生化实验

八、蔗糖酶米氏常数的测定的原理
米氏常数Km等于酶反应速度达最大反应速度一半时的底物浓 米氏常数Km等于酶反应速度达最大反应速度一半时的底物浓 Km 单位是mol/L 对于某一种特定的酶，在特定的反应条件下， 度，单位是mol/L 。对于某一种特定的酶，在特定的反应条件下， 对应任何一种底物（如果它具有多个底物），它的米氏常数Km ），它的米氏常数Km是 对应任何一种底物（如果它具有多个底物），它的米氏常数Km是 一个定值。在一个反应中，底物的浓度（ 是可以控制的， 一个定值。在一个反应中，底物的浓度（S）是可以控制的，反应 的速度（ 可以测出， 的速度（V）可以测出，这样就可根据底物的浓度和反应的速度求 出该酶在本实验条件下的米氏常数。 出该酶在本实验条件下的米氏常数。通常可以通过以下几种方法 求出Km Km值 求出Km值： 直接将数据代入米氏方程。 1）直接将数据代入米氏方程。 Lineweaver-Burk双倒数作图法 本实验采用该法）， 双倒数作图法（ ），横轴的 2）Lineweaver-Burk双倒数作图法（本实验采用该法），横轴的 截距为： 1/Km。 截距为：-1/Km。 Hanes-Woolf作图法 横轴的截距为： Km。 作图法， 3）Hanes-Woolf作图法，横轴的截距为：-Km。 Woolf-Anguseinsson-Hoftee作图法 斜率为： Km。 作图法， 4）Woolf-Anguseinsson-Hoftee作图法，斜率为：-Km。 Eadie-Scatchard作图法 斜率为作图法， 5）Eadie-Scatchard作图法，斜率为-1/Km
强碱性溶液中 DNS试剂 试剂+ 2）DNS试剂+ D-葡萄糖 氨基化合物 沸水浴中
五、有机溶剂分级沉淀的原理： 有机溶剂分级沉淀的原理：
有机溶剂分级是利用不同Pr在不同浓度的有 有机溶剂分级是利用不同 在不同浓度的有 机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。 机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。 其原理是： 其原理是： 1）有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加 分 ）有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加Pr分 子上不同 电荷的引力，使蛋白质的溶解度下降； 电荷的引力，使蛋白质的溶解度下降； 2）有机溶剂与水作用，能破坏 的水化膜，使 的水化膜， ）有机溶剂与水作用，能破坏Pr的水化膜 蛋白质的溶解度下降。 蛋白质的溶解度下降。
蔗糖酶基本性质： 二、蔗糖酶基本性质：
大多数植物含有至少2 种液胞型蔗糖酶， 大多数植物含有至少 2 种液胞型蔗糖酶 ， 它们均以可溶性单摆的形式存在。 它们均以可溶性单摆的形式存在 。而细胞壁型 蔗糖酶则以粒子的形式与细胞壁结合， 蔗糖酶则以粒子的形式与细胞壁结合，并有多 种同工酶存在， 种同工酶存在 ， 液胞型和细胞壁型蔗糖酶在 pH4 时效率最高， pH4.5至5.0时效率最高，且从果糖残基攻击蔗 因而这类酸性蔗糖酶被称作β 糖 ， 因而这类酸性蔗糖酶被称作 β - 呋喃果糖 苷酶，也正因为如此， 苷酶 ，也正因为如此， 酸性蔗糖酶也可催化其 他含有β 果糖的多糖， 例如水苏糖、 他含有 β - 果糖的多糖 ， 例如水苏糖 、 棉子糖 的水解。 的水解。目前已从多种植物中分离出酸性蔗糖 成熟多肽的分子量大多在55 70kD之间。 kD之间 酶 ， 成熟多肽的分子量大多在 55 ～ 70 kD 之间 。
蔗糖酶的分类： 一、蔗糖酶的分类：
根据植物中蔗糖酶所处亚细胞位置， 根据植物中蔗糖酶所处亚细胞位置 ， 蔗糖酶可 分为液胞型蔗糖酶 细胞质型蔗糖酶和 液胞型蔗糖酶、 分为 液胞型蔗糖酶 、 细胞质型蔗糖酶 和 细胞壁型蔗 糖酶。 前两者又统称为为胞内蔗糖酶 胞内蔗糖酶， 糖酶 。 前两者又统称为为 胞内蔗糖酶 ， 细胞壁型蔗 糖酶又被称为胞外蔗糖酶 胞外蔗糖酶。 糖酶又被称为 胞外蔗糖酶 。 不同的蔗糖酶进行反应 所需的最适pH值也有所不同， pH值也有所不同 所需的最适 pH 值也有所不同 ， 由此蔗糖酶有可分为 酸性蔗糖酶和中性/碱性蔗糖酶。 酸性蔗糖酶和中性/碱性蔗糖酶。液胞型蔗糖酶和细 胞壁型蔗糖酶在pH pH4 时催化效率最高， 胞壁型蔗糖酶在 pH 4 . 5 至 5 . 0 时催化效率最高 ， 因此 也称为酸性蔗糖酶。 也称为酸性蔗糖酶 。 细胞质型蔗糖酶水解蔗糖的最 pH值为中性或略微偏碱性 因此称为中性/ 值为中性或略微偏碱性， 适pH值为中性或略微偏碱性，因此称为中性/碱性蔗 糖酶。 而根据起溶解性， 蔗糖酶又可分为可溶性蔗 糖酶 。 而根据起溶解性 ， 蔗糖酶又可分为 可溶性蔗 糖酶（ 包括液胞型蔗糖酶和细胞质型蔗糖酶） 糖酶 （ 包括液胞型蔗糖酶和细胞质型蔗糖酶 ） 与 非 溶 性 蔗 糖 酶 （ 细 胞 壁 型 蔗 糖 酶 ） 。
四、蔗糖酶活力测定的原理： 蔗糖酶活力测定的原理：
1）蔗糖酶催化的反应：蔗糖 蔗糖酶催化的反应： D-果糖+D-葡萄糖 果糖+ 葡萄糖
棕红色） （还原糖） 还原糖） （棕红色） 还原糖的量与反应液的颜色强度 在一定范围内还原糖 3）在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度 成一定比例关系，可用于比色测定， 成一定比例关系，可用于比色测定，所以可用 DNS比色法测定还原糖的含量 比色法测定还原糖的含量（ DNS比色法测定还原糖的含量（该方法是半微 量定糖法，操作简便、快捷、杂质干扰少）， 量定糖法，操作简便、快捷、杂质干扰少）， 可用DNS比色定糖法测定蔗糖酶的活力。 DNS比色定糖法测定蔗糖酶的活力 可用DNS比色定糖法测定蔗糖酶的活力。
（一）、蔗糖酶的介绍 ）、蔗糖酶的介绍
蔗糖酶
又称“转化酶” 糖苷酶之一。 又称“转化酶”。糖苷酶之一。催化 蔗糖水解成为果糖和葡萄糖的一种酶， 蔗糖水解成为果糖和葡萄糖的一种酶， 广泛存在于动植物和微生物中， 广泛存在于动植物和微生物中，主要从 酵母中得到。 酵母中得到。 蔗糖酶（invertase）（ ）（β 蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃 果糖苷水解酶）（ ）（fructofuranoside 果糖苷水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特 fructohydrolase）（EC.3.2.1.26） ）（EC.3.2.1.26 异地催化非还原糖中的β 异地催化非还原糖中的β-D-呋喃果糖苷 键水解， 键水解，具有相对专一性具有相对专一 性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和 果糖，也能催化棉子糖水解， 果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二 糖和果糖。 糖和果糖。
三、蔗糖酶的功能: 蔗糖酶的功能:
1、对植物生长的调控 蔗糖酶把蔗糖水解为己糖，提供给呼吸消耗， 蔗糖酶把蔗糖水解为己糖，提供给呼吸消耗，或者作为碳源 及能源合成许多其他化合物。 及能源合成许多其他化合物。蔗糖酶可以在韧皮部参与蔗糖 的长距离运输。另外， 的长距离运输。另外，蔗糖酶把蔗糖分解为葡萄糖和果糖可 以大大地增加细胞渗透压， 以大大地增加细胞渗透压，表明蔗糖可能在细胞伸长和植物 生长中起作用。 生长中起作用。蔗糖酶对逆境条件下维持细胞的正常功能也 起一定作用。 起一定作用。 2、对源-库关系的调控 对源酸性蔗糖酶在调控源—库关系方面所起的调控作用已通过分 酸性蔗糖酶在调控源 库关系方面所起的调控作用已通过分 子操纵技术在模式植物，如烟草、拟南芥、马铃薯、 子操纵技术在模式植物，如烟草、拟南芥、马铃薯、番茄中 得到证实。 得到证实。 3、对蔗糖在库中分配的调控
（二）、实验原理
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质， 1、酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构 和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。 酶分离提纯的总目标是提高纯度（ 或比活力） 及收率； 2 、 酶分离提纯的总目标是提高纯度 （ 或比活力 ） 及收率 ； 依据在溶液中的性质（分子大小、溶解度、电荷、吸附等） 依据在溶液中的性质（分子大小、溶解度、电荷、吸附等） 进行分离; 胞内酶的分离提纯步骤：选材、破壁、提取、 进行分离; 胞内酶的分离提纯步骤：选材、破壁、提取、 分离、纯化、测活、保存； 分离、纯化、测活、保存；用测定酶活力的方法跟踪酶的 去 向 、 衡 量 酶 提 纯 的 程 度 和 得 率 。 酶促反应的动力学（ 反应速度及影响因素） 3 、 酶促反应的动力学 （ 反应速度及影响因素 ） : 1 ） 底物浓 度对酶促反应速度的影响 2）酶浓度对酶促反应速度的影 pH值对酶促反应速度的影响 响 3）pH值对酶促反应速度的影响 4）温度对酶促反应速 激活剂、 抑制剂对酶促反应速度的影响. 度的影响 5 ） 激活剂 、 抑制剂对酶促反应速度的影响 .
一、蔗糖酶分离提取的原理：
细胞破壁：就没在生物体内的分布， 细胞破壁：就没在生物体内的分布， 可分为胞内酶和胞外酶， 可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系 胞内酶。提取胞内酶时， 胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组 织和细胞，然后用一定的溶液提取， 织和细胞，然后用一定的溶液提取， 得到的材料称为无细胞抽取液。 得到的材料称为无细胞抽取液。材 料不同，破壁方法也不同。 料不同，破壁方法也不同。
六、离子交换柱层析的原理： 离子交换柱层析的原理：
是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异， 是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其 分离的技术。在分离过程中，以离子交换作用为主导； 分离的技术。在分离过程中，以离子交换作用为主导； 在众多的交换剂中，离子交换纤维素的优点是： 在众多的交换剂中，离子交换纤维素的优点是： 有开放性的长链结构、较大的表面积，所以对Pr 1）有开放性的长链结构、较大的表面积，所以对Pr 的吸附容量大； 的吸附容量大； 纤维素上离子基团的数量不多且排列疏散， 2）纤维素上离子基团的数量不多且排列疏散，对 Pr的吸附不是太牢固 的吸附不是太牢固， Pr的吸附不是太牢固，所以用缓和的洗脱条件即 可达到分离的目的，不致引起Pr的变性； Pr的变性 可达到分离的目的，不致引起Pr的变性； 用其装好的层析柱在较广的pH pH和盐浓度范围内都 3）用其装好的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都 不会发生体积的改变，所以有利于Pr的层析。 Pr的层析 不会发生体积的改变，所以有利于Pr的层析。