Trizol法提取总RNA
Trizol提取总RNA-碧云天改进
Trizol 法提取RNA实验步骤1.细胞裂解或组织匀浆。
a. 贴壁细胞吸尽培养液，每10平方厘米细胞加入1ml Trizol。
一般六孔板每孔加1ml Trizol，12孔板每孔加0.5ml Trizol。
晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解，然后吸至离心管中。
b. 悬浮细胞离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物或酵母细胞，或一千万细菌，加入1ml Trizol。
用枪吹打或适当vortex，确保全部裂解。
某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，确保全部裂解。
c. 组织先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内。
每50mg-80mg组织加入1ml Trizol，匀浆。
对于RNA完整性要求比较高的情况，推荐先液氮冷冻组织块，然后在低温下用研钵研碎组织，随后再加入Trizol进行总RNA抽提。
2. 对于某些蛋白，多糖或脂含量很高的细胞或组织，Trizol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物。
需12,000g 4℃离心10分钟，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中。
3. 室温放置5分钟，使样品充分裂解。
4. 每毫升Trizol加入0.2ml氯仿，vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。
5. 12,000g 4℃离心15分钟，然后吸取含总RNA的上层无色水相至一新的离心管中，每毫升Trizol约可吸取0.5-0.55ml。
6. 按每毫升最初的Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。
如果希望提取microRNA等小RNA，推荐-70℃沉淀过夜。
7. 12,000g 4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清。
8. 每毫升最初的Trizol加入1ml 75%乙醇(DEPC水配制)，vortex或颠倒混匀，9. 7,500g 4℃离心5分钟，弃上清。
再用快速离心机甩一下，小心吸尽液体。
10. 待5-10分钟RNA略干后，加入20μlDEPC水溶解，-70℃冻存。
Trizol法提取总RNA Protocol
Trizol法提取总RNATrizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是基于氯仿-异硫氰酸胍的试剂，能够迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
通过将样品与Trizol试剂混合，可以裂解细胞并释放出RNA。
然后加入氯仿进一步抽提RNA，并通过离心分离出上清液中的RNA。
最后通过乙醇沉淀和洗涤得到纯化的RNA。
所需试剂和耗材1.Trizol试剂：用于细胞裂解和RNA的释放。
2.氯仿：用于抽提RNA。
3.无水乙醇：用于洗涤沉淀的RNA。
4.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
5.1.5ml Eppendorf管：用于RNA的存储。
6.Tips：用于吸取无RNA酶的水和Trizol试剂。
实验仪器1.台式高速离心机：用于离心分离RNA。
2.涡旋振荡器：用于混合样品和试剂。
3.移液器：用于吸取试剂和样品。
4.无菌微量离心管：用于样品和试剂的存储。
5.无菌手套：用于防止RNA酶的污染。
准备工作1.在实验前需要将实验区域和所有实验用具进行清洁和消毒，以避免RNA酶的污染。
2.使用Trizol试剂前需仔细阅读说明书，并确保按照说明书的要求进行操作。
3.为避免RNA酶的污染，需要穿戴无菌手套进行实验操作。
实验方法1.准备无菌的DEPC水，加入DEPC水至10ml，然后加入10μl的氯仿，充分混匀后放置备用。
2.在无菌的1.5ml Eppendorf管中加入100μl的Trizol试剂，加入10μl的氯仿，充分混匀后加入步骤1中制备好的DEPC水-氯仿混合液100μl，再次充分混匀后放置备用。
3.将样品加入到步骤2中制备好的溶液中，充分混匀后加入氯仿，再次充分混匀后进行高速离心，分离出上清液。
4.将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的无水乙醇，充分混匀后进行高速离心，收集沉淀的RNA。
5.用70%乙醇洗涤沉淀的RNA，去除残留的乙醇和盐类，最后将RNA沉淀干燥后重新溶解在水中或指定的缓冲液中。
注意事项1.在加入氯仿之前，不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
TRIzol法提取真核细胞和动物组织总RNA
TRIzol法提取真核细胞和动物组织总RNA简介TRIzol是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA试剂，可以从动物组织，真核细胞等中提取总RNA。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA。
加入氯仿离心后，溶液会形成上清层，中间层和有机层，RNA 分布在上清层中，收集上清层经异丙醇沉淀后便可以回收得到总RNA。
材料（1）试剂：RIzol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水、PBS 缓冲液等。
（2）器材：RNase Free EP管、冷冻离心机、组织匀浆器等。
实验步骤1、样品处理（1）细胞：收集细胞沉淀，加入1ml TRIzol吹打混匀。
（2）组织样品：取一小块样品于1.5ml离心管中，剪碎，加入TRIzol后匀浆器匀浆。
2、抽提RNA（1）室温孵育5min，加入200ul氯仿/1ml TRIzol，震荡混匀，室温静置3min。
（2）（提前预冷离心机）4°C ，12000×g离心15 min，离心后液体分为三层，小心吸取上层水相至新的EP管。
RNA在上层水相，中间层为DNA，下层为蛋白质。
吸上清时，不可吸到中间层，宁可少吸也不能多吸。
（3）加入500ul异丙醇/1ml TRIzol，上下颠倒混匀，冰上孵育10min。
（4）4°C ，12000×g离心10 min，弃上清。
（5）加入1ml 75%乙醇轻柔洗涤沉淀，短暂涡旋使沉淀漂起。
（6）4°C ，7500×g离心5 min，吸弃上清，静置干燥沉淀。
沉淀不能过干或过湿，待沉淀会变为半透明色即可。
（7）视沉淀量加入适量DEPC水溶解，轻轻吹打，-80°C长期保存。
3、总RNA 纯度、浓度和完整性检测（1）One Drop检测RNA纯度和浓度：纯净RNA的A260/A280的比值为2.0，小于1.9说明存在有机物污染，大于2.1则说明RNA发生了降解。
TRIZOL试剂提取RNA
TRIZOL试剂警告：接触皮肤或误吞将导致中毒或灼伤。
接触皮肤之后立即用去垢剂和水冲洗。
若感到不适，请遵医嘱（可能的话出示标签）。
收到药品后，在室温下存储。
以已证明TRIZOL在常温下可稳定储存12个月。
说明：TRIZOL是一种从细胞和组织中提取总RNA的现用试剂。
该试剂是一种苯酚异硫氰酸酯单相溶液，它发展自Chomczynski 和Sacchi的RNA一步抽提法。
在细胞破碎和溶解细胞组分时，TRIZOL可以保持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整性。
离心后加入氯仿，将溶液分为水相和有机相。
RNA只留在水相中。
转移水相后，用异丙醇沉淀回收RNA。
除去水相后，样品中的DNA和蛋白质也可以用后续沉淀方法回收。
用乙醇从相界面间沉淀DNA，异丙醇从有机相回收蛋白质。
DNA的共纯化可能对样品间RNA产量的正常化有用。
这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各种量的组织（低至50-100mg，高至≥1g）和细胞（低至5×106，高至＞107）都有良好的效果。
其简单的操作方法允许同时处理大量样品。
整个过程可在1小时内完成。
用TRIZOL提出的总RNA不含蛋白质和DNA污染，可用来做Northern 电泳分析、斑点杂交、poly (A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
在PCR和扩大DNA酶Ⅰ梯度分离中，建议使用一个内含子中的两个引物。
TRIZOL简化了各种类型的大分子及小分子RNA的分离。
例如，从鼠肝分离的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7到15kb的大分子RNA条带,（由mRNA和hnRNA组成的）两个约5kb（28S）和2kb（18S）核糖体RNA的条带，以及介于0.1到0.3kb（tRNA, 5S）的小分子RNA的条带。
所分离的RNA稀释于TE时A260/A280之比大于等于1.8。
谨防RNase的污染：在提取中任何不正确的操作方法中都可能偶然引入RNase。
由于其活性难以抑制，因此只能直接避免其引入。
Trizol试剂法
细胞中的RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体
RNA三大类，不同组织总RNA提取实质就是将细胞裂 解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白、DNA等 杂质，最终获得高纯RNA产物的过程。
• RNA 提取的关键是防止RNA酶对RNA的降解作用.RNA提 取对样品的新鲜性要求非常高，获取样品后最好立即提取 RNA，若无条件立即实验，应于-80℃或液氮中保存样品， 提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞，以防RNA 降解。 • Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总NA的试剂。它 在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释 放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心， 样品分成水样层和有机层。
• 三、RNA沉淀
• 6.上清液加入约0.5ml的异丙醇,振荡混均30秒。室温下静 置10分钟。
• 7.离心12000rpm 10分钟4°C。
• 8. RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注 意避免吸弃RNA沉淀。
• 四、RNA清洗
• 离心管加入1ml 预冷的75%乙醇(1mlTrizol至少1ml乙醇清 洗DNA),振荡混均30秒，使沉淀振荡起来，室温7500g离 心5分钟。尽可能吸弃上清液,防止RNA沉淀丢失。重复以 上清洗步骤一次。室温静置5－15分，使RNA沉淀干燥， 加入适量 DEPC水溶解。 • RNA在4℃至少保存1周，－20℃至少保存1年
• Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍是 一类强力的蛋白质变性剂，可以抑制RNA酶,可溶解蛋白质，细胞 结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。促使核蛋白体的解离，使RNA 与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。 • 当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，加速有机相和水相的分层。 而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层， 这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无 色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。上层水 相，PH 5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在 酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。
动植物总RNA提取-Trizol法
动植物总RNA提取-Trizol法Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。
用Trizol 法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。
RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。
RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
TRIzol的主要成分是酚。
主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
x0.1%的8－羟基喹啉的，与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制x异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
总RNA提取
总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放臵5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放臵2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相臵于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放臵10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
8.TRIZOL百科名片TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
TRIzol 在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用。
主要成分TRIzol的主要成分是苯酚。
苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。
TRIZOL法提取总RNA
目录
• 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 注意事项 • 实验优化和常见问题处理
01
实验原理
Trizol的组成和作用
Trizol是一种常用的细胞裂解液，主要由苯酚、异硫氰酸胍和苯酚等成分 组成。
苯酚的作用是使蛋白质变性并释放核酸，异硫氰酸胍的作用是抑制DNA 酶活性，防止DNA降解，同时能ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ效地变性蛋白质，使RNA充分释放。
RNA的完整性检测
琼脂糖凝胶电泳
将RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，观察28S和18S rRNA条带的亮度及完整性， 判断RNA的质量。
生物信息学分析
将RNA测序数据与基因组数据进行比对，分析转录本的拼接情况，评估RNA的 完整性。
反转录和PCR验证
反转录
将RNA反转录成cDNA，以便进行后 续的PCR验证。
效果。
去除DNA和蛋白质
在提取RNA的过程中，需要去除DNA 和蛋白质等杂质，以避免对后续实验 的干扰。
在去除杂质的过程中，需要注意控制 好离心时间和转速，以保证去除效果。
Trizol法中，DNA和蛋白质可以通过 离心和洗涤的方法去除。在离心后， 上清液中的DNA和蛋白质可以被去除， 而RNA则留在沉淀中。
在使用Trizol法时，通常采用玻璃匀浆器或匀浆机进行匀浆破碎。
抽提RNA
抽提RNA的目的是将RNA从细 胞碎片和其他杂质中分离出来。
Trizol法是一种常用的RNA抽提 试剂，它能够有效地分离出
RNA，同时抑制DNA和蛋白质 的降解。
在抽提过程中，需要按照试剂说 明书进行操作，注意控制好细胞 碎片的浓度和体积，以保证抽提
将提取的RNA存储在无菌环境中， 避免污染。
Trizol法提取动植物细胞组织总RNA
Trizol 法提取细胞/组织样本总RNA1. 所需试剂：名称来源储存条件有效期RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent（R401）仓库4℃1年DEPC水配制间室温1周75%乙醇（DEPC水配）自备室温7天氯仿外购室温1年异丙醇外购室温1年2%琼脂糖凝胶自制室温1天Marker DL5000 仓库室温1年PBS缓冲液自备室温1年2. 所需耗材及仪器：序号名称序号名称1 冷冻离心机 4 制冰机、冰盒和冰2 通风橱 5 电泳仪及电泳槽3 RNase free枪头和EP管 6 OneDrop3. 操作步骤：3.1 细胞样本预处理1）小心倒掉细胞培养液，用移液器吸取5ml 1×PBS缓冲液小心加至培养皿中，轻轻晃动，将残留的培养液洗掉，用枪吸净PBS缓冲液，向每个培养皿中加入2 ml Trizol用枪吹打，使细胞完全悬浮和裂解。
（一般一次提取的1 mg RNA需要10盘HeLa Cell。
）2）将裂解的细胞转移至50 ml RNase Free离心管中，在超净台中分装至1.5 ml RNase Free EP管，每管分装1 ml。
3.2 动物组织样本预处理1）取动物组织样本50-100 mg于1.5 ml EP管中，向其中加入1 ml Trizol，用匀浆机高速匀浆，直至无明显颗粒状物质；或将动物组织剪成碎块，迅速转移至已用液氮预冷的灭菌研钵内，将组织碎块研磨成粉末，再称取50-100 mg于1.5 ml EP管中，并加入1 ml Trizol 中，用移液器吹打至无明显颗粒状物质。
3.3 植物组织样本预处理1）取新鲜植物组织样本15-30 mg于1.5 ml EP管中，向其中加入1 ml Trizol，用匀浆机高速匀浆，直至无明显颗粒状物质；或将动物组织剪成碎块，迅速转移至已用液氮预冷的灭菌研钵内，将组织碎块研磨成粉末，再称取15-30 mg于1.5 ml EP管中，并加入1 ml Trizol中，用移液器吹打至无明显颗粒状物质。
Trizol法提取总RNA(细胞和组织)
Trizol法提取总RNA
1、①提取组织RNA时，研钵高温高压灭菌，每50-100mg组织液氮研磨后，将粉末用液氮预冷的药匙转移至预先装有1ml Trizol的EP管中，充分混匀（粉末总体积不能超过Trizol体积的10%）用1ml Trizol 试剂裂解；
②提取细胞RNA时，每5-10×106个细胞用1ml Trizol裂解，反复吹打或剧烈振荡；
2、将上述裂解液，室温15-30℃静置5min；
3、每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，在手中用力振荡15s，室温放置2-3min后，12000r离心15min（2-8℃）；
4、取上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，室温放置10min，12000r离心10min（2-8℃），弃上清；
5、向沉淀中按每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇（4℃），涡旋混合，进行洗涤，7500r离心5min（2-8℃）,弃上清；
6、将RNA沉淀在室温下自然干燥（5-10min）；
7、用30μl RNase-free water溶解RNA沉淀；
8、取出1μl，稀释10倍，测定RNA浓度并记录；
9、进行反转录或分装保存于-80℃。
Trizol法提取组织总RNA步骤
1.研磨制样：先向研钵中加入少量液氮，等液氮挥发使研钵预冷。
再向研钵内倒入适量液氮。
从-70度冰箱取出组织，用镊子从冻存管中夹取一小块放入研钵中。
迅速研磨组织块，成粉末时加入1ml的trizol，继续研磨，可看到粉末成浆，由浓变稀，直至组织样全部溶解，用移液枪吸到无酶EP管。
2. Trizol法提取RNA
1) 室温静置3-10min，使蛋白质变性；
2) 加入1/4~1/5体积的氯仿，颠倒震荡1min，室温静置3-5min，静置分层，然后4℃离心，12000rpm，5min。
（核蛋白复合体彻底裂解）
3) 吸取上清至无酶的EP管中，加入等体积的酚：氯仿，颠倒震荡1min，室温静置3-5min，静置分层，然后4℃离心，12000rpm，5min，取上清。
若是细胞RNA提取可只加等体积氯仿抽提一次，但对于组织一般都要重复该步骤，至没有蛋白层为止，一般抽提两次。
（离心后会分为三次：上层：水相，中间层：DNA，下层：蛋白。
为了降低水相和有机相分界处DNA污染，不要吸取水相的最下层）4) 加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上静置30min，然后4℃离心12000rpm，30min，弃上清。
（此步骤主要是充分沉淀RNA，然后收集。
故步骤中的冰置30min,也可以是在-20°放置半小时以上，甚至过夜）
5) 加入100ul 70%乙醇，将沉淀吹起来，注意不要吹散，然后4℃12000rpm，5min。
6) 弃上清，空气中挥发乙醇，至壁上无液滴。
7) 加入适量DEPC水，（一般为20ul）溶解。
8) 分光光度计检测RNA浓度和OD值，将Total RNA稀释至1ug/ul，备用。
Trizol法提取水稻总RNA的原理和方法
Trizol法提取水稻总RNA
原理：Trizol试剂中主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中，此外，与RNA结合，形成RNA-有机溶剂复合物。
这个复合物可以稳定RNA的结构并保护它免受酶降解→当加入氯仿时，形成水相和有机相，酸性苯酚可促使RNA进入水相，而苯酚又可被氯仿抽提，离心后便可形成含RNA的水相层（上层）和含蛋白质和DNA（中层）的有机层（下层）→再使用异丙醇沉淀水相中的RNA，乙醇洗涤沉淀中残留的有机溶剂，最终风干得到RNA。
方法：新鲜组织液氮冷冻，研磨成粉末状→样品中加入Trizol（已预冷），涡旋振荡10s充分混匀，冰上静置5-10 min→加入1/4 Trizol体积的氯仿(已预冷)，充分振荡混匀后冰上静置10 min→12000 rpm，4℃离心10 min(下层为有机溶剂，中间为蛋白质，上层为RNA)→加入预冷的异丙醇-20℃沉淀30min或过夜→12000 rpm，4℃离心15 min，弃上清收集RNA→加70%乙醇清洗沉淀两次→离心弃上清，干燥RNA→DEPC水溶解RNA→-80℃保存。
提取总rna的方法
提取总rna的方法
1.收集细胞样品，并立即加入1 mL TRIzol试剂。
2. 彻底混合，使样品完全与TRIzol试剂混合。
3. 放置室温5分钟。
4. 加入200 μL氯仿，轻轻摇晃管子混合。
5. 放置室温10分钟。
6. 离心12,000 rpm，4℃，15分钟。
7. 将上清液转移到新的1.5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇混合，轻轻摇晃混合。
8. 放置室温10分钟。
9. 离心12,000 rpm，4℃，10分钟。
10. 倒掉上清液，用70%乙醇洗涤沉淀。
11. 离心12,000 rpm，4℃，5分钟。
12. 倒掉上清液，用RNase-free水洗涤沉淀。
13. 用RNase-free水重悬RNA沉淀。
14. 加入DNase I酶，按照酶的说明书处理。
15. 用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和纯度。
总RNA的提取过程需要注意以下几点：
1. 保持细胞样品在冰冻状态，防止RNA分解。
2. TRIzol试剂和氯仿的使用要充分混合，不要过度混合，以免影响RNA的提取。
3. 在加入异丙醇之前，要等待氯仿和试剂分离，以确保上清液
中的RNA含量最大化。
4. 洗涤RNA沉淀时，要用70%乙醇，以去除残留的盐和试剂。
5. 洗涤沉淀时要避免使用强酸、强碱或含有RNA酶的溶液，这些溶液会影响RNA的纯度和完整性。
总的来说，总RNA的提取方法比较简单，但在操作过程中需要注意细节，以确保提取的RNA质量和完整性。
TRIzol法提取RNA
总RNA提取（TRIzol法）仪器和材料：氯仿、异丙醇、无水乙醇、无RNA酶枪头（1000µL，200µL，10µL）、移液枪、无RNA酶EP管（有1.5mL、2mL、15mL、50mL等不同规格）、75%乙醇（尽量现配现用，配制好后置于4℃冰箱待用）、滤纸、DEPC水、计时器记号笔等注：上述材料标记好提RNA专用，自己保管好！操作步骤：1．细胞悬液按照每5×105~106个细胞加1mL TRIzol，贴壁细胞直接加TRIzol 裂解，（1个T25cm2细胞培养瓶可加1~2mL TRIzol，可根据需求来添加），裂解数分钟（5~10分钟，可在倒置显微镜下观察细胞脱落情况），反复用枪吹打或持续振荡以裂解细胞。
2．将上述TRIzol裂解液转移至1.5mL EP管中，每个EP管做好标记，按照每1mL TRIzol加200µL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，用力振荡（手动）15秒，在室温下放置10~15分钟（观察到明显分层即可）；然后4℃离心机12000rpm离心15分钟。
3．将离心后EP管内上层液体转入新的EP管内（离心后分为3层，注意吸取第一层水相时不要吸到第二层，一般可吸到500µL左右），按照每1mL TRIzol 加500µL异丙醇的量加入异丙醇，盖上EP管盖子，轻轻颠倒混匀，在室温下放置10分钟，然后4℃离心机12000rpm离心10分钟。
4．轻轻弃掉上清，避免把沉淀倒走，如果是较多的贴壁细胞可观察白色的沉淀（上清或者少量细胞看不到），按照每1mL TRIzol添加1mL75%乙醇进行洗涤，上下颠倒混匀，室温放置5分钟，然后4℃离心机7500rpm离心5分钟。
5．轻轻弃掉上清液，将EP管管口倒置于滤纸上，吸掉残液，让沉淀的RNA 在室温下自然干燥，5~15分钟（残留的水分不要太多，也不要晾的太干了）。
6．用DEPC水溶解RNA沉淀，一般为20µL（10~20µL均可，加入水量太多会导致单位体积RNA浓度过低）。
TRIZOL法提取总RNA
TRIZOL法提取总RNA（改进的一步法）Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。
1.在1.5 ml的EP管中加入1ml的Trizol。
2.称取约100 mg的材料，在液氮中研磨，转至上述EP管中。
（材料体积≤Trizol体积的10%）旋涡震荡混匀，15-30℃静置5分钟。
3.去除胞壁残渣、多糖、蛋白、脂肪：离心（4℃，1‚2000 ×g）10分钟。
取上清至一新的EP管中。
4.分相：①加0.2 ml的氯仿，用手剧烈摇晃15秒钟。
15-30℃静置2-3分钟。
②离心（4℃，1‚2000 ×g，勿超过1‚2000 ×g）15分钟。
5.沉淀，并去除多糖：①用200μl的枪取无色水相（大约原初Trizol体积的60%，约600μl ）至一新的EP管中。
切勿吸到中间层。
②加0.25ml异丙醇，0.25ml高盐溶液，颠倒混匀，15-30℃静置10分钟。
③离心（4℃，1‚2000 ×g，勿超过1‚2000 ×g）10分钟。
倾去上清。
6. 清洗：①用200μl的枪吸除多余上清，加1ml 冰预冷的75% 乙醇，旋涡震荡。
②离心（4℃，7500 ×g）5分钟。
7. 用真空泵吸除乙醇，37℃干燥10分钟。
切勿干燥彻底，否则极难溶解。
8. 加适量的DEPC•H2O（一般20μl），枪打数次，使沉淀溶解。
然后置于55-60℃水浴中彻底溶解10分钟。
迅速冰浴，5分钟，稍离心。
9. 置于-70℃保存。
注意事项：①在第2步静置后，或第3步取上清后，可以在-70℃保存一个月。
②在第6步旋涡震荡后，可在-4℃保存一周，或在–20℃保存一年。
③高盐溶液：0.8M柠檬酸钠+1.2M氯化钠，DEPC处理后高温灭菌。
④通常用0.1-0.15 g材料可以提取 60-100 μg 总RNA。
TRIZOL法提取RNA
总细胞RNA的提取在建库过程中，由于cDNA合成这一步将使用通用引物oligo dT，因此在总RNA提取这一步中，提取纯化mRNA不是非常必要的。
提取高纯度的总细胞RNA足可以被用作cDNA合成的模板，目前提取RNA的方法很多，也有不少商业化的试剂盒。
1.TRIZOL法
(1)在上述方法中制备的带有细胞沉淀的Eppendorf管中加入1ml TRIZOL溶液，用手反复摇匀至细胞碎块完全被裂解，如不易完全裂解，可用移液器带有1ml无菌吸头反复吹打、研磨，至组织细胞完全裂解，液体基本澄清为止，必要情况下，可再次加入少许TRIZOL
溶液。
(2)将上述Eppendorf管置室温(25~27℃)静置15~20min后(也可置4℃较长时间)，每管加入0.2ml氯仿(02ml/ml)，在手中反复振荡摇匀，室温静置10min。
(3)将Eppendorf管置于高速台式冷冻离心机，或将普通离心机事先置4℃冰箱预冷。
在4℃12 000r/min离心10min。
(4)小心吸取上层水相置于另一无菌的新的Eppendorf管中，内含有提取的细胞总RNA。
(5)于管中加入05ml异丙醇，室温沉淀10min或4℃沉淀30min至1h。
(6)4℃12 000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75%无水乙醇洗两次。
(7)最后让沉淀的RNA在室温自然干燥，切勿抽干。
(8)每管用8~10μl无RNAase的纯水重悬干燥后的RNA，置于冰浴立即用于cDNA合成或置-70℃长期保存。
Trizol法提取细菌总RNA
实验三Trizol法提取细菌总RNA一、实验原理Trizol要紧物质是异硫氰酸胍，它能够破坏细胞使RNA释放出来的同时，爱惜RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
搜集上面的的水样层后，RNA 能够通过异丙醇沉淀来还原。
不管是人、动物、植物仍是细菌组织，Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)和大量的组织(≧1 g)和细胞(>107)均有较好的分离成效。
Trizol试剂操作上的简单性许诺同时处置多个的样品。
所有的操作能够在一小时内完成。
Trizol抽提的总RNA 能够幸免DNA和蛋白的污染。
二、要紧试剂和器材Trizol 溶液氯仿异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC水超净工作台 2.0 mL离心管（无Rnase）移液枪紫外分光光度计石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌三、实验步骤（一）. 采纳 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA1. 挑取大肠杆菌菌单菌落，培育至稳按期，取菌液2.0 mL 于2.0 mL离心管离心得菌体；二、每管加入 1 mL Trizol 溶液，盖紧管盖，猛烈振荡15 s，室温静置5 min 4℃，12000 g，离心 10 min；取上清转入(约 1 mL)新的 2.0 m L离心管中；3、每管加入 0.2 mL 的氯仿(0.2 体积 Trizol)，盖紧盖，猛烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4℃, 12000 g, 离心 10 min；警惕吸取上层水相，转入另一新的 2.0mL 离心管，测量其体积；（加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。
）4、加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，猛烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4℃，12000 g，离心 10 min；警惕吸取上层水相，转入另一已编号新的 2.0mL 离心管；五、加入 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol)，轻轻倒置混匀；室温，静置 10 min；4℃，12000 g，离心 10 min，RNA 沉于管底；警惕吸去上清；六、加1 mL75%的乙醇(预冷)，并轻柔倒置，洗涤沉淀；4℃，7500 g，离心 5 min；警惕弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min；7、各管用 30μL DEPC 处置过的双蒸去离子水溶解，55-60℃温育5 min，分装，-80℃贮存(可贮存5周)；（二）. RNA 浓度的测定取10 µL RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL，转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，警惕排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中别离测定 260 nm、280 nm 的光吸收值，依照公式计算 RNA 的浓度。
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Trizol法提取总RNA
原理：Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。
共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。
Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织，5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。
一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。
本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的完整性。
保存条件：2~8℃避光保存12个月。
实验前需要准备的试剂：
Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇（用RNase-Free水配制），RNase-Free 水。
实验前需要准备的物品：
1ml注射器，1.5ml EP管（DEPC处理过），大、中、小号枪头（DEPC 处理）
样品前处理注意点：
1.选择新鲜血液，不得超过4小时。
2.选择新鲜组织，生长旺盛的组织。
3.选择新鲜的幼嫩组织。
4.选择处于生长旺盛的时期收集细胞。
RNA纯化要求：
1.纯化后不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的物质。
2.排除有机溶剂和金属离子的污染。
3.蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降到最低程度。
4.排除DNA分子的污染。
RNA提取的注意事项：
1.杜绝外源酶的污染。
（1）严格戴好口罩，手套。
（2）实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。
（3）实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。
2.阻止内源酶的活性。
（1）选择合适的匀浆方法。
（2）选择合适的裂解液。
（3）控制好样品的起始量。
3.明确自己的提取目的。
（1）任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，提取成功率急剧下降。
（2）RNA提取成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。
Rnase污染的10大来源
1.手指头
2.枪头
3.水/缓冲液
4.实验台面
5.内源Rnase
6.RNA样品
7.质粒提取
8.RNA保存
9.阳离子（Ca，Mg）
10.后续实验所用的酶
流程：
1.样品处理：
（1）培养细胞：收获细胞1~5×107，加入1ml Trizol（异硫氰酸胍/
酚）（在冰箱旁边取出白细胞即刻加入Trizol），混匀；用1ml注射器反复抽取（约30次）以破裂细胞及剪切DNA，室温静置5min（使核酸蛋白复合物完全分离）。
（2）组织：取50~100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml EP管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。
2.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。
取澄清的匀浆液进行下一步操作。
3.加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15~30s，静置2~3min。
4.4℃离心，12000g×15min。
样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。
RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
5.小心吸取上清至一新的DEPC处理过的1.5ml EP管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
6.4℃离心，12000g×10min。
离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
7.弃上清，于沉淀中加入75%乙醇（冰冷）1ml，振摇，充分洗涤沉淀。
8.4℃离心，12000g×5min。
9.弃上清，短暂离心，小心吸取弃去上清。
10.加入适量（20μl）DEPC （Rnase Free）H20溶解RNA（65℃促溶10~15min）。
11.取2μl进行电泳，其余-80℃保存。