双启动子调控的条件复制腺病毒制备及其体外抑瘤作用

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生物药物名词解释

1.生物药物：泛指包括生物制品在内的生物体的初级和次极代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗疾病的医药品，生物制品用基因工程、细胞工程、发酵工程等生物学技术制成的免疫制剂或有生物活性的制剂。

可用于疾病的预防、诊断和治疗。

2.生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。

3.生物技术药物：采用DNA重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质（包括治疗性抗体等）或核酸类药物。

4.生物技术：以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（品系）进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。

5.血液：是一种流动性结缔组织，循环于心血管系统内，它将身体必须的营养物质和氧气输送到各个器官、组织和细胞；同时将机体不需要的代谢产物运送到排泄器官。

血液还对入侵的微生物、病毒、寄生虫等，以及其它有害物质发生反应，保护机体免遭损害；血液是体液的一个重要组成部分，在维持机体内环境相对稳定方面起着重要的作用6.体液：人体内含有大量液体，包括水分和其中溶解的物质，成人，约占体重的60%，总称为体液。

体液三分之二在细胞内，三分之一在细胞外，存在于血管内的血浆、淋巴管内的淋巴液、细胞间隙的和组织7 天然药物化学：是运用现代科学理论和方法研究天然药物中的化学成分及其生理功能的一门科学。

内容包括各类天然药物的化学成分、结构特征、性质、提取和分离方法、结构鉴定及生理活性等的研究。

主要研究内容是植物中的天然有机化合物的分离提纯、结构鉴定、构效关系7.基因工程技术：是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术8.下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，为获得高质量、高产量的表达产物，需对影响表达及分离纯化的因素进行分析（如新型生物反应器、高效分离介质及装置、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术等）9.上游阶段：在实验室完成，获得目的基因后，用限制性内切酶和连接酶将目的基因插入载体，并转入宿主菌10.逆转录法：是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA，然后进行互补DNA的克隆表达。

双调控溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤EJ细胞的杀伤作用

・９・
双调控溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤ＥＪ细胞的杀伤作用
陈波，史振铎，邱祥政，韩从辉
（东南大学医学院附属徐州医院泌尿外科，江苏徐州２２１００９）
［摘要］目的：构建由人端粒酶启动子（ｈＴＥＲＴ）和缺氧诱导因子启动子（ＨＩＦ）双向调控的携带ＳＥＡ基因的选择性增殖腺病毒，体外试验其对肿瘤的杀伤功能。方法：将ｈＴＥＲＴ和ＨＩＦ分别酶切、连接在缺陷型腺病毒的穿梭质粒的Ｅ１Ａ和Ｅ１Ｂ序列前，调控Ｅ１Ａ和Ｅ１Ｂ蛋白的表达，共同转染人胚肾２９３细胞进行同源重组，获得双调控选择性复制性腺病毒，进行ＰＣＲ鉴定。获取病毒转染膀胱肿瘤细胞ＥＪ，ＭｑＴ检测细胞存活和生长情况。结果：淋巴细胞与肿瘤细胞共培养１２、２４、４８ｈ，实验组肿瘤细胞明显少于对照组；ＭｑＴ检测实验组在１２、２４、４８ｈ活细胞数低于对照组。结论：成功构建了携带ＳＥＡ基因的选择性腺病毒，且其可表达目的基因，对膀胱肿瘤细胞有一定的杀伤作用。
ｐｌａｓｍｉｄｏｆｔｈｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ — ｄｅｉｆｃｉｅｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｔｈａｔｅｎｃｏｄｅｓＥ１Ａ／Ｅ１Ｂｓｅｑｕｅｎｃｅｔｏｒｅｕｌｇａｔｅｔｈｅｉｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ．Ｔｈｅｙ
东南大学学
ＪＳｏｕｔｈｅａｓｔＵｎｉｖ嚣（Ｍｅｄ医Ｓｃ学ｉＥ版ｄｉ｛）２ …。０１４＇ ’ Ｆ … ｅｂ； ’ ３３（１）：９－１一１

病毒转基因技术原理腺相关病毒

―采用重组杆状病毒表达系统 BEVSbaculovirusexpressionve ctorsystem,提供三种成分并感染昆虫细胞或利用包含cap和 rep的稳定包装昆虫细胞系； ―包含cap和rep的稳定包装哺乳动物细胞系,并通过感染AdV 提供辅助功能； ―利用哺乳动物细胞系和重组 HSV-1提供cap和rep,rAAV和辅助功能,
病毒转基因技术原理腺相关病毒
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第一节腺相关病毒简介
l生物学特性 l致病性与免疫性
第一部分生物学特性
l血清型 l病毒结构 l病毒复制 l对理化因素的抵抗力
血清型
lAAV是从腺病毒的污染物1965年、人群或非人灵长类动物等的组织中分离鉴定到的, l共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株variants， l通过签名PCRsignaturePCR技术,利用高度保守序列扩增Cap 基因的一小段可变区的DNA序列,以筛检是否是新的AAV分离株,然后利用PCR技术获得新的AAV分离株的Cap或和Rep基因的全长序列，在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵羊、山羊和蛇等的不同组织器官,发现了大量的具有多样性的 AAV的基因组，但新分离的病毒株,尚未进行血清学分型,通称为变株， lAAV不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守,与AAV-2 型较为类似,不同血清型的衣壳蛋白结构中表位的差异， 50~80%AAV-2抗体在人群中检测出，
第二节腺相关病毒载体转基因技术原理
l蛋白表达型腺相关病毒载体
―三成分包装系统 ―自我互补型AAV载体self-complementaryAAVvector,scAAV l基―因打反靶式型剪腺接相型关A病AV毒载载体体trans-splicingAAVvector,tsAAV lrA―AV衣的壳纯蛋化和白定修量饰型AAV载体

腺病毒载体构建的基本原理与应用

腺病毒载体构建的基本原理与应用1. 简介腺病毒（Adenovirus）是一类非常常见的病毒，它可引起呼吸道、眼部和肠道感染等问题。

在基因工程领域，腺病毒被广泛应用作为基因传递载体。

通过对腺病毒进行适当的改造，可以将外源基因有效地传递到目标细胞中，并实现基因的高表达。

本文将介绍腺病毒载体构建的基本原理以及其在实际应用中的主要用途。

2. 腺病毒载体构建的基本原理腺病毒载体构建的基本原理主要包括以下几个步骤：2.1 选择适当的腺病毒亚型腺病毒有多个亚型，其中最常用的是腺病毒2（Ad2）和腺病毒5（Ad5）。

选择适当的腺病毒亚型取决于目标细胞的特点以及需要传递的基因。

2.2 构建质粒载体构建质粒载体是腺病毒载体构建的第一步。

质粒载体通常由多个部分组成，包括腺病毒的核心序列、外源基因表达的启动子和终止子等。

通过合成或PCR扩增等方法，可以将这些部分组装到一起构建质粒载体。

2.3 建立包装细胞系在构建过程中，需要建立一个能够产生包装腺病毒的细胞系。

这些细胞系通常包括两种类型的细胞：一种是质粒携带者，将质粒转染进细胞内；另一种是包装细胞，它们能够提供所需的腺病毒包装蛋白和其他辅助蛋白。

2.4 转染质粒载体将质粒载体转染到包装细胞系中，使其进入细胞内。

转染的方法可以采用常规的化学方法，如钙磷共沉淀法或使用商业化学试剂。

2.5 腺病毒产生与包装质粒载体进入到包装细胞中后，通过转染和转座等过程，腺病毒基因组会产生复制和转录。

最终，腺病毒包装蛋白和基因组会组装成腺病毒颗粒，从而完成腺病毒载体的构建。

3. 腺病毒载体的应用腺病毒载体在基因治疗、疫苗开发、基因功能研究等方面具有广泛的应用。

以下是腺病毒载体的主要应用领域的列点介绍：•基因治疗：腺病毒载体可以用于治疗多种遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜疾病等。

通过将治疗基因成功地传递到患者细胞中，可以恢复或增强正常基因的功能，从而治疗相关疾病。

•疫苗开发：腺病毒载体在疫苗开发中具有重要的作用。

腺病毒质粒载体的构建及表达调控机制研究

腺病毒质粒载体的构建及表达调控机制研究第一章引言腺病毒是一种广泛应用于基因治疗和基因表达的载体，由于其病毒自身不具有致病性，可以更安全地应用于临床治疗和药物研发。

腺病毒载体的构建和表达调控机制的研究是基因治疗和药物研发领域的热点问题。

本文将从腺病毒质粒载体的构建方法、载体的表达调控机制、及应用前景等方面进行探讨。

第二章腺病毒质粒载体的构建方法腺病毒的质粒载体构建需要遵循一定的规律和原则，以确保载体的高效性和稳定性。

现将常用的腺病毒质粒载体构建方法进行简要介绍：2.1 插入式构建法插入式构建法是最常用的构建方法之一，其基本原理是将外源基因片段插入到腺病毒质粒载体中，再通过体外转染等方法将整个质粒导入到细胞内进行转染。

插入式构建法具有构建简便、转染效能高、适用性强等优点。

但由于插入的外源基因片段较长且载体承载能力有限，仅适用于小分子基因的插入。

2.2 重组式质粒构建法重组式质粒构建法是从腺病毒DNA中特异性截取相应序列，并将其与外源基因片段重组形成新的质粒载体。

重组式质粒构建法具有高效性、稳定性等优点，能够承载大分子基因片段的插入。

但构建难度较大，需要较为专业的技术支持。

2.3 克隆式质粒构建法克隆式质粒构建法是将腺病毒基因组进行克隆，这种方法能够在保持病毒活性的前提下获得高效的转染效果和稳定性。

克隆式质粒构建法适用于需要经常进行高效转染以及灭活性病毒的构建，但需要高超的实验技能和完善的实验设备。

第三章腺病毒质粒载体的表达调控机制腺病毒质粒载体的表达调控机制是基因治疗和药物研发领域的重要问题之一。

本章将从内在调节和外部控制两个方面进行介绍。

3.1 内在调节内在调节是指在腺病毒质粒载体表达阶段，利用载体本身的启动子、基因调节元件等进行调节。

常用的内在调节方法有以下几种：3.1.1 CMV启动子调节CMV启动子是最常见的内在调节方法之一，其具有高效性、稳定性等优点。

CMV启动子能够在典型的哺乳动物细胞中发挥优异的表达效果，并能够适应细胞类型、转染条件等变化。

名词解释(分子生物学)

9.基因工程：按照人为预愿获得目的基因，与载体拼接形成重组体，重组体转入宿主细胞，筛选和鉴定出含阳性重组体宿主细胞，经大量增殖，最总获得该目的基因决定的大量表达产物的过程。
10.同源重组（homologousrecombination）：发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换，又称基因重组。
27.探针（probe）：带有特殊可检测标记的核酸片段，具有特定序列，能够与待测的核酸片段互补结合，用于检测核酸样品中存在的特定基因。
28.PCR（聚合酶链反应）:利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过高温变性—低温退火—适温延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。
29.基因芯片（gene chip）：将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的监测分析，即可得出样品遗传物质。
名词解释
1.操纵子（operon）：是真核生物基因的一个基本转录单位，由编码序列及上游的调控序列组成。编码序列通常包括几个功能相关的结构基因，调控序列由启动序列（启动子），操纵序列（操纵基因）及其他调节序列构成。
2.顺式作用元件（cis-acting element）：是真核基因表达是调控转录过程的特殊DNA序列，以转录因子结合而起作用，通常包括启动子，增强子，沉默子等。
25.生长因子（growth factor）：指存在于血清中，通过质膜上特异的受体，将信息传递至细胞内部，调节细胞生长与增殖的多肽类物质。
26.核酸分子杂交：在DNA复制过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链。

癌基因、抑癌基因、生长因子

癌基因、抑癌基因和生长因子肿瘤的发生是由于细胞的增殖与分化失常所导致的恶性生长现象。

在正常情况下，细胞的增殖受到多种因素的调控，调控失衡可能引起异常的增殖和持续的分裂。

细胞的正常生长与增殖是由两大类基因来调控的，一类是正调节信号，促进细胞生长和增殖，并阻止其发生终未分化，调控失常时表现为肿瘤细胞的恶性生长，现已知多数癌基因（oncogene）起这一作用；另一类为负调节信号，抑制增殖，促进分化、成熟和衰老，最后调亡（apoptosis），抑癌基因（ancer suppressive gene，anti-oncogene）则在这方面发挥作用。

当这两类信号在细胞内产生的效应相互拮抗，维持平衡，对正常细胞的生长、增殖和衰亡进行精确地调控。

当这两类基因中任何一种或它们共同的变化，即有可能引起细胞增殖失控导致肿瘤的发生。

癌基因与抑癌基因的作用机制涉及基因表达调控及细胞分裂，分化过程。

这些生物学效应又与癌基因表达产物——类生长因子多肽及其受体有着极为密切的关系；癌基因可以编码类生长因子多肽及其受体分子，通过细胞内信息传递系统刺激细胞增殖。

由此可见，肿瘤的发生与癌基因、抑癌基因及生长因子三者的功能是密切相关的。

第一节癌基因癌基因最初的定义是指能在体外引起细胞转化、在体内诱发肿瘤的基因。

它是细胞内总体遗传物质的组成部分，人们将这类存在于生物正常细胞基因组中的癌基因称为原癌基因（proto －oncogenes，pro－onc）或称细胞癌基因（Cellular－oncogene，c－onc）。

在正常情况下，这些基因处于静止或低表达的状态，不仅对细胞无害，而且对维持细胞正常功能具有重要作用；当其受到致癌因素作用被活化并发生异常时，则可导致细胞癌变。

癌基因的名称一般用3个斜体小写字母表示，如 myc、 ras、 src等。

一、病毒癌基因肿瘤病毒是一类能使敏感宿主产生肿瘤或使培养细胞转化成癌细胞的动物病毒，根据其核酸组成分为DNA病毒和RNA病毒（即逆转录病毒retrovirus）。

腺病毒载体的研究进展

腺病毒载体的研究进展刘阳【摘要】基因治疗正在成为肿瘤治疗的有效手段,用于携带外源基因的载体在肿瘤的基因治疗中发挥了重要作用.其中腺病毒载体因宿主范围广、感染率高、病毒相对容易制备且不会与受染细胞发生整合等诸多优点,成为基因治疗中应用最为广泛的载体系统.肿瘤的基因病毒治疗是指在肿瘤特异性增殖病毒中加入抗癌基因,将肿瘤的基因治疗与病毒治疗各自的优势结合起来,可靶向杀伤肿瘤细胞,保护正常细胞免受严重伤害.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2015(021)024【总页数】3页(P4438-4440)【关键词】基因治疗;腺病毒载体;靶向转导;基因病毒治疗【作者】刘阳【作者单位】上海交通大学附属第一人民医院超声科,上海200080【正文语种】中文【中图分类】R730.59基因治疗是一项治疗恶性肿瘤的新策略，它将一段具有外源功能的基因导入至肿瘤细胞从而补偿其基因缺失，达到抑制或杀伤肿瘤细胞的目的[1]。

近年来，随着肿瘤分子生物学的发展以及人们对肿瘤病因、分子机制的不断深入研究，肿瘤基因治疗也日趋成熟。

由于肿瘤基因治疗直接针对疾病根源，在恶性肿瘤治疗方面较传统治疗方法显示出独特的优势，成为攻克恶性肿瘤领域的研究热点，因而越来越受到医学科研界的关注。

现对腺病毒载体的研究进展进行综述。

基因转运技术是肿瘤基因治疗的重要环节之一，因此寻找合适的基因转运载体一直是研究的热点。

由于腺病毒载体具有诸多独特的优点，已被广泛应用于人类疾病的基因治疗。

腺病毒是一种无被膜的二十面体病毒，目前已发现有50余种血清型，其中2型和5型研究得较多。

腺病毒通过纤维蛋白与感染细胞表面的柯萨奇腺病毒受体结合继而进入细胞。

在人体，柯萨奇腺病毒受体表达于各种正常上皮组织，但在许多肿瘤组织中存在柯萨奇腺病毒受体不同程度的下调或缺失[2-3]。

因此，通过构建肿瘤靶向性腺病毒载体，实现腺病毒对肿瘤细胞的靶向感染，从而完成目的基因的靶向转导[3]。

目前，腺病毒载体根据杀伤肿瘤细胞的作用机制不同分为两类：复制缺陷型腺病毒和条件复制型腺病毒。

(完整版)名词解释(分子生物学)

名词解释1.操纵子（operon）：是真核生物基因的一个基本转录单位，由编码序列及上游的调控序列组成。

编码序列通常包括几个功能相关的结构基因，调控序列由启动序列（启动子），操纵序列（操纵基因）及其他调节序列构成。

2.顺式作用元件（cis-acting element）：是真核基因表达是调控转录过程的特殊DNA序列，以转录因子结合而起作用，通常包括启动子，增强子，沉默子等。

3.反式作用因子（trans-acting factor）：与其他基因的顺式作用元件结合，调节基因转录活性的蛋白质因子，根据其功能不同可分为基本转录因子和特异性转录因子。

4.启动子（promoter）：位于结构基因上游，与RNA聚合酶识别，结合的特异DNA 序列，与基因转录起始有关。

5.增强子（enhancer）：指决定基因的时间，空间特异性表达，增强启动子的转录活性的特殊DNA序列，作用特点是无方向性，位置或距离不固定。

6.沉默子（silencer）：某些基因含有负性调节原件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。

7.基因表达调控（regulation of gene expression）：指细胞或生物体在接受环境信号刺激时或适应环境变化的过程中在基因表达水平上做出应答的分子机制。

8.基因重组（gene recombination）：DNA片段在细胞内、细胞间、甚至是在不同物种之间进行交换，重组后具有复制和表达功能。

9.基因工程：按照人为预愿获得目的基因，与载体拼接形成重组体，重组体转入宿主细胞，筛选和鉴定出含阳性重组体宿主细胞，经大量增殖，最总获得该目的基因决定的大量表达产物的过程。

10.同源重组（homologous recombination）：发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换，又称基因重组。

11.DNA克隆：在体内对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入适当细胞内，使其在细胞内扩增和繁殖，从而获得该DNA分子大量拷贝的过程，又叫基因克隆或重组DNA技术。

腺病毒简介——精选推荐

腺病毒简介1 简介⼈体腺病毒已知有52种，分别命名为adl～ad52，研究得最详细是ad2。

腺病毒基因组转录产⽣mRNA，已知的转录单位⾄少有5个：EⅠ区位于病毒基因组左侧，可再分成EⅠA和EⅠB，与细胞转化有关；EⅡ区编码DNA结合蛋⽩，参与病毒的复制；EⅢ区编码出现在宿主细胞表⾯的⼀种糖蛋⽩；EⅣ区位于ad2基因组右端，受EⅡ区编码的DNA结合蛋⽩质调控；第5个转录单位在病毒感染中期合成ad2蛋⽩质Ⅳ。

腺病毒对啮齿类动物有致癌能⼒，或能转化体外培养的啮齿类动物细胞。

使细胞转化只需要腺病毒基因组的⼀部分，这些基因位于基因组的左端，约占整个基因组的7%～10%。

尽管腺病毒分布很⼴，但对⼈体不出现致癌性。

⼈体细胞是⼀类允许细胞(permissive cell)，即这类细胞允许感染⼊侵的病毒在细胞内复制增殖，最后细胞裂解死亡⽽释放出⼤量⼦代病毒。

在体外培养的多种⼈体肿瘤细胞中均未查出腺病毒颗粒，但在⼈的1号染⾊体上有adl2的整合位点，这意味着⼈体细胞对于腺病毒也可能是⾮允许细胞，即这类细胞在病毒感染后，病毒不能在细胞内复制增殖，但可整合在受感染细胞的基因组内。

这些细胞被病毒转化，表型发⽣改变，且可在体外⽆限期地培养传代。

2 化学组成腺病毒是⼀种⽆包膜的双链DNA病毒，基因组长约25-45kb，理论上可编码22-40个基因。

⾐壳（capsid）呈规则的20⾯体结构，直径约80-110nm。

⾐壳含有240个六联体（hexon）、12个五联体（penton）及12根纤⽑（fiber），除此之外还有其他⼀些⼩蛋⽩，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。

六联体是形成病毒⾐壳20个三⾓形⾯的主要蛋⽩，12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤⽑蛋⽩构成的复合物，12根纤⽑以五联体蛋⽩为基底由⾐壳表⾯伸出，纤⽑顶端形成头节区（knob）。

五联体和纤⽑的头节区可与细胞表⾯的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着⾮常重要的作⽤。

生物技术制药重点及名词解释

生物技术制药第一章绪论★生物技术与生物技术药物的概念生物技术药物的分类✦按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片)✦按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰（RNAi）药物、基因治疗药物✦按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG）化多肽或蛋白质药物★生物技术药物的特性✦理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差✦药理学作用特性:活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性✦生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染✦质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定（原液、半成品及成品检定等等)第二章基因工程制药蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性（一般不进行常规的遗传毒性实验）；药代动力学真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性基因工程菌的修饰改造方法:构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰（降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节♦上游阶段:制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞♦下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞➢酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端➢1U核酸内切酶的酶活性:指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量➢影响限制性内切酶反应的因素：♦DNA样品的纯度：♦DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。

一种免疫检查点激活免疫共刺激的复制型溶瘤腺病毒及其构建方法和应用[发明专利]

专利名称：一种免疫检查点激活免疫共刺激的复制型溶瘤腺病毒及其构建方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：魏继武,张海林,张永辉,吴俊华,董杰
申请号：CN201910430993.9
申请日：20190522
公开号：CN110157686B
公开日：
20220621
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种阻断免疫检查点并激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒及其构建方法和应用，所述的新型阻断免疫检查点并激活免疫共刺激信号通路的复制型重组溶瘤腺病毒，能够在肿瘤细胞内复制，并表达和分泌可溶性蛋白sPVR；所述的可溶性蛋白为特异性地结合TIGIT和CD226的PVR蛋白的胞外区，所述的sPVR蛋白具有同时阻断免疫检查点TIGIT介导的免疫负性调控，和激活共刺激通路CD226介导的抗肿瘤免疫功能。

本发明的新型复制型溶瘤腺病毒AD5sPVR具有很强的活化抗肿瘤免疫作用，具有显著的抗肿瘤活性和安全性，有非常高的开发抗肿瘤药物的前景和价值。

申请人：南京惟亚德生物医药有限公司
地址：210000 江苏省南京市江北新区新锦湖路3-1号中丹生态生命科学产业园一期A栋1611室国籍：CN
代理机构：江苏银创律师事务所
代理人：何红梅
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c-Myc启动子结合蛋白1与肿瘤

c-Myc启动子结合蛋白1与肿瘤郭三君;谢勇恩【摘要】Human c-Myc promoter binding protein 1 (MBP-1 )is a molecule recently discovered located in cell nucleus.MBP-1 can modulate the expressing of multiple genes related to cell proliferation,apoptosis and tumor.This article summarizes the research progress of thismolecule,including its gene structure,cellular location,down streaming target molecules and its association to tumor.%人 c-Myc 原癌基因启动子结合蛋白1（c-Myc promoter binding protein 1，MBP-1）是新近发现的一个定位于细胞核内的调节分子，能靶向调控多种细胞增殖、凋亡和肿瘤相关基因的表达。

本文归纳和总结了其基因结构、细胞定位、调控的下游靶分子及其与肿瘤发生发展的相关性等方面的研究进展。

【期刊名称】《川北医学院学报》【年(卷),期】2016(031)005【总页数】4页(P773-776)【关键词】c-Myc启动子结合蛋白1;靶分子;肿瘤【作者】郭三君;谢勇恩【作者单位】川北医学院免疫与分子生物学研究所，四川南充 637000;川北医学院免疫与分子生物学研究所，四川南充 637000【正文语种】中文Ray等[1]从人类宫颈癌细胞HeLa细胞cDNA表达文库中克隆出一个新基因，其表达产物能与人类c-Myc原癌基因P2启动子特异性结合，阻止c-Myc的表达，因而将其命名为c-Myc启动子结合蛋白1(c-Myc promoter binding protein 1，MBP-1)。

病毒载体概述

病毒载体概述引言基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。

本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。

用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体不致病。

然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。

因此需要对其进行改造后才能用于人体。

原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。

但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。

近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。

第一节病毒载体产生的原理病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。

研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。

病毒基因组可分为编码区和非编码区。

编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。

非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。

各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。

一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。

基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。

最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。

比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。

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Ｔ脂质体法与ｐＨＥＰ；ＢＧ３骨架质粒共转染２３９Ｅ细胞进行重组腺病毒包装，释法测定腺病毒滴度；用稀应ＭＴ、１活细胞计数等方法观察其对肝癌细胞Ｈｐ２的特异性溶瘤作用并以正常人的血管内皮细胞ＥＶ０ｒｅＧＣ３４作为对照。结果：测序及双酶切鉴定结果证实，成功构建了双肿瘤特异性启动子调控复制腺病毒载体；２３在９Ｅ细胞中获得了重组腺病毒Ａｄ—ｓＰ—Ｔ，Ｐ滴度测定显示病毒滴度达到３９×１ＴＩｍｌＭＴ．０ＣＤ／；Ｙ结果显示，ｄＡ
【ｂｔｃ】ＯｊｔｅＴｏｓｕｔｏｄｉａｙｅｌａｎｅｏｉｓＣＡ）ｈｈｓｒｅｏｕｏｓ — Ａｓａｔｒｂｃｖ：ｏｎｒｎｉｎｌｐｃｔｇｄｎｒ（Ｒｄｗｉｖｎｙｗｍｒｐｅｉｃｔｃｃｔｌｒｉｉａｖｕｏｃｉｄｉｂｔｔｅ
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—ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
ｓＴＰ— Ｐ可有效抑制肝癌细胞增殖而对正常细胞无增殖抑制作用；细胞计数及细胞形态观察结果显示，活重
组腺病毒在肝癌细胞中选择性复制并发挥溶细胞作用。结论：双启动子调控的腺病毒具有显著的溶瘤作用
但对正常人血管内皮细胞不发挥溶细胞作用，实验结果为肝癌靶向治疗提供了更为良好的条件复制型病毒
【ｅｏｄ】ｐｃｔｇｄｎｖｕ；ｕｖｉｐｍｔ；ＴＲｍｔ；ｅａｍａｉｍＫｙｒｓｒｌａｎｅｏｒｓｒｖｒｏｒｈＥＴｐｏｒｈｐｔａｒｎａｗｅｉｉａｉｓｉｎｏｅｏｒｅｏｃｃｏ
Ｍｄｒｎｏｇ００１（５：８８— ８２ｏｅＯｅｌｙ１，８０）０４０５ｎｏ２
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【摘要】目的：构建并制备ｓｖｉ及ｈＥＴ双启动子调控的条件复制腺病毒，ｕｉｎＴＲｒｖ探讨其特异性溶瘤作用。方法：ＣＰＲ方法分别扩增肿瘤特异性ｓｒｖ及ｈＥＴ启动子，ｕｖｉｉｎＴＲ分别克隆入腺病毒载体ｐＣＸ１的两个复制必需基因ＥＡ和ＥＢ序列上游启动子区，１１构建出双肿瘤特异性启动子调控的条件复制腺病毒载体ｐＣ一ＳＸ１Ｐ—
载体及新的治疗策略。
【关键词】复制腺病毒；ｒｖ启动子；ＥＴｓｖｉｕｉｎｈＲ启动子；Ｔ肝癌
ｌ５【收稿日】２０９ — １一２期０
ｂｏｂｅｔｍｏｐｃｉｐｏｔｒｎｓｏｃｌｉｅｅｔｎＶｔｙｄｕｌｕｒｅｉｃｒｍｏｅｄｉｎｏｙｃｆｃｉｏｓｆａｔｔｉｒ
ＲＥｉｏｇ，Ｏｎ，Ｅｈ —ｙａＬＵＸｉＮＪ —ｈｎＬＮＧＭｉＷＮＺｉｕｎ，Ｉｎ—ｙｎＣａｇ，ＨＥＮＸｉ，ＨＥＮＧＳｉｉＺＣｈ —ｙｎ，ＨＡＮＨｕＧｉ—
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８８・４