤一、引言细胞电镜（electron microscopy）是一种利用电子束代替光束进行显微观察的技术。

相比传统的光学显微镜，细胞电镜具有更高的分辨率和放大倍率，能够观察到更细微的细胞结构，为细胞学研究提供了重要的工具。

本文将介绍细胞电镜的主要步骤。

二、样品制备1. 固定要观察细胞的内部结构，首先需要将细胞固定在样品上。

常用的固定剂包括戊二醛、冰醋酸、乙醛等。

固定剂可以杀死细胞并保持其形态和结构。

2. 切片将固定的细胞组织进行切片，常用的切片工具有超薄切片机、刮刀等。

切片的厚度通常在50-100纳米之间。

3. 上膜将切片转移到铜或金网膜上，以便在电镜中观察。

上膜时需要小心操作，避免切片的损坏。

三、脱水和浸渍1. 脱水为了观察细胞的内部结构，需要将样品中的水分逐渐去除。

通常会使用一系列浓度递增的乙醇溶液进行脱水处理。

2. 浸渍脱水后，为了使样品能够在电镜中导电，并增加样品的稳定性，需要进行浸渍处理。

常用的浸渍剂有丙酮、环氧树脂等。

四、显微观察1. 扫描电镜（SEM）扫描电镜主要用于观察样品表面的形态结构。

在扫描电镜中，电子束通过扫描样品表面，与样品反射的二次电子或反射电子相互作用，形成图像。

通过调整电子束的扫描方式和参数，可以获得不同放大倍率和清晰度的图像。

2. 透射电镜（TEM）透射电镜主要用于观察样品的内部结构。

在透射电镜中，电子束穿过样品，与样品内部的结构相互作用，形成投影图像。

通过调整电子束的聚焦和对比度，可以获得高分辨率的细胞内部结构图像。

五、图像处理和分析1. 图像获取使用电镜观察样品后，需要将观察到的图像记录下来。

可以使用相机或数字图像采集系统将图像转换为数字信号，保存在计算机中。

2. 图像处理对于采集到的图像，可以使用图像处理软件进行处理和增强。

常见的处理方法包括去噪、增加对比度、调整亮度等。

3. 图像分析通过对处理后的图像进行分析，可以获取细胞内部结构的定量信息。

常见的分析方法包括测量细胞器的大小、计算细胞器的分布密度等。

电镜样本制备原理

电镜样本制备原理
1.固定：将取下的组织块及时投入
2.5%戊二醛固定液中，以固定细胞的形态。

这一步非常重要，因为固定液可以迅速凝固组织中的蛋白质和核酸，从而保持细胞的原有结构和功能。

2.脱水：将固定好的组织块进行脱水处理，通常使用乙醇或丙酮进行脱水。

脱水可以使组织块变硬，以便于进行后续的包埋和切片操作。

3.包埋：将脱水后的组织块放入包埋剂中，经过加热等处理后，使包埋剂凝固，将组织块固定在其中。

包埋剂的硬度适中，可以确保切片时能够切出较薄的样品。

4.切片：使用超薄切片机将包埋的组织块切成薄片，通常厚度在40-50纳米之间。

切片的厚度和质量对于后续的观察和鉴定非常重要，因此需要非常精细的操作。

5.染色：将切好的薄片放在载玻片上，用染色液进行染色，以增强细胞的对比度和结构细节的可见度。

这一步是为了使细胞的结构更加清晰，以便于在电镜下观察。

6.电镜观察：将染色后的薄片放入电镜中观察，可以使用透射电镜或扫描电镜进行观察。

在电镜下，可以观察到细胞的超微结构和细节，如细胞膜、细胞器、细胞核等。

总的来说，电镜样本制备原理需要经过多个步骤，每个步骤都需要严格的操作和质量控制，以确保最终观察到的细胞结构和功能的准确性。

电子显微镜使用方法

五、电镜标本制作方法电镜标本用于观察组织细胞的超微结构。

扫描电镜用于细胞表面的观察，透射电镜用于细胞内部结构的观察。

现以透射电镜标本的制作为例作简要介绍：(一)取材标本的新鲜程度要求高于光镜标本，组织块小于lmm3。

(二)固定常用的固定液有2．5％戊二醛磷酸缓冲液和1％锇酸。

这些液体穿透力较强，能稳定和保存细胞内的结构。

固定温度应控制在0～4℃，固定时间1~2小时。

(三)冲洗冲洗液由0．2mol／L磷酸缓冲液(pH7.2)与双蒸水等量混合配成。

冲洗组织块2次．间隔15分钟。

(四)脱水脱水剂多采用浓度递增的酒精和丙酮，从50％70％90％酒精1/2 90％酒精+1/2 90％丙酮混合液90％丙酮(以上步骤均在0~4℃冰箱中进行) 100％丙酮，间隔10~15分钟。

(五)包埋包埋剂为环氧树脂618或812和固化剂十二碳烯基丁二酸酐(简称DD-SA)，加入适量增塑剂苯甲酸二丁酯(简称DDP)。

为了使反应速度增快，可加入加速剂2，4，6-三[(二甲氨基)甲基]苯酚(简称DMP-30)。

包埋剂配方：环氧树脂618或812 60％DDSA 40％DBP 3％DMP-30 1％上述试剂依次加入，边加边搅拌，全部加完后再充分搅拌10～15分钟，静置于35~40℃温箱内排出气泡。

包埋前组织块必须浸透，入无水丙酮加等体积包埋剂室温3小时，纯包埋剂37℃2小时。

包埋时先将纯包埋剂倒入胶囊或含硅胶的包埋槽内，置入组织块。

包埋后在60C温箱中烘2～3天后硬化成块，即可剥去胶囊或包埋槽。

(六)将组织块修成塔形，尖端面积为0.2mm×0.3mm左右，用超薄切片机切成50mm厚的超薄切片，再置于铜网上。

(七)染色常用的染液有1~2％醋酸铀和枸橼酸铅。

醋酸铀染色是在组织块进行脱水过程中进行的，而枸橼酸铅染色则多用于片染。

最后，将载有切片的铜网置于透射电镜内观察和摄影。

由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。

电镜的使用方法和操作注意事项

电镜的使用方法和操作注意事项简介：电子显微镜（Electron Microscope）是一种利用电子束来观察非常微小的物体的仪器。

相比传统光学显微镜，电子显微镜能够提供更高的分辨率和放大倍数，从而帮助科学家们深入研究微观世界。

本文将介绍电子显微镜的使用方法和操作注意事项。

一、准备工作使用电子显微镜前，需要先进行一些准备工作，包括：1. 清洁环境：确保工作环境干净，避免灰尘等杂质影响观察。

2. 检查设备：检查电子显微镜的各个部件是否正常，包括电源、电子枪、透镜等。

3. 样品准备：根据需要观察的样品类型，进行处理和制备。

样品应尽量薄而均匀。

二、电子显微镜的操作步骤1. 打开电子显微镜：按照设备说明书操作，先打开电源，然后打开真空系统。

等待真空度达到要求后，再打开主机。

2. 调节亮度和对比度：根据实际需要，调节显微镜的亮度和对比度，确保得到清晰的图像。

3. 调整对焦：利用透镜系统，将样品调焦到最佳清晰度。

可以通过调节近缘或远缘对焦量来实现。

4. 镜头放大：逐渐调节电子显微镜的放大倍数，观察到所需的细节。

过高的放大倍数可能导致图像模糊。

5. 录制图像：根据需要，可以使用电子显微镜自带的摄像装置或其他设备，录制图像或视频。

注意保存图像时使用合适的格式和分辨率。

三、操作注意事项1. 注意安全：在操作电子显微镜过程中，要注意安全。

避免触碰或损坏设备，接触高压部件或电子束。

尽量避免直接观察有毒、放射性或易爆物质。

2. 避免过度曝光：电子显微镜中的电子束具有高能量，过度曝光可能对样品产生热损伤。

因此，在观察过程中要遵循适当的电子束能量和照射时间，以保护样品的完整性。

3. 适当调整对比度：过高或过低的对比度可能会对观察产生负面影响。

调整对比度时要小心谨慎，确保观察到的图像清晰而真实。

4. 保持环境稳定：电子显微镜对环境要求高，尽量避免振动和温度变化。

同时，也要注意避免环境中的静电干扰，以保证稳定的观察效果。

5. 调节焦距时小心操作：在调节焦距时，要小心操作，避免碰撞透镜，以免损坏设备。

扫描电镜制样及观察

扫描电镜1.固定：用2.5%（动物）或4%（植物）戊二醛固定液于4℃下固定6h以上（昆虫样也可以：选用卡诺固定液固定12h保存于70%酒精或波恩式固定液固定4-24h），然后转到70%酒精的标本，在解剖镜下解剖，得到自己所要观察的结构。

注：如材料中有空气不能沉入固定液时，则在真空泵下抽气至样品沉入瓶底。

2.清洗：PBS(0.1mol/L磷酸缓冲液)漂洗三次，每次5-10min (视材料的厚薄而定)。

依据研究部位、结构的不同在用超声波清洗仪中清洗，一般20s-10 min 不等。

PBS漂洗的目的是洗去残留的戊二醛，防止戊二醛的存在与下一步的俄酸固定液发生反应而影响固定效果。

3.后固定：在用1%锇酸固定2小时（需放入4℃冰箱中）（此步可以省略。

）。

4.清洗：如果用锇酸固定了，就要用PBS漂洗三次，每次5-10min。

5.脱水和酒精：在10％、30%、50％、70％、80％、90％、95％的酒精浓度梯度液中逐级脱水各10-20 min，100％两次，每次20-30 min（可保存于70%酒精过夜）；在25％、50％、75％叔丁醇浓度梯度液中逐级脱酒精各15min （叔丁醇浓度梯度：无水酒精和叔丁醇体积比是3:1；1:1；1:3，目的是脱酒精），纯叔丁醇30-40 min。

6.冷冻干燥：纯叔丁醇加入放有样品的样品仓，注意加入纯叔丁醇要没过样品，干燥约3h。

7.粘台：将干燥后的样品利用双面导电胶在显微镜下粘到样品台上。

8.喷金：在真空喷涂仪内喷金。

9.观察与照相：在S-3400N型电子显微镜（加速电压5-15KV）下观察并数码拍照。

注意：1）卡诺氏固定液(Carnoy's Fluid)：配方（v/v）：3份无水酒精：1份冰醋酸适用于一般植物组织和细胞的固定，常用于根尖，花药压片及子房石蜡切片等。

有极快的渗透力，根尖材料固定15-20min即可，花药则需1h左右，此液固定最多不超过24h，固定后用95%酒精冲洗至不含冰醋酸为止；如果材料不马上用，需转入70%酒精中保存。

透射电镜组织处理

透射电镜组织处理
透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）是一种强大的显微镜技术，可以对材料的内部结构和组织进行高分辨率的观察。

为了进行透射电镜观察，材料通常需要经过一系列处理步骤以准备样品。

下面是一般的透射电镜组织处理步骤：
1.采样和切片：从原始材料中采集要观察的样品，并使用显
微切割机或离心切片机将样品切片成适当的厚度（通常是
几十到几百纳米）。

2.修剪和固定：根据需要，选择感兴趣的样品区域，修剪并
将其固定在载玻片或网状膜上，以便在电镜中进行观察。

3.固定剂处理：为了保持样品的原始结构和形态，通常使用
特定的固定剂处理样品。

例如，常用的固定剂有冷冻醇、
蛋白质交联剂（如缩醛或戊二醛）等。

4.重金属染色：为增加样品的对比度，某些样品可能需要进
行染色处理。

重金属染色剂（如铀酸或铋酸）通常用于染
色，以增强电子束与样品的相互作用。

5.脱水和浸透：为了进一步固化样品并保持其结构，通常使
用乙醇或丙酮等有机溶剂进行脱水处理，并使用一些合适
的浸透剂（如酮树脂或环氧树脂）浸透样品。

6.切片和显影：将浸透好的样品切成适当的薄片（通常是50
至100纳米），并使用硝酸铋等显影剂处理样品，以增强
对比度。

7.观察：将处理好的样品放入透射电镜中，利用电子束穿过
样品观察样品的内部结构和组织。

需要注意的是，透射电镜组织处理的具体步骤和条件可能会根据不同的样品类型和目的而有所不同。

扫描电子显微镜常规制样技术取材与固定

扫描电子显微镜常规制样技术的取材与固定扫描电镜在生物医学中主要被用于观察样品的表面结构。

根据扫描电镜的工作原理，要求被观察的样品干燥，并具有较高的二次信息发射率和良好的导电性、导热性。

在扫描电镜生物样品制备过程中，除表面比较坚硬的组织（如骨骼、牙齿、指甲、毛发等）和需要采用某些特殊制备技术的样品（如管道铸型等）以外，一般生物组织均需经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本程序处理以后，才能进行SEM观察。

取材：扫描电镜观察的是样品表面的结构，在取材时要注意避免挤压损伤、避免外力对观察面的损伤和破坏，这是整个样品制备过程中的关键步骤之一。

其主要要求有以下几点：1.取材前应作好准备，包括药品、器材和根据实验的目的与需要制定的取材方案等。

每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间，影响制样效果。

2.取材部位要准确，相互对照的样品尽可能取同一部位。

取材大小要适当，以观察表面结构为主的样品可以大一些，其直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间；以观察内部结构为主的样品，其直径应小于2mm，高度可在3mm左右。

为了提高后续步骤的效果，在满足所需观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。

3.为了使被观察的样品更接近于活体状态，材料应尽量新鲜。

取材用的刀片要锋利，同时应作好对样品观察面的标记。

关于生物样品（主要指组织细胞）取材的具体方法，与一般透射电镜超薄切片法基本相同；组织离体前在玻璃平皿内放入冰块。

冰块上放一牙科蜡板（或软塑料板），并在蜡板上滴加少量组织固定液。

组织离体后，不需特殊清洗者应立即将样品放入上述蜡板固定液内，用锋利的刮脸刀片将样品修成所需大小需要清洗的样品。

则经清洗以后再按上述方法修块。

清洗扫描电镜的样品，对其表面的清洁度要求十分严格。

在整个制样过程中，应始终注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片及药物反应沉淀物等所造成的污染。

若不将这些物质去掉，所需要的观察面就无法暴露，不仅会掩盖表面的微细结构，甚至会得出错误的结果和判断。