DNA的重组与转座

部位被切断，然后暴露的末端侵入到另一个双链
DNA分子，发现它的互补序列以后将替代与它相
同的链。然后DNA聚合酶将用留下的那条链作为
模板，填充上侵入链所留下的缺口。被替代的链 被降解，它的残留末端与另一分子中新合成的 DNA链相连接形成Holliday连接体。
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• Holliday连接体形成以后，就会产生异构化然 后拆分。 • 单链侵入模型中，异源双链首先只在两个 DNA分子中的一个形成。Holliday中间体形成 以后通过支链迁移能够在另一个DNA分子上 产生异源双链，这样就解释了异源双链是如何 形成的。
• 同源性重组最主要特征是相关的酶可以利用任 何一对同源序列为底物。
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• 真核生物减数分裂时的染色体之间的交换， 某些低等真核生物及细菌的转化、转导、 接合，噬菌体的整合等都属于同源性重组 这一类型。 • 在整个基因组中，同源重组的频率并不恒 定，并且跟染色体的结构有关。例如在异 染色体附近遗传物质的交换要受到抑制。
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第二节 位点特异性重组
• 位点特异性重组是指发生在DNA特异性位点上的
重组。
• 与同源重组不同，位点专一性重组不是由DNA序
列的同源性所引导，而是在结合序列部位由专一
的酶来催化断裂重接。位点专一性重组是由使相 应酶出现的调节过程所引发，而同源重组则是由 能与RecA蛋白结合的DNA序列随机断裂引发的。
• 通过同源性重组将DNA序列引入真核基因组已 经为研究高等生物开辟了一条新途径。
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• 用人工操作构建DNA重组体，将其导入受
体细胞扩增或表达，称为DNA克隆或分子
克隆（cloning）。
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第一节 同源重组
• 同源重组（homologous recombination）发生 在两个同源DNA片段之间，是在两个DNA分 子的同源序列之间直接进行交换的一种重组形 式。同源重组主要是利用DNA序列的同源性识 别重组对象，由碱基序列提供识别的特异性。
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• Holliday认为在DNA分子上存在某些位点，特 殊的引发重组的酶能够识别这些位点，确保两 条链在相同的部位被切断。
• 目前还没有足够的证据证明这些位点的存在。
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（2）单链侵入模型
• 单链侵入模型是对Holliday模型的修改。
• 在该模型中，两个DNA分子中的一个单链在随机
双螺.旋中的同源序列发生置换，这一反应被称为 单链摄取(single-strand uptake)或单链同化(singlestrand assimilation)。
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3. Ruv蛋白和 Holliday连接体的拆分
• 大肠杆菌有一组由三个基因编码与随后的重组相 关联的蛋白。
• ruvA 和 ruvB 基因的产物促进异源双链的形成。
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大肠杆菌重组的分子基础
• 在分子水平上，重组事件发生的先后顺序是相似
的：从一个已断裂的分子中产生的单链与其对应 的双螺旋发生作用，配对区间扩展，重组中间体 形成直到核酸内切酶解离此两个双螺旋分子。 • 识别反应是重组机制的不可分割的重要部分，并 且只涉及到DNA分子的特定区域而不是整个完整 的染色体。
Ruv A 蛋白可以识别Holliday连接体的结构，Ruv
B是一个腺苷三磷酸酶并可能提供支链迁移的动 力。
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• Ruv A在交叉点处与DNA所有的4条链相结合，在
交叉点的上游，两个Ruv B六聚体环状结构分别 与每个双螺旋相结合。
• RuvAB蛋白复合体可以使支链以10～20 bp的速度
迁移。
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1. 进行同源重组的基本条件
（1）在交换区具有相同或相似的序列
• 发生同源性重组的两个区域的核苷酸序列必须 是相同或非常相似的。
• 同源性重组常常只发生在两个DNA分子中的相 同部位。
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（2）双链DNA分子之间互补碱基进行配对 • 两个DNA分子的链之间互补的碱基配对确保重
组只发生在同样的基因座之间。
• RecA可以促进单链DNA 与其在双链DNA 分子中 互补的DNA 链的碱基相配对。 • RecA还可以在SOS 反应中激活蛋白酶。 RecA 需 要单链DNA和 ATP才能激活蛋白酶。
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• RecA能够利用由RecBCD在Chi位点附近切割所释
放的单链3’末端。 • RecA的DNA操作酶活性可以使一个单链DNA与
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• D环在DNA聚合酶的作用下修补而扩展，直至D
环的长度与“受体”DNA双螺旋缺口长度相当，
互补的两条单链退火。此时在缺口的两侧各有一
段异源双链DNA，两个杂合双螺旋之间为断裂 的缺口，并且此缺口为供体DNA序列所填充。 • 缺口处双链的完整性可以被以缺口3’端为起始的 修补合成来修复。缺口是被两次单链DNA的合 成而修复的。
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λ噬菌体DNA的整合与切除
• 为了进入溶源状态，游离的 DNA必须整合 （intergrate）到细菌DNA中去；而为了从溶原状 态向裂解状态转化，原噬菌体DNA则必须从细菌染 色体DNA上切除（excise）。
• 整合和切除均通过细菌DNA 和λDNA上特定位点—
附着点（attachment site，att）之间的重组而实现。
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（3）双链断裂修复模型
• 目前证明通过两个DNA分子之中的一个双链断裂引
发重组是个常见的机制。
• 该模型认为参与重组的两个DNA分子之一的两条链
被核酸内切酶切断，然后在核酸外切酶作用下产生3’
单链黏性末端。
• 两个3’游离末端之一侵入到另一个双螺旋的同源区，
置换“供体”双螺旋的一个单链而形成一段异源双 链DNA，并同时产生一个D环（D-loop）。
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• 第三个基因ruv C编码一种能够特异性地识别 Holliday连接体的核酸内切酶，此酶可以在体外切 断此种交叉而拆分重组中间体。 • 一个含4个碱基的序列提供了Ruv C拆分Holliday连 接体的热点。这一序列决定了拆分过程中哪一对 DNA链被切断，从而决定发生的是补丁型重组 （patch recombination）还是剪接型重组（splice recombination）。
• 分子间位点专一性重组产生整合或融合； • 重组位点的正向顺序间的分子内位点专一 性重组产生剪切和解离； • 重组位点的反向顺序间的分子间位点专一 性重组产生倒位。
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位点特异性重组的功能：
1. 调节噬菌体DNA与宿主菌染色体DNA的
整合； 2. 调节特定基因的表达；
3. 调节胚胎发育期间程序性的DNA重排。
recombination）
• 异常重组（illegitimate recombination)
• 转座重组（transposition recombination）
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• 许多重组反应利用不止一种机制进行，例如免
疫球蛋白VDJ连接涉及到位点特异性识别和类
似异常重组的过程；酵母接合型的转换既有同
源性重组和位点特异性重组的特征，也具有复 制转座过程的特征。
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• 位点特异性重组最早是在λ噬菌体的遗传学研究中
发现的。
• λ噬菌体DNA通过重组整合到大肠杆菌染色体的
专一性位点上，转变成为原噬菌体DNA的非活性
状态。
• λ噬菌体有两种存在型式：裂解状态和溶源状态。
两种类型间的转换是通过位点特异性重组实现的。
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根据重组所涉及的体系和重组位点的方向，
位点专一性重组可以介导3类反应：
单链的断裂，从而引发重组。
• 两个断裂单链的游离端彼此交换，形成两个异源
双链，然后末端连接形成Holliday连接体
（Holliday Junction）。
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• 一旦Holliday连接体形成后，它能进行重排从 而改变链的彼此关系。这种重排称为异构化， 因为在此过程中没有键的割裂。 • 一旦形成Holliday连接体后，就能被拆分。是
减数分裂和体细胞核基因中发生，也在线粒
体基因间和叶绿体基因间发生。
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• DNA重组的意义是能迅速增加群体的遗传 多样性，通过优化组合积累有利突变，推 动生物进化。此外，DNA重组还参与DNA 损伤修复，某些基因表达的调控等重要的 生物学过程。
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根据不同的机制，可将重组分成4类： • 同源性重组（homologous recombination） • 位点特异性重组（site-specific
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1. chi位点和RecBCD核酸酶
• 在λ噬菌体的一些突变种内，存在一些称为 chi的位点。chi位点单一的碱基对的改变即 可激发重组的发生。这些位点皆含有一个
恒定的非对称的8bp序列：
5’ GCTGGTGC 3’ 3’ CGACCACC 5’
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• Chi位点是一个由基因recBCD编码的Rec BCD酶 作用的靶部位。
• RecBCD酶是一种多功能酶，具有几种不同的活
性。它是一个强有力的降解DNA的核酸酶，早期
被检定为活性核酸外切酶V，具有解旋酶的活性。
• RecBCD 所介导的解旋和切割可以被用来产生末 端，并引发异源双链的形成。
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2. RecA和Holliday连接体的形成
RecA具有两种相当不同的活性:
• 在该部位两个双链DNA分子通过链之间互补的 碱基配对被维系在一起称为联会。
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（3）重组酶