大鼠原代心肌细胞培养实验的
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定
网络出版时间： 2013-9-25 18： 33
Culture and identification of cardiomyocytes in neonatal rats
HU Bao-kui，GENG Zhao-hua，ZHU Shan-jun，LIU Yu-feng （ Department of Cardiology，Xinqiao Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400037， China）
在消化过程中，注意控制适宜的温度，在 37℃ 酶的活性较高，能获得很好的消化效果。每次消化 时间应控制在 10 min 以内，以避免长时间消化酶对 细胞的损伤作用。避免产生气泡，因为气泡表面的 张力作用可牵拉损伤细胞。用吸管反复吹打，使细 胞脱落，可缩短消化时间。
心肌细胞和成纤维细胞在培养板中的贴壁速度 不同，成纤维细胞比心肌细胞更容易贴壁，采用差速 贴壁可纯化心肌细胞，适当延长贴壁时间可提高心 肌细胞分离的纯度。本实验将贴壁时间延长至 90 min，获 得 高 纯 度 的 心 肌 细 胞，同 有 关 报 道 相 一 致［4，5］。但此种 方 法 只 适 合 短 期 培 养，不 适 合 细 胞
2 结果 2． 1 心肌细胞的形态学观察 心肌细胞消化后呈 圆形，培养 24 h 后基本贴壁生长，可见少数细胞开 始搏动，节律不规则，搏动微弱，细胞呈梭形或多角 形，核多为 1 个或两个，核仁清楚。培养 48 h 后心 肌细胞搏动增强，立体感明显，折光性强。培养 3 d 后，细胞伸出伪足交织成网，形成放射状排列的细胞 簇（ 图 1 ） ，呈 同 步 性 收 缩，搏 动 细 胞 百 分 率 约 为 80% ～ 90% 。
2. 2） % 。结论： 以本实验的方法培养的心肌细胞存活率高、纯度高，是一种较为理想的原代心肌细胞培养方法。
新生大鼠心肌细胞培养技术
【 ｅ Ｏｄ】 Ｃ ｌ ｕｕｅ ｅ ｎ ｕｓ Ｍｙｃ ｄ ｌ Ｒ ｔ Ｋｙ ｌ Ｗ Ｓ ｅ ｔ ｈｉ ｅ； ｌｌ ｒ ｔ ｑ ｃ ｃ ｏ ｒｉ； ａ ａ ａ ｓ
原 代培 养心 肌 细胞作 为 一种 主要 的研 究模 型 ， 被广泛 地 应 用 于心 血 管 疾 病 的研 究 中。我 们 经 过 长期 摸索 总结 出一 套 简便 、 有效 的大 鼠心肌 细胞 的
【 要】 目的 探讨新生大鼠心肌细胞的分离、 摘 培养方法。方法 取 １ 龄新生大 鼠的心室肌细胞 ， ～３ ｄ
用胶原酶 １分离心肌 细胞 ， 离心收集心肌细胞 ， 差速贴 壁法 纯化后 培养于 ＤＭＥ 培养基 。显微镜 下鉴定 心肌细 Ｍ
胞的纯度和形态结构 ， 锥虫蓝染色检查心肌细胞成 活率 。结果 出现 同簇 细胞 的同步跳动 。结论
【ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊ ｔｅ ｏ ｎ ｓ ａ ｐｒｔａｄｃｌｒ ｍ ｏａ ｉ ｌｏ ｎ ｎｔｒｓ Ｍｅ ｏｓ Ａ ｓａｔ ｂ ｃｖ Ｔ ｄ ｎｅ ｙｗ ｙ ｏ ｅａ ｅ ｎ ｔ ｅ ｙ ｒ ａｃ ｓ ｆ ｅ ａ ｔ ｒ ｅｉ ｉ ｆ ａ ａ ｔ ｓ ａ ｕ ｕ ｃ ｄ ｄ ｏ ｅ ａ ． ｔ ｄ ｌ ｈ
取一窝 １ ～３ｄ龄新 生大 鼠， 不用 麻醉和处 死 ， 用手 固
定住 四肢 ，５ ７ ％的酒精消毒皮肤 ， 无菌 眼科剪 在剑 突上一肋 处 人剪 （ 注意避免剪破消化 道预 防污 染） 。开 口 ０ ５ｃ ， ． ｒ 心 ｎ 脏 自然 跳 出 ， 心 尖 部 组 织 剪 下 迅 速 置 于 预 冷 的 不 含 将
ｗｅｅ ｕ ｉ ｙ ｃ ｒｎ ｕｌ ． ｏ ｃｕ ｉ Ｔ ｉ ｉ ａ ｆ ｔ ｅｗ ｙ ｔ ｕ ｙｍｙ ｃｒ ｉ ｅ ｓ ｒ ｊｍｐｎ ｓｎ ｈｏ ｏ ｓ Ｃ ｎ ｌ ｏ ｇ ｙ ｓｎ ｈｓ ｓｎ ｅｆ ｉ ａ ｓ ｄ ｏａｄａ ｃｌ ． ｃ ｅ ｖ ｏ ｔ ｌ ｌ
实验动物(大鼠、小鼠、兔)原代心肌细胞
实验动物（大鼠、小鼠、兔）原代心肌细胞产品编号：RAT/MIC/RAB-iCell-c001产品规格：>5×105细胞数产品价格：3930/3910/4350包装规格：1ml冻存细胞悬液或T-25培养瓶细胞详述：心肌的工作细胞包括心房肌和心室肌。
心肌细胞为短柱状，一般只有一个细胞核，心肌细胞之间有闰盘结构。
该处细胞膜凹凸相嵌，并特殊分化形成桥粒，彼此紧密连接，但心肌细胞之间并无原生质的连续。
心肌细胞的细胞核多位于细胞中部，形状似椭圆或似长方形，其长轴与肌原纤维的方向一致。
肌原纤维绕核而行，核的两端富有肌浆，其中含有丰富的糖原颗粒和线粒体，以适应心肌持续性节律收缩活动的需要。
细胞特性:1)组织来源于实验动物的正常心脏组织。
2)细胞鉴定：肌球蛋白重链(MHC)免疫荧光染色为阳性。
3)经鉴定细胞纯度高于90%。
4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。
5)细胞生长方式：长柱状细胞，不规则细胞，贴壁培养。
产品的运输和保存：视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。
1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。
2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。
推荐培养基：我们推荐使用iCell原代心肌细胞培养体系（产品编号：PriMed-iCELL-022）作为体外培养原代心肌细胞的培养基。
产品使用：1)本产品仅能用于科研2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核3)本产品未通过用于活体诊断的审核。
原代细胞分离培养鉴定2(SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞)
原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞）目录 3 原代分离——SD 大鼠心肌细胞的分离4 原代分离——SD 大鼠心肌成纤维细胞的分离SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维的分离目的与意义（心肌细胞）心肌细胞体外培养可以为心肌细胞生理、药理及心血管相关研究提供有效、稳定的实验模型，在医学领域有着广泛的应用前景。
体外培养的心肌细胞可保存其形态结构和功能上的某些特点，同时去除了体内外各种限制因素的影响 , 具有精确和重复性好等优点, 可广泛用于心肌结构、病理生理、电生理、药理及毒理、受体及作用机制、心室肌细胞损伤模型及药物保护等的研究。
其次，大鼠动物模型广泛用于心血管系统疾病的基础研究。
目的与意义（心肌成纤维细胞）心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。
非心肌细胞占细胞总数的 70%，其中 90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。
近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，与风湿性心脏病、心肌炎、心肌肥厚、慢性心肌缺血、心肌梗死、炎症等病理状态均密切相关，因此 ,对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。
心脏 大鼠的心脏位于胸腔内，两侧隔心包与左、右肺紧邻，背侧有气管、支气管和食管。
腹侧借较宽的胸心包韧带和胸骨相连，腹前方与胸腺相贴，后面靠近膈。
C腹侧面B A心肌细胞根据组织学特点、电生理特性分为两类：工作细胞：普通心肌细胞：如心房肌细胞、心室肌细胞，无自律性，主要执行收缩功能；自律细胞：特殊分化的心肌细胞，组成心脏特殊传导系统，如窦房结细胞，收缩功能基本丧失；DESD Rat心脏HE染色F7心肌成纤维细胞 1、 心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CFS)遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接心肌细 胞间质。
CFS 参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏发育、结构、细胞信号系统、物质代 谢等密切相关；它还可与心肌细胞、其它CFS 甚至内皮细胞之间相互接触，影响电机械功 能、细胞因子分泌和血管生成。
新生SD大鼠心肌细胞的原代分离和培养
模型。
１ 实 验 材 料 １．１ 实 验 动 物 。出 生７２ｈ内 的 ＳＤ 大 鼠 ，购 自 南 通 大 学 实 验 动 物 中 心 。 １．２ 主 要 试 剂 。Ｌ－ＤＭＥＭ、Ｂｒｄｕ、胰 蛋 白 酶 、胶 原 酶 Ⅰ 、胎 牛 血 清 。
２ 实 验 方 法 ２．１ 心 肌 细 胞 的 分 离 培 养 。取 出 生７２ｈ内 的 ＳＤ 大鼠 ，７５％ 酒 精 浸 泡 消 毒 ，颈 椎 脱 臼 致 死 ，于 超 净 工 作 台 内 快 速 打 开 乳 鼠 胸 腔 取 出 心 脏 ，置 于
体 外 培 养 的 原 代 心 肌 细 胞 具 有 良 好 的 节 律 性 和 收 缩 性 ，且 不 受 体 液 、神 经 等 体 内 多 种 复 杂 因 素 的 影 响 ，被 广 泛 应 用 于 心 血 管 疾 病 的 发 病
机 理 以 及 药 物 治 疗 机 制 的 研 究 。 ［１，２］ 但 心 肌 细 胞 再 生 能 力 差 ，不 能 传 代 ，
且 易 受 其 他 非 心 肌 细 胞 的 污 染 。到 目 前 为 止 ，心 肌 细 胞 的 体 外 培 养 技 术
仍 存 在 一 定 的 缺 陷 ，限 制 了 各 种 体 外 心 肌 实 验 模 型 的 理 想 建 立 。 本 实 验
采用 胰 蛋 白 酶 和 胶 原 酶 Ⅰ 联 合 消 化 的 方 法 ，获 得 了 具 有 较 高 存 活 率 和 搏 动性 研 究 提 供 可 靠 的 实 验
２５０
健 康 之 路 ２０１６ 年 ９ 月 第 １５ 卷 第 ９ 期 Ｈｅａｌｔｈ ｗａｙ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１６ Ｖｏｌｕｍｅ １５ Ｎｏ．９
新生 ＳＤ 大鼠心肌细胞的原代分离和培养
胡 君 熊存全 周红成 吴争鸣
新生大鼠心肌细胞原代培养方法
（ ． ０ ９ Ｍ ｓ ｒ ｄ ｇｅ ａ ｄｄ ｔ ｏ Ｔａ ｊ ｎｖ ｒ ｔ ｏ Ｔ ａ ｉｏ ａ Ｃ ｉｅｅＭｅ ｉ ｎ ，ｉｎｉ ３ ０ ９ ： ． １ ２ ０ ａ ｔ — ｅｒｅＣ ｎ ｉａ ｆ ｉ ｉ Ｕ ｉｅｓ ｙ ｆ ｒｄｔ ｎ ｌ ｈ ｓ ｄ ｉｅ Ｔ ａ ｊ ０ １ ３ ２ ｅ ｅ ｎｎ ｉ ｉ ｎ ｃ ｎ
原 代 心 肌 细 胞 培 养 技 术 被 广 泛 应 用 于 心 血 管 疾病 的研 究 之 中 ， 有 操 作 简 便 、 济 、 重 复 性 等 具 经 可
拘 。由天 津市 山川 红 实 验 动 物科 技 有 限 公 司 提供 ， 动物合 格证 号 ：０ ４ ３ 。 ０ ０ ０ ６
优点 ， 同时排 除 了神 经 、 液 等 因素 的干 扰 ， 可 从 体 并
Ｔａ ｉ ｉｅｓｔ ｆ ｒｄｔ ｎ ｌＣ ｉｅｅ Ｍｅ ｉｉｅ Ｔ ａ ｉ ０ １ ３） ｉｎｉ Ｕｎｖ ｒｉ ｏ ａ ｉｏ ａ ｈｎ ｓ ｄｃｎ ， ｉｎｉ ３ ０ ９ ｎ ｙ Ｔ ｉ ｎ
【 ｓ ａｔ ０ｂｅｔ ｅ ｏｅｐｏｅｔｅｍ ｔｏｓ ｆｈ ｒ ａｙｃｌ ｒ ｏ ａ ｉ ｙ ｓｆ ｅｓｃ ｉｇ Ａｂｔ ｃ】 ｒ ｊｃｉ Ｔ ｘｌｒ ｈ ｅ ｄ ｅｐ ｍ ｒ ｕｔ ｅ ｆ ｒ ｏ ｔ ０ ｔ ｕ ｋ ｖ ｈ ｏｔ ｉ ｕ ｃ ｄ ｃ ｅ ｒｈ ｎ
二、 实验 方法
１ 实 验动 物 ： ｄ内的 Ｗｉ ａ 新 生 大 鼠 ， 雄 不 ． ３ ｓｒ ｔ 雌
基 金 项 目 ： 家 自然 基 金 资助 项 目（ ｏ ８０ ２ ６ ） 国 Ｎ ． １７ ９ ５
作者单位 ：． １ 天津 中医药大学 ２０ ０ ９级硕士研究 生 ， 天津 ３０ ９ ； ． ０ １３ ２ 天 津 中医药大学 ， 天津 ３ ０ ９ ０ １３ 通讯作者 ： 张滕 ， ｍａ ：ａ．ｈｎｔｎ １３ ６ ．ｏ］ Ｅ ｉ ａａ ｚａｇ ｇ２ ＠１ ３ ｃｎ ｌ ｅ
新生SD大鼠心肌细胞的原代培养及荧光鉴定
岩， 张建华 ， 赵
勇
采用单纯胰蛋 白酶消化法分离 ， 差速贴壁法 纯化新生
液 等 自行 配置 。
大 鼠心肌细胞 。光学显微镜观察心肌细胞基本形态特征 ， 台
１ ． １ ． ３ 实验仪器 Ｚ Ｈ Ｊ Ｈ ． Ｃ １ １ １ ２ Ｂ超净工作 台（ 上 海智城公 司） ； Ｓ Ｍ Ａ Ｒ Ｔ Ｃ ｅ ｌ ｌ Ｃ Ｏ 培养箱 （ Ｈ ｅ ａ ｌ Ｆ ｏ ｒ ｃ ｅ
色法检测细胞成活率 达 ９ ０ ％ 以上 ； 肌钙蛋 白 Ｉ及 一 横 纹肌
肌动蛋 白免疫荧光染色法鉴定心肌细胞纯度达 ９ ８ ％ 以上 。
离心管 、 吸管 、 眼科剪 、 眼科镊等由本实验室提供 。
１ ． ２ 实验方 法
关键词
心肌细胞 ； 原 代培养 ； 新生大 鼠； 免疫 荧光
Ｒ ５ ４ ０ ． ４ ９
中图分类号
１ ． ２ ． １ 组 织 消化 和 细胞 分 离 配制 ０ ． １ ％胰酶 Ｄ －
文献标志码 Ａ 文章编号 １ ０ ０ ０—１ ４ ９ ２ （ ２ ０ １ ４ ） ０ １— ０ １ ２ ０— ０ ３
Ｈ ａ ｎ ｋ 缓冲液 ， 过滤除菌备用 ； 恒温磁力搅拌器预热
至３ ５～３ ７℃ 、 转速 ８ ０—１ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ； 取 出 生 １— ３日
・
１ ２ ０・
安徽 医科大学 学报
Ａ ｃ ｔ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｉ ｓ Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ ２ ０ １ ４ Ｊ ａ ｎ ； ４ ９ （ １ ）
新生 Ｓ Ｄ大 鼠心肌细胞 的原代培养及荧 光鉴定
姬婷婷 ， 徐
１ ． １ ． １ 实验动 物
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。
2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。
3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。
4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。
5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。
封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。
第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。
之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。
放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。
这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。
（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。
5只鼠铺一个培养瓶。
4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。
心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。
注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。
新生大鼠心肌细胞培养技巧
新生大鼠心肌细胞培养技巧原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g・L1,我们使用的为0.8 g・L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意:(1)转速一般控制在60~80 r・min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ・L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.1，取心脏：起初取心脏的听说可以“剪开胸骨，就可以挤出来”但是找不到合适的剪开点。
新生大鼠肌源性干细胞的原代培养和鉴定
新生大鼠肌源性干细胞的原代培养和鉴定（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的探讨骨骼肌源性干细胞体外培养、鉴定的方法。
方法采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌源性干细胞，经差速贴壁法纯化后，培养液中培养。
倒置显微镜观察细胞形态，生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力，结蛋白细胞免疫荧光方法鉴定肌源性干细胞。
结果经过两步消化和差速贴壁后，成功培养出高纯度的肌源性干细胞，细胞免疫荧光结果为desmin(+)。
结论通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞，结蛋白细胞免疫荧光可以对其早期鉴定，为组织工程的临床应用提供种子细胞。
【关键词】大鼠肌源性干细胞体外培养Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods By two-step method, the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin, and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells wasanalysed through studying growth curve, and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro 近年研究发现，成体骨骼肌中不但存在单能的成肌干细胞－卫星细胞，而且还含有多能的“肌源性干细胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。
新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法
新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法将大鼠的心肌细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。
2. 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。
0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精，培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。
3. 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。
二、方法1. 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2. 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。
然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。
重复以上过程。
取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
3. 用第二套手术器械进行下列操作。
用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。
新生SD大鼠心肌细胞原代培养方法改进
* " 重大新药创制" 科技重大专项十二五课题。课题名称为： 毒性生物标志物与人源化动物模型关键技术研究。课题号： 2012ZX09505001 － 001
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中药药理与临床 2012； 28（ 6）
中药药理与临床 2012； 28（ 6）
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实验方法
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新生 SD 大鼠心肌细胞原代培养方法改进*
郭 舜，张树江，段 蕊，张金晓，田义红＊＊，申秀萍 （ 天津市新药安全评价研究中心，天津 300301）
摘 要 目的：改良心肌细胞原代培养的方法条件、培养纯度，提高心肌细胞收获率和存活率。方法：取出生 24h 内 SD 大鼠
1 材料与方法
1． 1 动物 选择出生 24h 之内的 SD 大鼠，雌雄不拘，购自北 京维通利华实验动物技术有限公司。 1． 2 试 剂 0． 05% 胰 蛋 白 酶 和 Ⅱ 型 胶 原 酶 （ Gibco 公 司） ； DMEM-F12 培养基 （ Gibco 公司； DPBS（ Gibco 公司） ； 新生牛血 清（ Gibco 公司） ； 5-溴脱氧尿嘧啶（ Brdu） （ Sigma 公司） ； α-横纹 肌肌动蛋白（ α-sarcomericactin，α-SA） 单抗（ Abcam 公司） ； 二抗 （ Millipore IHC Select） 。 1． 3 仪器 倒置成像显微镜（ NIKON eclipse TS100-F） ； 二氧化 碳培养箱（ 三洋 MCO-19AIC） ； 高速台式离心机（ Thermo Scientific Sorvall ST16） ； DKB-501 型超级恒温水浴槽（ 上海森信实验仪 器有限公司） 。 1． 4 培养方法 取 24h 出生之内的 SD 大鼠（ 10 ～ 15 只） ，75% 酒精消毒。迅速开胸取出跳动心脏，放入预冷的含 1% 青链霉 素的 DPBS 中，反复冲洗 3 遍，洗去残留的血细胞。用弯头眼科 镊取心尖（ 心室） 部，至于预冷的 1% 青链霉素的 DPBS 中进行 漂洗 3 遍。更换眼科剪将漂洗后的心尖剪成约 0． 5 ～ 1mm3 的 小块，加入约 3 倍体积的 0． 05% 的胰蛋白酶消化，轻轻吹打后 弃去第一次的消化液，以去除血细胞。将剩余组织中加入 0． 1% 的Ⅱ型胶原酶溶液 5ml 转移至 50ml 无菌离心管中，于 37℃
新生SD大鼠心肌细胞的原代培养
３（ １ １ ）： ９ ６ ４—９ ６ ６ ．
作者简介 ： 张彤 ， 女， 副主任医师， 现工 作 于 山东 中医 药 大 学 附 属 医 院 （ 邮
编： ２ ５ ０ ０ １ １ ） ； 刘元峰 、 宋宪波， 工 作 于 山 东 中医 药 大 学 ； 苏文革 、 吴波 、 戴 国华（ 通 讯作 者 ） ， 工 作 于 山 东 中 医 药 大学 附属 医 院 （ 邮编 ： ２ ５ ０ ０ １ １ ） 。 （ 收 稿 日期 ： ２ ０ １ ３—０ ４ —０ ３ ） （ 本 文 编辑 王 雅 洁 ）
［ ３ ］ Ｂ ｕ ｒ ａ ｓ ｈ ｎ ｉ ｋ ｏ ｖ Ａ， Ａｎ ｔ ｚ ｅ ｌ ｅ ｖ ｉ ｔ ｃ ｈ Ｃ ． Ｂ ｌ ｏ ｃ ｋ ｏ ｆ Ｉ （ Ｋｓ ）ｄ ｏ ｅ ｓ ｎ ｏ ｔ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ
ｅ ａ ｒ ｌ ｙ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｄ ｅ ｐ ｏ ｌ ａ ｒ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｂ ｕ ｔ ｐ ｒ ｏ ｍｏ ｔ ｅ ｓ ｂ ｅ ｔ ａ— ａ ｄ ｒ ｅ ｎ ｅ ｒ ｇ ｉ ｃ
ｖ ａ ｓ ｃ Ｅｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈｙ ｓ ｉ ｏ １ ． ２ ０ ０ ０， １ １ （ ４） ： ４ ５ ８—４ ６ ５ ．
平， 达 到 修 复 内皮 功 能 的 目的 ， 提 示 其 在 治 疗 心 肌 梗 死 等 严 重 缺 血 性 疾 病 中有 着 较 好 的应 用 前 景 ， 但其促进 Ｅ Ｐ Ｃ归 巢 到 心 肌 的
关键 词 ： 心肌细胞 ； 原代 培 养 ； 心肌细胞鉴定 ； Ａｃ ｔ ｉ ｎ免 疫 组 化
大鼠原代心肌细胞分离
分离大鼠原代心肌细胞概述：整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，大鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。
大鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。
材料：1、培养液：1：1 混合的DMEM / F12 培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素。
2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05% ，用pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制，-20 ℃保存。
3、D-Hanks溶液（pH 7.2-7.8）：KCl 0.4 g 、KH2PO4 0.06 g 、NaCl 8.00g 、NaHCO3 0.35 g 、Na 2HPO4•7H2O 0.09 g 、酚红0.01 g 1L。
方法：1、所有器械（四把镊子两把剪刀）放在75%酒精中浸泡6 h以上。
2、用D-Hanks溶液（过滤灭菌）配制0.1%胰酶15 mL备用（胰酶原液0.25%）。
3、新生（2-3天）vistar乳大鼠20只，器械在酒精灯上灼烧消毒备用。
4、准备两个冰盒，在其中一个冰盒中放两个平皿，皿内盛放D-Hanks 溶液（无色），把灼烧后的一把镊子倒插在该冰盒中（用于涮洗心脏）。
另一个冰盒中同样放两个平皿，其一放D-Hanks溶液，其二放1mL0.1%胰酶，同样把灼烧后的一把镊子和一把剪刀（用于剪碎心脏）倒插在该冰盒中，所剩的两把镊子和一把剪刀灼烧后倒置用于解剖，切勿污染。
5、乳鼠两只一组处死消毒取样，方法：将其轮流放入装有75%酒精的烧杯中6 s即可。
6、从胸骨下端开始向上解剖乳鼠，剪至颈部，打开胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏心室部分放入第一个成有D-Hanks溶液的平皿中，速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。
大鼠乳鼠原代心房肌细胞培养的方法及鉴定
【 摘 要】 目的 ： 介 绍 大鼠乳 鼠－ Ａ房 肌 细胞 的 分 离、 Ｃ 纯化 ， 以及 培 养 和鉴 定 方 法 。
方
法： 取 １ ｄ 龄 Ｓ Ｄ 大 鼠心房 组织 ， 用０ ． １ 胰 蛋 白酶 和 ０ ． ０ ２ ５ １ Ｉ 型 胶 原 酶 消化 ， 将・ Ａ房 肌 Ｃ
Ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ ａ ｔ ｒ ｉ ａ ｌ ｍｙ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ ｉ ｎ ｎ ｅ ｏ ｎ ａ ｔ ａ ｌ ｒ ａ ｔ ＬＵＯ Ｌ ｉ ｎ．Ｌｌ Ｕ Ｚ ｈ ｉ — ｑ ｉ ｎ，ＹＡＮＧ
ｔ ｈ ｅ ａ ｔ ｒ ｉ ａ ｌ ｍｙ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ ｏ ｆ ｎ ｅ ｏ ｎ ａ ｔ ｅ ｒ ａ ｔ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ： Ａｆ ｔ ｅ ｒ ｄ ｉ ｇ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｔ ｒ ｙ ｐ ｓ ｉ ｎ（ Ｏ ． １ ）ａ ｎ ｄ ｔ ｙ ｐ ｅ １ Ｉ ｃ ｏ ｌ ｌ ａ ｇ ｅ ｎ ａ ｓ ｅ
培养 细胞 经免 疫 荧光鉴 定 ， ９ ５ ９ ／ ６ 为心 房 肌 细胞 结论 ： 该研 究是 一 种 较 好 的 乳 鼠 心房 肌
细胞 原代 培养及 鉴 定方 法 。
【 关键 词】 乳 鼠 ； 细胞培 养 ； 心房肌 细胞
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｉ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ３ — ６ ５ ８ ３ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ２ ． ０ １ ５
Ｇｕｉ ｚ ｈｏ ｕ ５５ ００ ０２， Ｃｈｉ ｎ ａ
［ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ ０ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ： Ｔｏ ｉ ｎ ｔ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｅ ａ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ，ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ，ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ
大鼠原代心肌培养
新生大鼠原代心肌培养需高压消毒：工具盒：小转子；300目滤网×2；眼科剪（直剪×1，弯剪×2）；枪头盒（1mL、200μL、20μL）。
需提前配制并4⁰C预冷：D-Hank’s稀释的0.1%胰酶；加双抗的PBS。
1．麻醉与消毒：麻醉1-3天新生大鼠并用75%酒精浸泡消毒。
2．解剖：剪开胸腔，立即取出跳动的心脏并放入冰冷的PBS（加双抗）中，切取心室并转移到另一新鲜冰冷PBS中，初步洗去心室内的血液后将心室剪成1-3mm3的碎块，短暂离心几次，以去除红细胞。
注：所有操作在冰上进行。
注意防止污染。
红细胞会影响心肌细胞的贴壁。
3．预处理（20min）：将切碎的组织转移至0.1%胰酶溶液（0.5ml/1心脏）的40ml 培养瓶中（含转子，），置于冰上20min，每3min摇动一次。
注：这一步中使胰酶充分浸润组织块，以利于后续消化。
4．胰酶消化（15min）：将培养瓶置于37⁰C水浴15min，150-200rpm搅拌。
注：胰酶应为D-Hank’s配置，与PBS配置的相比，更利于心肌细胞的存活和贴壁。
5．吸取上清：将上步中的培养瓶斜放静置后，小心吸取上层的细胞悬液，移至50ml离心管（预先加入5-10ml含10%FBS的DMEM培养基）中，终止胰酶作用。
收集的细胞悬液置于4⁰C冰箱。
注：尽量吸取上清，不要吸到下层粘稠的DNA或者组织块。
6．重复消化：向培养瓶中补充胰酶，重复步骤4、5，直至组织块基本消化干净。
7．收集细胞：将所有上述收集的细胞悬液1000 rpm 5min收集细胞，将细胞种植于100mm培养皿中进行预贴壁培养。
8．细胞纯化（1.5-2h）：将步骤7中所得细胞培养1.5-2h以使非心肌细胞贴壁，然后将剩余细胞悬液以5×105个/ ml的密度种植于6孔板或100mm培养皿中，加BrdU至终浓度为0.1mmol/L，培养48小时以防止非心肌细胞增殖。
48小时后，更换不添加BrdU的DMEM培养基进行培养。
大鼠原代细胞培养步骤
大鼠原代细胞培养步骤
大鼠原代细胞培养是指从活体组织中分离出的未经连续传代的细胞进行培养和繁殖。
以下是大鼠原代细胞培养的一般步骤：
1. 材料准备：准备培养皿、培养基、PBS（磷酸盐缓冲液）、消化酶、抗生素等。
2. 组织采集：使用无菌操作将大鼠体内所需组织（如肝脏、脾脏、肺组织等）取出。
3. 组织处理：将采集到的组织置于PBS中，用显微刀或剪刀切碎组织，使其细胞释放出来。
4. 细胞分散：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）对组织进行消化，使细胞分散开来。
5. 筛选和洗涤：倒入含有培养基的离心管中，并通过滤网筛除组织碎片、未被消化的残余物等。
6. 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪对细胞进行计数，以确定合适的细胞密度。
7. 细胞培养：将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒的培养皿中，并加入适量的培养基。
8. 培养条件：将培养皿放置在恒温培养箱中，设置适当的温度、湿度和CO2浓度，提供细胞生长所需的营养物质。
9. 观察和维护：定期观察细胞的形态、增殖情况和细胞污染情况，并进行必要的维护工作，如培养基更换、细胞传代等。
10. 实验应用：根据具体实验目的，将培养好的大鼠原代细胞用
于各种细胞学、分子生物学和药理学实验中。
需要注意的是，大鼠原代细胞具有有限的传代次数，因此在实验中需要及时进行细胞传代，以保证细胞的正常生长和功能。
同时，严格遵守无菌操作规范，确保细胞培养的纯度和质量。
心肌肥大实验实训报告
一、实验目的1. 了解心肌肥大的概念及其在心血管疾病中的重要性。
2. 掌握心肌肥大的实验研究方法，包括心肌细胞的培养、心肌肥大模型的建立以及相关指标的分析。
3. 学习使用显微镜观察心肌细胞的形态学变化，了解心肌肥大时的心肌细胞超微结构改变。
4. 通过实验，加深对心肌肥大机制的理解，为心血管疾病的治疗提供理论依据。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：新生大鼠心肌细胞、异丙肾上腺素（ISO）、去氧肾上腺素（PE）、心肌营养素-1（CT-1）抗体、吡格列酮等。
2. 仪器设备：倒置显微镜、荧光显微镜、细胞培养箱、PCR仪、Western blot系统、电镜等。
三、实验方法1. 心肌细胞培养：采用体外原代培养新生大鼠心肌细胞，经免疫细胞化学鉴定后，用于后续实验。
2. 心肌肥大模型建立：将培养的新生大鼠心肌细胞分为高糖高胰岛素组、吡格列酮干预组和对照组，分别给予高糖高胰岛素和吡格列酮处理。
3. 心肌细胞CT-1表达检测：通过免疫细胞化学方法检测心肌细胞中CT-1的表达，观察其在心肌肥大中的作用。
4. 心肌细胞STAT-3与Beclin-1表达检测：采用定量PCR和Western blot技术检测心肌细胞中STAT-3和Beclin-1的表达水平，探讨其在心肌肥厚发生、发展中的作用。
5. 心肌细胞超微结构观察：利用电镜观察心肌细胞的超微结构，了解心肌肥大时的心肌细胞形态学变化。
四、实验结果1. 高糖高胰岛素组心肌细胞CT-1表达显著升高，提示CT-1可能在心肌肥大中发挥重要作用。
2. 吡格列酮干预组心肌细胞CT-1表达显著降低，提示吡格列酮可能通过抑制CT-1的表达来发挥治疗作用。
3. 高糖高胰岛素组心肌细胞STAT-3和Beclin-1表达水平显著升高，提示STAT-3和Beclin-1可能参与心肌肥厚的发生、发展。
4. 电镜观察结果显示，高糖高胰岛素组心肌细胞线粒体数量减少、体积增大、形态异常，提示心肌细胞能量代谢异常。
新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良
新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良
李博;吴慧颖;朴虎林;柳克祥
【期刊名称】《中国实验诊断学》
【年(卷),期】2012(016)002
【摘要】目的探讨酶法分离新生大鼠心肌细胞,提高心肌原代细胞存活率及纯度.
方法应用0.1%的Ⅱ型胶原酶消化出生第1 d乳鼠的心肌组织,收集的细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基中和,加入DNA酶消化一次,用差速贴壁分离法分离.结
果在分离培养新生大鼠心肌细胞过程中,胶原酶和DNA酶的组合使用,并改变差速贴壁时间,可得到高存活率和高纯度的心肌细胞,细胞搏动率高,持续时间久.结论本
研究应用改良的新生乳鼠心肌细胞培养方法,心肌细胞存活率高,纯度高,且操作简便,重复性好,是一种较为理想的心肌细胞原代培养方法,可满足实验要求.
【总页数】4页(P200-203)
【作者】李博;吴慧颖;朴虎林;柳克祥
【作者单位】吉林大学第二医院,吉林,长春130041;吉林大学第二医院,吉林,长春130041;吉林大学第二医院,吉林,长春130041;吉林大学第二医院,吉林,长春130041
【正文语种】中文
【中图分类】Q78;Q542.2
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1.新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良 [J], 张琳;李东野;王志荣;夏勇;朱红;潘德峰;张卓琦;杨煜
2.新生大鼠心肌细胞原代培养方法优化 [J], 王艳慧;徐峰;果德安;姜宝红
3.新生SD大鼠心肌细胞原代培养方法的比较 [J], 王凤阁;孙思琪;韩月;孔钰琳;张绪东
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相关记录：年月日星期天气：
实验内容：C57小鼠心肌细胞培养
参加人员：王朗郭源源
一、培养前准备：
1 器械：
取心脏：wpi剪2把、显微镊弯2把、眼科镊1把
取心脏后：显微剪1把、持针器2把、吉利刀片2片、眼科镊2把、
400目细胞滤网
2 器皿：
外：烧杯1个100ml
内：盛酒精小烧杯、棉签2包，鼠板盛小鼠尸体，玻璃皿100mm 2，
碎冰盆底加两个冰袋，离心管架1，6孔板，EP管，15ml离心管，
50ml离心管
3 试剂及配制
1.培养基：DMEM/F12，添加15%FBS
2.提前融化：BrdU溴脱氧尿苷100X储备液(10 mM)，小牛血清、II
型胶原酶（10mg/ml储备液）、0.25%胰酶提前融化
3.D-Hanks液：
4.酶消化液：酶终浓度：2型胶原酶0.5mg/ml，胰酶0.15mg/ml
40ml：胰酶1.2ml，胶原酶2ml，D-HANKS 36.8ml
二方法
1 心脏取出
1. 加10ml和6ml未加血清的DMEM/F12到2个100mm皿中，平皿放入冰盆预冷。
2. 将20只小鼠婴放入100mm玻璃平皿，镊取小鼠放入75%酒精中浸泡数秒，对其颈部以下消毒，抓取小鼠，固定住上肢与下肢，从颈部剪下头部，剪刀由颈部伸入胸腔沿胸骨左侧剪开，轻轻挤压胸廓，让心脏跳出，迅速用镊子取下心脏，放入盛有10ml DMEM/F12的玻璃平皿中。
3. 轻柔清洗心脏的血液后转入另一个盛有10ml DMEM/F12液的10cm培养皿中，用显微剪将心脏剪成1-2mm的碎片。
4. 以上过程应在冰上30min之内完成。
2 消化细胞
1. 将剪碎的组织转入15ml离心管，吸去DMEM/F12，加入酶消化液4ml。
2. 37度水浴中轻摇，消化10min，静止数秒钟，吸取上清液，弃去。
此时消化下的细胞为不需要的红细胞、细胞碎片以及心内膜和心外膜细胞。
3. 37度水浴中轻摇，消化4-5min。
静止数秒钟，吸取上清液，放入预先放好7ml（体积为上清液体积的2-3倍）含20%小牛血清的DMEM/F12培养基的15ml离心管中终止消化，并置于冰上。
4. 重复3步骤，循环5-6次。
取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。
5. 将收集好心肌细胞悬液3管，以1000rpm转速离心5min，小心倒掉上清液，在一管中加入3ml培养基，轻柔吹打重悬细胞，再转到另一管，将各管细胞集中至1个15ml离心管中，轻柔混匀。
3 差时贴壁：
1.将细胞悬液经细胞40um过滤网过滤，以滤去细胞团块，用2ml 培养基冲洗滤膜。
2.将细胞接种在10mm的培养皿中进行差时贴壁70min。
3. 用0.1%明胶包被六孔板的5个孔
4. 培养皿中加入1ml培养基，清洗培养皿将沉于皿底但未贴壁的心肌细胞重悬，并转入到上述15ml离心管中。
5. 在原皿中加入含10%FBS的DMEM/F12培养基3ml 继续培养心脏成纤维细胞。
6. 在心肌细胞悬液共5ml加入Brdu 50ul终浓度（0.1mM）轻柔混匀之后，以每孔3ml加入到包被好的孔中。
7. 每个皿均按照南北方向、东西方向轻摇以分散细胞，勿漩涡摇晃。
5. 37度5%二氧化碳,静置培养48-72小时后用培养基洗涤1次，更换培养基，并加Brdu。