皱褶假丝酵母脂肪酶

实验流程
1.使用不同方法固定化相同质量的 皱褶假丝酵母脂肪酶
2.采用橄榄油乳化法测定 游离酶与固定酶的循环水解酶活 3.通过循环水解酶活的变化比较 不同固定化酶方法的优劣
实验步骤
1.海藻酸钠包埋法制备固定化酶
I. 酶液的配制：称取脂肪酶 200mg ，用 pH 为 5.8 的 NaH2PO4-
Na2HPO4 缓冲溶液，稀释至40mL ，即配制成浓度为 5g/L 的酶 液。
II.固定化酶的制备：将1.00g的硅藻土加入酶液中，35℃恒温固定化
1h后，将固定化载体用丙酮淋洗4次，每次淋洗后4000r/min离心收 集固体，使载体颗粒分散，室温干燥。
实验结果
3.硅藻土吸附法制备固定化酶
这种固定化酶 为白色粉末状 固体，循环使 用时可以用过 滤、离心等方 法取出固体的 固定化酶，操 作比较简单。
II.固定化方法：将0.60g海藻酸钠放入50mL烧杯中，加入20mL
蒸馏水，35℃水浴加热溶解，待溶液冷却后，混合海藻酸钠 溶液与酶液，用针形注射器滴入凝结剂（1% CaCl2）溶液中， 35℃恒温固定化1h，便制得固定化脂肪酶，过滤，用无菌蒸 馏水淋洗4次，室温干燥。
实验结果
1.海藻酸钠包埋法制备固定化酶
目的和意义
但目前我国脂肪酶的研发及产业化水平与 国外存在较大差距，而且对于脂肪酶的固定化 方法没有进行过系统的比较研究。 本研究采用不同方法固定化相同质量的 皱褶假丝酵母脂肪酶，通过测定游离脂肪酶 及固定化酶的循环水解酶活得到固定化酶对 比游离酶的优势，并比较不同固定化酶方法 的优劣，为今后深入对微生物脂肪酶固定化 的研究提供参考依据。
实验结果
4.游离酶的循环转脂酶活测定结果：
如图所示，游离酶在循环利用8次后，酶活由初始的80.4U/mg变为 33.0U/mg，反应至第10次的酶活更是降至13.2U/mg。
实验步骤
5.固定化酶的循环水解酶活测定：
实验共制得三种固定化酶，按照游离酶循环水解酶活的 测定方法分别滴定三种固定化酶，记录消耗的NaOH溶液 的体积，并计算固定化酶的水解酶活。注意将固定化酶 全部取出，即固定化酶含有脂肪酶的质量为200mg。 重复操作，直至酶活明显降低，计算固定化酶的酶活回 收率。
这种固定化酶 为球状固体， 颜色乳白接近 透明，循环使 用时只需倒掉 反应液就可以 直接取出固定 化酶，操作简 单。
实验步骤
2.壳聚糖—戊二醛交联法制备固定化酶
I. 壳聚糖颗粒的制备：取 1.00g的壳聚糖溶于 30mL1%的乙酸溶液中，
35 ℃水浴加热使其充分溶解形成胶状溶液，用注射器滴入凝结剂 (1mol/L的NaOH溶液)中形成球状颗粒，便制得壳聚糖颗粒。水洗至中 性，室温干燥。
实验步骤
橄榄油乳化法是使用最普遍的测定酶活方法，本实验采 取此方法测定酶活性及酶活回收率。 酶活计算公式：U=(V-V’)×n×k×m/t U－样品的酶活力； V－滴定样品时消耗NaOH 标准溶液的体积/ml； V’－滴定对照组时消耗NaOH标准溶液的体积/ml； n－酶液的稀释倍数； k－指1mL碱中所含有的OH—的微摩尔数； m－固定化初始加入微生物脂肪酶的质量； t－反应时间/min。
实验结果
2.壳聚糖—戊二醛交联法制备固定化酶
这种固定化酶 为黄色固体颗 粒，循环使用 时只需倒掉反 应液就可以直 接取出固定化 酶，操作简单。
实验步骤
3.硅藻土吸附法制备固定化酶
I. 酶液的制备：将 200mg 酶粉溶解于 40mL 的 0.025mol/L 磷酸缓Hale Waihona Puke Baidu液
(pH7.5)中，便制得浓度为5g/L的酶液。
皱褶假丝酵母脂肪酶的 固定化方法比较研究
姓名：崔莹莹
专业：生物工程
学号：201102010129
指导老师：李 璟
背景
脂肪酶作为最主要的工业酶制剂之一，能 够催化油脂类分解、交换、合成等酶促反应， 脂肪酶的固定化技术，不仅能够实现重复利用 和自动化生产，亦可以大大提高酶的贮存稳定 性，使成本下降，在食品工业、纤维及造纸工 业、生物能源、制药工业、生物感应器工业等 领域的应用前景非常广泛。
II.酶液的配置：200mg脂肪酶溶于40ml的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)
中，制得5g/L的酶液；
III. 固定化方法：取壳聚糖颗粒 0.40g ，加入 0.05%戊二醛 5mL 交联 1h，
用无菌蒸馏水淋洗载体，放入酶液，35℃恒温固定化1h，过滤，用
无菌蒸馏水淋洗4次，室温干燥，便制得固定化脂肪酶。
固定化酶出现下降趋势分别是在第14次、第17次和第
10次。
结论
1.脂肪酶的固定化操作过程会造成酶活性的损失。
2.通过实验发现使用海藻酸钠包埋法和壳聚糖—戊二醛交联法制备 的固定化酶的水解酶活相对硅藻土吸附法较高，分别为78.0U/mg和 75.6U/mg。 3.使用壳聚糖—戊二醛交联法制备的固定化酶的重复使用率最高， 在反应17次后的残余酶活为84.1%；海藻酸钠包埋法制取的固定化酶 在反应第14次后的残余酶活为84.6%；硅藻土吸附法制取的固定化酶 在反应第10次后的残余酶活为80.0%。 4.三种固定化方法中，硅藻土吸附法和海藻酸钠包埋法操作较为简 单，壳聚糖—戊二醛交联法制备固定化脂肪酶用时最长。
实验结果
5.固定化酶的循环水解酶活测定结果：
如图所示，海藻酸钠包埋法制取的固定化酶在循环利用第14次后，
酶活由初始的78.0U/mg变为66.0U/mg，反应至第16次后残余酶活还
有33.6U/mg； 壳聚糖—戊二醛交联法制取的固定化酶在循环利用第17次后，酶活
由初始的75.6U/mg变为63.6U/mg，反应至第19次后残余酶活还有
实验步骤
4.游离酶的循环转脂酶活测定：
将所有反应液倒入50ml离心管，4000r/min离心10min，倒 出上清液将沉淀用无菌蒸馏水淋洗2次（每次洗涤过后都 要再4000r/min离心10min），然后将沉淀（游离酶）加入 另一个含新鲜乳化液的三角瓶中，反应10min，测定水解 酶活。 上述操作重复10次，计算游离酶的酶活回收率。
45.0U/mg； 硅藻土吸附法制取的固定化酶在循环利用第10次后，酶活由初始的 57.0U/mg变为45.6U/mg，反应至第16次后残余酶活还有25.2U/mg。
实验结果
6.游离与固定化脂肪酶循环水解酶活的比较
游离酶初始酶活最高，海藻酸钠包埋法和壳聚糖—戊
二醛交联法制备的固定化酶次之，硅藻土吸附法固定 化的脂肪酶酶活最低；游离酶循环水解酶活下降迅速， 在反应至第5次时就开始出现下降趋势，而海藻酸钠包 埋法和壳聚糖—戊二醛交联法和硅藻土吸附法制备的
实验步骤
4.游离酶的循环转脂酶活测定：
取两个三角瓶，分别加入橄榄油乳化液5mL，pH缓冲液 （0.05mol/L 甘氨酸－NaOH缓冲液）4mL，35℃水浴加热 5min（预热）后，取其中一个三角瓶加入200mg酶粉，反 应10min，加入15mL 95%乙醇中止反应。另一个三角瓶先 加15mL95%乙醇后再加200mg酶粉；两个三角瓶各加入2 滴酚酞溶液作指示剂，用NaOH溶液滴定，直至反应液微 红色并保持30s不退色为终点。用pH计测定此时溶液的pH 值，对照组滴定终点便是此pH（9.0）。记录消耗NaOH溶 液的体积。