微生物检验实验室分枝杆菌属检验标准操作规程
CNAS-GL41临床微生物检验程序验证指南
包括显微镜检查、分离培养及鉴定、药敏试验等在的临床微生物的检验方法（检验程序）如何验证？很多人对此非常困惑。
由CNAS2016.5.30新鲜发布的《临床微生物检验程序验证指南》犹如一盏明灯给大家指明了具体的方向。
虽然是针对认可实验室制定的指南文件，其他实验室亦可参考。
部分容节选4.3 显微镜检查显微镜检查程序包括涂片制备、染色镜检和结果报告过程。
实验室在开展各种类型显微镜检查（如革兰染色、抗酸染色、墨汁染色等）前应对本实验室使用的检验程序进行验证，并由经培训有涂片镜检能力的实验室人员操作。
检查方法可包括手工染片法和自动化染片法。
所有样品及其盛放容器均应当作有传染性物质，并按照实验室生物安全要求进行操作。
4.3.1 验证要求显微镜检查程序的验证应包括能力验证/实验室间比对和实验室人员比对（当多名人员从事该项目时）。
如果没有可获得的能力验证或室间质评，实验室应自行组织实验室间比对（宜与通过认可的实验室比对）。
若实验室同时开展手工染片法和自动化染片法，应进行两种方法的实验室部比对。
4.3.2比对方案4.3.2.1 样品数量每项检查应使用至少 5 份样品进行验证，覆盖全部样品类型，无菌样品类型包含阴性和阳性结果。
实验室应优先使用已知结果的留样样品，当不可获取时可采用模拟样品。
4.3.2.2 检验程序按临床标本常规方式处理,由本岗位工作人员使用实验室检验程序进行涂片制备、染色、镜检、判读。
4.3.2.3 结果报告根据实验室程序文件规定进行结果报告，其中抗酸杆菌应根据“分级报告标准”报告镜检结果。
4.3.3 可接受标准每项检查的比对结果符合率≥80% 。
4.4.1 血培养血培养检验程序包括从病人血液采集、运送、接收、孵育及监测的全过程。
目前临床实验室广泛使用全自动血培养系统。
临床微生物实验室血培养系统性能验证的主要目的是评估系统使用的培养基能否用于培养临床常见微生物（包括酵母菌、厌氧菌、苛养菌等）以及仪器（自动化系统）能否及时检测出血液中的大部分病原菌。
临床细菌培养鉴定流程及报告.介绍
3．分离培养 ⑴一般培养: 用定量接种环或无菌微量 加样器取尿液0.001ml或0.01ml(已使用 抗生素患者),接种于血平板和麦康凯/中 国兰平板,不能定量时需用倾碟法记数， 35～37℃培养18～24小时。 (2)特殊培养: 对临床要求真菌、淋病奈 瑟菌及结核菌等培养者，根据细菌所需 条件接种相应特殊培养基，放臵相应条 件下进行培养。
(三 ) 尿 尿路感染是指尿道内有大量微生物繁殖 而引起的尿路炎症。从肾脏排泌出来的 尿液正常情况下是无菌的，如果在尿液 中分离出细菌（排除污染因素）即为菌 尿，同时伴有感染症状者称为尿路感染。 根据感染部位可分为上尿路感染（肾盂 肾炎）及下尿路感染（膀胱炎），男性 还可出现前列腺炎。
1.尿中常见分离菌
⑵采血时间及采血量 采血培养应该尽量在使
用抗菌药之前进行，在24小时内采集2～3份血
培养（一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视
为单份血培养）。对间歇性寒战或发热应在寒 战或体温高峰到来之前0.5～1小时，采集血液， 或于寒战或发热后1小时进行。成人采血量8～ 10ml，儿童1～5ml。血液和肉汤之比1：5 ～1：
(2)标本采集 a.清洁中段尿 最好是晨尿，是临床上 最常留取尿标本的方法 b.耻骨上膀胱穿刺法 是评估膀胱内细 菌感染的“金标准” c.直接导尿法 d.小儿收集包 e.留臵导尿
(3)标本运送 标本采集后应及时送检， 2小时内进行接种，否则应臵4～8℃冰箱 保存，冷藏保存标本时间不得超过8小时。
(2)报告方式 初步报告：在分离出细菌后，进行革兰 氏染色，作出初步报告。 最终报告：有意义的阳性结果报告，应 报告菌落计数、细菌种名及药敏结果。 无意义的阳性结果报告，报告菌落 数、革兰氏染色形态特征，并注明是纯 培养或是混合菌生长。 阴性结果报告:应报告无菌生长和菌落计 数＜1000cfu/ml或 ＜100cfu/ml尿。
环境微生物监测标准操作规程
环境微生物监测标准操作规程一、监测指征1．感染暴发或感染流行时，环境因素在感染传播中有流行病学意义。
2．监测潜在的危险环境状况，证明有危险的病原体存在或证明危险的病原体已被成功清除。
3．当某项感染控制措施改变时，评估其效果；或者根据规范要求，仪器设备或系统启用时监测。
4．目标性监测的需要。
5．循证医学证据支持。
二、空气监测(沉降法)(一)采样时间：消毒处理后与进行医疗活动之前。
(二)采样高度：距地面垂直高度80～150 cm。
(三)采样点设置1．非洁净房间：室内面积≤30 ㎡，在对角线上设里、中、外3点。
里、外两点位置各距墙1 m；室内面积>30 ㎡，设东、西、南、北、中5点。
其中东、西、南、北4点均距墙1 m。
9 cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5 min后送检培养。
2．洁净房间：清洁房间在空态或静态条件下，根据房间的不同清洁级别进行布点，操作按照GB 50333—2002。
9cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露30 min后送检培养。
(四)采样注意事项1．采样人员做好手部卫生，佩戴口罩、帽子等个人防护装备。
进入清洁房间采样须穿洁服。
2．皿盖打开顺序应先内后外；手臂及头不可越过培养皿上方；行走及放置动作要轻，尽量减少对空气流动状态的影响；皿盖应扣放，以防污染。
3．采样结束后，由外向内合上皿盖。
4．采样完毕的培养皿应在6 h内培养。
(五)实验室检验1．培养皿在37℃培养48 h后，进行菌落计数和致病菌检验。
普通营养琼脂培养基的配制按照GB／T 4789．28—2003；菌落计数方法按照GB\T 7918．2—1987；致病菌检验：溶血性链球菌检验按照GB／T 4789．11—2003，沙门菌检验按照CB\T 4789．4—2003，铜绿假单胞菌检验按照GB／T7918．4—1987，金黄色葡萄球菌检验按照CB\T 7918．5—1987,，2．计算结果：非洁净房间以100 c㎡的平皿在空气中暴露5 min即相当于10 L 空气中的细菌数，计算公式为：细菌数(cfu／m3)=1 000÷(A／100×t×10／5)×N=50 000N／At式中：t——平皿暴露于空气中的时间(min)；N—一培养后平皿上的菌落数(cfu／平皿)；A——所用平皿的面积(c㎡)。
微生物第章 分枝杆菌属
微生物第章：分枝杆菌属一、概述分枝杆菌属（Bacillus）是革兰氏阳性的芽孢杆菌科中最常见的属之一。
其名称来源于其在培养基上形成的分枝的菌体形态。
该属菌体大小相对较大，形态多样，包括直形、杆形、梭形或球形等不同类型。
分枝杆菌属包括很多种类的细菌，一些种类在自然环境中很常见，有着重要的生态、工业和医学应用价值。
二、生态学和鉴定分枝杆菌属中的细菌生活在许多不同的环境中，包括土壤、水、植物、食品和动物的肠道中。
细菌在自然环境中存在着极为广泛的分布，在枯萎的植物、渣滓、泥炭、海水和河流等地方都可以发现其存在。
在实验室条件下，分枝杆菌属可以通过形态特征、代谢特性和生长特点等鉴定方法进行分离和鉴定。
最常用的方法是通过对分枝杆菌在特定培养基上的生长型态观察和菌落形态分析来确定其种属。
三、病原学分枝杆菌属在人类和动物中可以引起多种疾病，包括但不限于食物中毒、牲畜疾病和人类疾病。
尽管其中很多细菌是无害的或有益的，但某些菌株却可以对人类或动物健康构成威胁。
常见的分枝杆菌病原体包括：芽孢杆菌（B. anthracis）, 糖原芽胞杆菌（B. cereus），乳酸吸收性芽胞杆菌 (B. coagulans) 和枯草杆菌（B. subtilis）等。
分枝杆菌的病原性与其产生的细胞外毒素和内毒素有关，而这些毒素的分泌与生长环境和条件有很大关系。
四、工业应用除了在疾病治疗上的作用外，分枝杆菌属在工业生产中还有广泛的应用。
例如，在饮食加工业中，分枝杆菌可以用于制造豆腐、酱油等食品。
同时，分枝杆菌的一些菌株也可以进行微生物发酵生产出某些化合物，如抗生素、植酸酶、纤维蛋白溶酶等。
这些化合物在医药和普通日常生活中也被广泛使用。
五、分枝杆菌属在自然环境、医学、动物和食品加工业、以及其他工业领域都存在着广泛的应用和研究价值。
随着科学技术的发展和研究范围不断扩大，分枝杆菌属的多样性和作用将会得到更深入的了解和研究。
CNAS-GL41临床微生物检验程序验证指南
包括显微镜检查、分离培养及鉴定、药敏试验等在内的临床微生物的检验方法（检验程序）如何验证？很多人对此非常困惑。
由CNAS2016.5.30新鲜发布的《临床微生物检验程序验证指南》犹如一盏明灯给大家指明了具体的方向。
虽然是针对认可实验室制定的指南文件，其他实验室亦可参考。
部分内容节选4.3 显微镜检查显微镜检查程序包括涂片制备、染色镜检和结果报告过程。
实验室在开展各种类型显微镜检查（如革兰染色、抗酸染色、墨汁染色等）前应对本实验室使用的检验程序进行验证，并由经培训有涂片镜检能力的实验室人员操作。
检查方法可包括手工染片法和自动化染片法。
所有样品及其盛放容器均应当作有传染性物质，并按照实验室生物安全要求进行操作。
4.3.1 验证要求显微镜检查程序的验证应包括能力验证/实验室间比对和实验室内人员比对（当多名人员从事该项目时）。
如果没有可获得的能力验证或室间质评，实验室应自行组织实验室间比对（宜与通过认可的实验室比对）。
若实验室同时开展手工染片法和自动化染片法，应进行两种方法的实验室内部比对。
4.3.2比对方案4.3.2.1 样品数量每项检查应使用至少 5 份样品进行验证，覆盖全部样品类型，无菌样品类型包含阴性和阳性结果。
实验室应优先使用已知结果的留样样品，当不可获取时可采用模拟样品。
4.3.2.2 检验程序按临床标本常规方式处理,由本岗位工作人员使用实验室检验程序进行涂片制备、染色、镜检、判读。
4.3.2.3 结果报告根据实验室程序文件规定进行结果报告，其中抗酸杆菌应根据“分级报告标准”报告镜检结果。
4.3.3 可接受标准每项检查的比对结果符合率≥80% 。
4.4.1 血培养血培养检验程序包括从病人血液采集、运送、接收、孵育及监测的全过程。
目前临床实验室广泛使用全自动血培养系统。
临床微生物实验室血培养系统性能验证的主要目的是评估系统使用的培养基能否用于培养临床常见微生物（包括酵母菌、厌氧菌、苛养菌等）以及仪器（自动化系统）能否及时检测出血液中的大部分病原菌。
微生物学--分枝杆菌属
（3）结果分析：
阳性 注射部位硬结 红肿直径0.5-1.5cm之间。这表明机 体曾感染过结核，出现超敏反应，但不表示患结核病；
强阳性 硬结直径超过1.5cm以上,表明可能有活动性结核, 应进一不检查;
（3）镜检：荧光染色后抗酸杆菌菌体呈黄绿色或 橙色荧光。
（4）报告：
-
0条/70视野
+ -（可疑） 70个视野发现1-2条抗酸杆菌
1+
50个视野发现2-18条
2+
每10个视野发现4-36条
3+
每个视野发现4-36条
4+
每个视野发现36条以上
〈三〉分离培养与鉴定
1 分离培养：分固体培养基培养法和液体培养基培养法（仪 器法）
〈五〉其它检验方法
〈1〉鉴别培养基法（手工法） 〈2〉PCR反向膜探针杂交ELISA法（PCR杂交法） 〈3〉DNA探针 〈4〉16SrRNA基因序列测定 〈5〉高效液相色谱（HPLC）检测分枝菌酸 〈6〉核酸检测 用PCR法快速诊断结核分枝杆菌感染
第二节 非结核分支杆菌
一、分类
不产色菌 光产色菌 暗产色菌
2 鉴定试验：近年来由于AIDS的急剧增加，使得 非结核分枝杆菌引起的AIDS合并分结核分枝杆菌 病不断出现。因此必须对临床分离出的分枝杆菌 做菌种鉴定，为结核病和非结核分枝杆菌病的临 床鉴别和防治提供科学依据。
〈四〉免疫学检验
1 结核菌素试验
（1） 原理：结核菌素有两种，一为旧结核菌素（OT）其 中主要成分为旧结核菌素，即结核分枝杆菌蛋白，现已不 用。另一种为纯蛋白衍生物（PPD），每0.02μg为1u。 注入皮内后如受试者已感染结核，则结核菌素与致敏淋巴 细胞特异性结合，在局部释放淋巴因子，形成迟发型超敏 反应性炎症，若受试者未被感染过结核则无反应。
临床微生物实验室血培养操作标准
临床微生物实验室血培养操作标准1 范围本标准规定了血培养标本临床微生物检验的技术要求。
本标准适用于开展血培养的临床微生物实验室。
2 术语一套血培养：从同一穿刺点同时采集的血液标本，分别注入需氧和厌氧瓶；静脉输液港：一种植入皮下，可长期留置在体内的静脉输液装置；HACEK菌群：嗜沫嗜血杆菌、伴放线放线杆菌、人心杆菌、啮氏艾肯菌和金氏金菌；血培养污染率：一般由凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌、芽孢杆菌、痤疮丙酸杆菌和微球菌等污染引起的阳性瓶占总送检瓶数的比例。
3 导言人体血液中有很多物质，包括溶菌酶、白细胞、免疫球蛋白、补体等，可在几分钟内将入侵血流的微生物清除。
当微生物感染超出人体免疫系统的防御能力时，人体不能将微生物局限于原始感染的部位，或在治疗中不能通过切除、引流等措施清除感染源，那这些微生物将侵入血液迅速繁殖形成菌血症或真菌血症。
一过性菌血症常发生于对感染灶的外科处理、黏膜的创伤操作和易污染的外科手术，亦可发生于全身或局部感染的早期；间歇性菌血症常发生于腹腔等部位未能及时引流的脓肿；持续性菌血症常发生于感染性心内膜炎等血管内膜感染以及伤寒和波浪热的最初几周。
菌血症是临床急症，应尽快采集血液进行培养。
血培养是对入住急诊科、ICU患者、移植患者以及静脉插管患者的败血症进行早期诊断的一种方法，并根据阳性血培养病原菌的药物敏感性试验，可为临床医生提供最佳的抗菌药物治疗方案，对降低病死率有很大帮助，血培养对于临床诊断和预后评估也具有重要的意义。
4 血样采集和培养瓶接种4.1 采血指证可疑感染患者出现以下一种或几种特征时，可以考虑采集血培养：发热（≧38℃）或低温（≤36℃），寒战，白细胞计数增多（计数＞10.0×109 /L，特别有“核左移”时）或减少（计数＜3.0×109 /L），皮肤黏膜出血，昏迷，多器官衰竭，血压降低，C反应蛋白、降钙素原（PCT）、1，3-β-D-葡聚糖（G试验）升高及突然发生的急性呼吸、体温和生命体征改变。
临床微生物学检验技术-第15 分枝杆菌检验
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3.结核分枝杆菌抗体检测
活动性MTB感染的快速诊断方法之一。 检测血清中的结核IgG抗体， 简便、快速、敏感性高，但存在一定的假阳性。 胸膜结核、腹腔结核的体腔液、结核性脑膜炎的脑脊液中，
结核抗体滴度明显高于血液标本。 胶体金、蛋白芯片检查结核杆菌IgG抗体，针对三种抗原
结核分枝杆菌进入机体后使机体对细菌再次入侵有免疫力， 而当细菌或其成分从体内彻底消失后机体的免疫力也随之消失
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二、临床意义
(三) 变异
易发生形态、菌落、生长温度、毒力以及耐药性的变异 可失去细胞壁变为L型细菌 易产生耐药性，出现多重耐药菌株 ，引起多重耐药结核
病（MDRTB） 卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是有毒力的牛
对区别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌有重要意义 结核分枝杆菌热触酶试验阴性 –硝酸盐还原试验、烟酸试验和烟酰胺酶试验阳性，牛分枝 杆菌阴性，有助于鉴别两菌
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三、主要生物学特性
（五）抵抗力
– 四怕： 对乙醇敏感 对湿热敏感 对紫外线敏感 对抗结核药物（链霉素、异烟肼、利福平等）敏感， 但易产生耐药性
主要应用结核分枝杆菌RD1区域编码的早期分泌抗原靶 （ESAT）和培养滤液蛋白（CFP-10）作为特异抗原刺激细 胞检测。
方法：ELISA、ELISPOT
–标本接种于选择性培养基中(常用罗琴培养基）或青霉 素血琼脂培养基，其中含孔雀绿或青霉素可抑制杂菌 生长。
–37℃，5％～10％CO2培养8周 –结核杆菌出现干燥、呈颗粒状、灰白色菌落 –涂片染色为抗酸阳性
分枝杆菌属及检验
• 全球性卫生问题
– 是艾滋病高发区人群的首要死因
• 世界防治结核病日
– 3月24日
结核分枝杆菌 －－形态染色
• 细长略弯，丝状或分 枝生长
• 无芽孢，无鞭毛，无 荚膜,无菌毛
• 革兰染色阳性，不易 着色
• 抗酸染色阳性,菌体被 染成红色
• 结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1～ 4X0.4μm。牛分枝杆菌则比较粗短。分枝杆菌属的 细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特 别是有大量分枝菌酸(mycolic acid)包围在肽聚糖层
※液体培养基：形成菌膜， 有毒株呈索状生长
• 初次分离需要营养丰富的培养基。常用的有罗氏 （Lowenstein-Jensen）固体培养基，内含蛋黄、 甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑
制杂菌生长，便于分离和长期培养。蛋黄含脂质
生长因子，能刺激生长。根据接种菌多少，一般 2～4周可见菌落生长。菌落呈颗粒、结节或花菜 状，乳白色或米黄色，不透明。在液体培养基中
教学大纲
• 掌握内容
– 结核分枝杆菌主要生物学性状；致病物质及 致病机制；结核菌素试验原理及应用；微生 物学检查法
• 了解内容
– 麻风分枝杆菌的形态染色特性、致病性及微 生物学检查法
• 全世界有1/3人口，19亿人已感染结核分枝杆 菌，15岁以下儿童感染者达1.8亿，每秒种就有一 人感染，全球有2 000万活动性患者，新发病例 1 000万人，每年有300万人死于结核，死于结核的 人数超过AIDS疾病、腹泻及热带病死亡人数的总 和，是传染病死亡最多的。近年来AIDS的发病率 上升，伴随结核病上升。我国解放前结核严重流 行，发病率大于1%，有十痨九死之称，建国后人 民生活水平提高，卫生条件的改善，抗痨药物的 发现，特别是积极开展防痨工作，接种BCG，发 病率和死亡率大大降低，但近年来有抬头趋势。
医院微生物室细菌的形态检查操作规程
医院微生物室细菌的形态检查操作规程
一、不染色标本的检查
压滴法和悬滴法。
主要用于检查生活状态下的细菌的动力及运动状况。
将特制好的标本置于显微镜载物台中央，先以低倍镜观察，再用高倍镜观察。
结果：有鞭毛的细菌呈穿梭似流星状运动(有明显的方向性)：无鞭毛的细菌呈布朗运动(只在原地颤动而无位置的改变)。
二、细菌染色标本的检查
染色的第一步是制作涂片。
菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布。
菌落涂片时，先取生理盐水l滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。
涂片时必须注意应轻轻操作。
猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。
制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。
将固定后的涂片进行染色。
2.1、革兰染色
本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。
染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。
2.1.1、试剂。
医院检验微生物作业指导书
1.目的规范微生物实验室内部质量控制，确保临床报告的质量。
2.适用范围微生物实验室的所有检验项目。
3.职责实验室检验人员均需熟知并遵守本程序。
4.程序4.1分析前质量控制4.1.1检验申请单：临床医生应按照《微生物检验项目申请程序》申请临床微生物检测口头申请追加样本检验项目，必须在样本有效期内申请.并补正式的检验申请单。
4.1.2生成微生物检验标本标签：护士应在核对医嘱患者信息和检验申请信息后，按照《微生物检验标本条形码程序》生成申请单和微生物检验项目标签，并将微生物检验项目标签正确张贴于标本容器上。
4.1.3样本采集手册：实验室应制订样本采集手册，指导正确采集和处理样本。
4.1.4样本采集和运输：样本采集人员应按照《采样前患者识别程序》确认患者，按照《标本采集、运送、保存程序》采集样本，并在规定的时间和温度范围内，使用指定的运输培养基，安全运送到微生物室。
4.1.5样本的接收：样本接收人员应严格按照《标本接收、标识及信息录人程序》《标本拒收程序》对样本接收或拒收，并记录。
4.1.6微生物检验标本信息输人：微生物实验室接种岗位检验人员严格按照相关的微生物标本检验信息输，人程序录人，核对患者信息和标本信息等资料。
4.1.7样本储存：微生物实验室接种岗位检验人员按照相关的微生物标本检验前储存程序正确铺存未能及时处理的标本，已经检验的样本应在保证其性质稳定的条件下，将样本以适当的方式保留到规定时间内，以便能在出具结果报告后可以复查，成做补无检食。
4.2分析中质量控制4.2.1试剂的质量控制4.2.1.1所有试剂用于检测标本前，必须做质控以验证试剂性能并记录质控结果，只有质控合格才可使用（表2-1-1）。
质控应遵循以下原则。
4.2.1.1.1使用中的染色剂（革兰染色、特殊染色和荧光染色），至少每周（若检测频率小于每周1次,则实验当日）用已知阳性和阴性（适用时）的质控菌株检测。
4.2.1.2平行试验：新批号试剂使用前须用老试利或参考材料平行试验。
质谱仪标准菌株验证方案及流程
质谱仪标准菌株验证方案及流程
质谱仪标准菌株验证方案及流程如下：
1.采用荧光定量PCR的方法，使用染料法和探针法对致病微生物进行快速筛查。
每次试验时用阴性和阳性标准菌株做质控，以确保仪器灵敏度高。
2.临床微生物学检验的目的是为临床提供及时、准确的病原体检验证据和指导感染性疾病的诊治。
细菌的鉴定方法包括血清学鉴定、生化鉴定、全自动鉴定仪、核酸检测、质谱技术等。
3. 基于QuanID微生物质谱系统，融智生物可提供结核分枝杆菌一体化高通量、高自动化解决方案，包括对人结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌进行种以及更高水平的鉴定，并能高效地为结核病诊断提供有价值的检测结果。
4. 为了满足鉴定准确性的要求，须采用新鲜培养的菌株，分枝杆菌需培养至观察到明显菌落。
5. 质谱仪的出现将会逐渐改变现有的诊断模式，其简便、快速、高通量和高准确性将使临床微生物实验室受益。
分枝杆菌属及检验考点总结
分枝杆菌属及检验考点总结一、结核分枝杆菌引起人和动物结核病的病原菌。
目前已知在我国引起人类结核病的主要有人型和牛型结核分枝杆菌。
（一）生物学特性1.形态与染色G+，细长或略带弯曲的杆菌，在培养基中可呈球状或丝状，陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可见到分枝状。
抗酸菌。
既往在组织中曾发现革兰阳性的非抗酸颗粒，接种动物可产生典型的结核病变，后被称为Much颗粒。
2.培养特性◆专性需氧，在无氧条件下迅速死亡，在5%～10%C02环境中可刺激其生长。
需适当的湿度。
本菌生长缓慢，最快的分裂速度为18h一代。
◆固体培养基：2～6周才能长出菌落，呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄色，表面呈皱纹状，形似菜花。
◆液体培养基中生长较快，多为表面生长，形成菌膜，且干燥易碎而沉于管底。
有毒力菌株在液体培养基中可呈索状生长，无毒株则无此现象。
◆营养要求较高，必须在血清、卵黄、马铃薯、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基上才能生长。
3.生化反应◆不发酵糖类，能产生过氧化氢酶，耐热触酶试验、聚山梨酯-80水解试验和耐热磷酸酶试验均为阴性，脲酶试验和中性红试验均为阳性。
◆人型结核分枝杆菌：烟酸试验、硝酸盐还原和烟酰胺酶试验均为阳性；牛型结核分枝杆菌均阴性。
4.抵抗力：对酒精敏感。
5.变异性：形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。
毒力变异：卡介苗（BCG）——将有毒的牛型结核分枝杆菌培养。
于含有甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年传种230代，获得减毒菌株，再接种动物，不能致病而使其获得免疫力。
用于预防结核病。
（二）临床意义1.致病性◆不产生内毒素和外毒素，也无荚膜和侵袭性酶。
◆主要致病物质：脂质。
索状因子（破坏细胞，引起肉芽肿）、磷脂（形成结核结节）、硫酸脑苷脂（抑制吞噬体与溶酶体结合）、蜡质D（引起迟发性过敏反应）。
◆主要通过呼吸道、消化道和受损伤的皮肤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起的肺结核最多见。
◆肺外感染可发生在脑、肾、肠及腹膜。
sop微生物检查操作规程
sop微生物检查操作规程1目的建立微生物限度检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。
2 范围适用于本厂质监科化验室对本厂生产的固体制剂及物料进行微生物限度的检查。
3 责任化验员有责任按照本操作规程进行检验、判定,并对检验结果负责。
4 定义微生物限度检查法是指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包含染菌量及操纵菌的检查。
5 内容5.1 总则：5.1.1供试品应随机抽样。
通常抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
5.1.2 供试品在检查前不得开启，检查全过程均应严格遵守无菌操作规程，严防再污染。
5.1.3 操纵菌的污染检查应做相应的已知菌参照试验，参照菌株为大肠杆菌[CMCC（B）44102]，每批试验已知菌加入量为50-100个。
5.1.4 染菌量的检查或者操纵菌的检查均应做空白参照试验。
5.1.5 供试品稀释成稀释液后应在均匀状态下取样，凡有抑菌成份或者防腐剂的供试品应做特殊处理后进行检验。
5.1.6 供试品稀释后应在1小时内操作完毕。
第2页/共6页5.1.7 除另有规定外，细菌培养温度为30-35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25-28℃，操纵菌培养温度为36℃±1℃。
5.1.8细菌、霉菌检验结果的报告以1g、1ml或者10cm2为单位；操纵菌检验报告以每1g、每1ml或者每10cm2为单位报告“检出”或者“未检出”。
5.2仪器、用具恒温培养箱、隔水式生化培养箱、电子天平，移液管(1ml、10ml)、试管、离心管、双碟、镊子、剪刀、不锈钢吸管筒、酒精灯、取样勺、称量纸、研钵一个、不锈钢双碟筒。
5.2.1用具的包扎移液管：用纱布包住移液管，然后放入不锈钢灭菌筒内。
试管、双碟：试管在管口塞上纱布棉塞、双碟放入不锈钢双碟筒内。
无菌衣、裤、帽、口罩：用布口袋将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。
5.2.2用具的灭菌将包扎好的用具，在121±0.5 ℃蒸汽灭菌柜中灭菌30 分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却灭菌物品内蒸汽凝造成负压，易致染菌，应置烘箱烘干。
临床微生物学血培养操作规范
临床微生物学血培养操作规范中华医学会检验医学分会编者按：根据卫生部指示，中华医学会检验医学分会成立了《临床检验操作规范》编写组。
《临床微生物学检验操作规范》是该规范的一部分。
该规范在撰写过程中始终坚持先进性、科学性、实用性和可行性的指导原则，在查阅文献和总结经验的基础上，完成了编写任务。
其间曾举行多次审稿会，对讨论稿进行了充分地研讨和修改。
为了使检验界临床微生物学同行尽快参照执行《临床微生物学检验操作规范》，本刊将陆续刊登该规范1～10专题，每期1个专题，以飨读者。
希望广大检验医学人员在学习、执行该规范的同时提出意见，以便再版时修改。
当微生物侵入血液迅速繁殖超出免疫系统清除这些微生物的能力时形成菌血症或真菌菌血症。
一过性菌血症常发生于对感染灶的外料处理、黏膜的创伤操作和易污染的外科手术，亦可发生于全身或局部感染的早期；间歇性菌血症常发生于腹腔等部位未能及时引流的脓肿；持续性菌血症常见于感染性心内膜炎等血管内膜感染，亦常发生于伤寒和波浪热的最初几周。
血培养常见菌：革兰阴性菌主要包括大肠埃希菌、肺炎克雷柏菌、肠杆菌，伤寒沙门菌、绿脓假单胞菌、不动杆菌属等；革兰阳性菌主要包括金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、念珠菌属等。
菌血症是临床医学急症，尽快采集血液进行培养。
一、血标本采集和运送1.采血指征：一般患者出现以下一种体征时可作为采血的重要指证：发热（≥38℃）或低温（≥36℃），寒战，白细胞增多（计数大于10.0×109/L,特别有“核左移”时），皮肤黏膜出血、昏迷、多器官衰竭，血压降低，C反应蛋白升高及呼吸加快，血液病患者出现粒细胞减少，血小板减少等，或同时具备上述几种体征时而临床可疑菌血症应采集血液培养。
新生儿可疑菌血症，应该同时做尿液和脑脊液培养。
对入院危重感染患者应在未进行抗菌药物治疗之前，及时做血培养。
2.皮肤消毒程序：严格执行以下三步法：（1）70%酒精擦拭静脉穿刺部位待30s以上。
微生物实验室sop
临床微生物学检验(sop)确保高压效果的可靠性。
【适用范围】蒸气式高压锅。
【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。
【操作方法】1．将水加到高压锅内至其刻度线，将欲灭菌物品放入锅内，关闭锅门，拧紧螺丝并确认已经封闭。
2．打开排气阀。
3．打开蒸汽开关，向锅内输入蒸汽或接通电源，使产生蒸汽。
4．观察排气阀的排气情况，待排出的气体由冷气变为蒸汽，压力表达到0.05mPa 时，关闭排气阀。
5．观察压力表，当压力升至0.15mPa时，开始计时。
6．压力达0.15mPa后，可调节进气阀，减少进气量，维持压力并使其稳定在0.15mPa。
电加热时，可切断电源，维持压力持续15分钟，至多不超过30分钟，否则营养物质破坏。
7．关闭进气阀门或切断电源，让锅内物品自然冷却，不可马上打开排气阀，以免发生意外。
8．待锅内压力降为零时，可打开锅盖，取出物品。
操作人员部门主管质量负责人姓名 ****** ****** ****** 日期 **年**月**日确保培养箱温度恒定。
【适用范围】各种类型隔水式、温度设定为27℃、35℃、42℃、56℃培养箱。
【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。
【操作方法】1．培养箱应放置于水平地面（或坚固的水平台），电源电压须匹配。
2．从注水口先将隔水箱内的水注满到浮标要求的位置。
3．将温度调节旋扭调至所需温度，然后将电源开关拨至“开”处。
4．每次使用时应在培养箱顶部插入标准温度计，监测实际温度。
5．培养箱工作温度波动范围应控制在±10C以内。
6．培养箱正面贴有温度记录表，记录每天上班和下班时温度，如温度超出正常范围，指示该温度的刻度应划上红圈，并把修正温度记录下来。
7．培养箱内外应保持清洁。
操作人员部门主管质量负责人姓名 ****** ****** ******日期 **年**月**日保证培养基的质量。
食品微生物实验室操作规程
食品微生物实验室操作规程1. 实验室介绍本实验室是专门进行食品微生物研究的实验室，主要用于检测食品中的微生物污染程度、菌落计数和微生物鉴定等工作。
为保障实验结果的准确性和实验人员的安全，制定了以下实验室操作规程。
2. 实验前准备2.1 实验人员在进入实验室前应穿戴实验服，并佩戴帽子、口罩和手套，尽量减少污染源的产生。
2.2 实验前需要检查实验室的消毒情况，确保操作台、试验器具和其他设备的清洁度满足实验要求。
2.3 实验前需要准备好所需的培养基、试剂和实验器具，并进行必要的消毒处理，以防止外源性微生物的污染。
3. 样品处理3.1 样品采集：在进行实验前，实验人员需要根据实验要求，选取符合要求的食品样品进行采集。
采集时需要注意避免外界环境污染，并尽快将样品送到实验室进行处理。
3.2 样品预处理：根据实验项目要求，对样品进行以下处理：去除外表污物、切碎或研磨等。
3.3 样品稀释：根据实验要求，将样品进行适当的稀释，以保证实验所需的微生物数量在可计数范围内。
4. 细菌培养与计数4.1 培养基制备：根据实验要求准备所需的培养基，并按照说明书配制培养基的浓度和pH值。
4.2 细菌分离：将样品中的微生物进行分离培养。
根据实验要求，将适量的样品接种到培养基中，并进行相应的温度和时间培养。
4.3 细菌计数：通过落菌计数法或涂布平板法，对细菌进行计数。
根据实验要求，在培养基上进行菌落计数，并记录结果。
5. 微生物鉴定5.1 细菌鉴定：根据细菌的形态、生理和生化特性，进行细菌的初步鉴定。
通过显微镜观察菌落形态和细胞形态，以及进行相关的生理和生化试验，进行进一步的鉴定。
5.2 真菌鉴定：根据真菌的产孢器、菌丝和孢子形态等特征，进行真菌的初步鉴定。
通过显微镜观察菌落形态和微观形态，以及进行相关的生理和生化试验，进行进一步的鉴定。
5.3 结果验证：对鉴定结果进行复核和验证。
通过对鉴定结果进行交叉验证和对照，确保鉴定结果的准确性。
分枝杆菌属、诺卡菌属、放线菌属鉴定—麻风分枝杆菌(微生物检验课件)
微生物学检查法
❖ 显微镜检查可从患者鼻粘膜或皮损处取材，用抗酸性染色后 检查
❖ 一般瘤型和界线类患者标本中可找到细菌在细胞内存在，有 诊断意义
防治原则
❖ 无特异性预防方法，隔离 ❖ 早发现，早治疗 ❖ 目前多采用二三种药联合治疗
麻风分枝杆菌
(Mycobacterium.leprae)
❖ 俗称麻风杆菌，引起麻风，是一种慢性传染病 ❖ 流行广泛，主要分布在亚、非和拉丁美洲
生物学性状
❖ 形态、染色与结核分枝杆菌相似 ❖ 麻风分枝杆菌是一种典型胞内菌
麻风细胞
❖ 体外人工培养至今仍未成功
犰狳
致病道 也可通过接触传染
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微生物检验实验室分枝杆菌属检验标准操作规程
1. 概述
分枝杆菌属是一类细长的、具有分枝生长趋势的需氧杆菌，因具有耐受或抵抗酸和乙醇脱色的特点，又称为耐酸或抗酸菌。
分枝杆菌属至今已发现80多个种，除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌外，其他分枝杆菌，如堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等，统称为非结核分枝杆菌。
2. 标本类型
痰液、体液（包括脑脊液、腹水、胸水）组织，粪便等标本。
3. 鉴定
3.1 形态与染色：菌体细长，或稍弯曲，两端钝圆，大小为（0.2~0.5um）
×（1~5um）。
革兰染色不易着色，抗酸染色呈红色。
以痰液直接涂片，结核分枝杆菌多为单个存在，有时呈V、Y、人字形排列，痰菌量多时可排列为束状或集聚成团。
荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下观察呈金黄色荧光。
3.2 培养特性：结核分枝杆菌生长缓慢，繁殖一代约需18h，因此在罗氏固
体培养基上需要培养2~6星期方可见到菌落。
菌落多为粗糙型，不透明，乳白为米黄色，呈干燥颗粒状，形似菜花。
液体培养基中结核分枝杆菌生长较快，可形成表面菌膜或沉
于管底。
3.3 生化反应：不发酵糖类，耐热触酶、耐热磷酸酶和吐温80水解试验均
阴性，尿素酶、中性红、结核分枝杆菌烟酸、烟酰胺酶和硝酸盐还原试验均阳性。
3.4鉴别要点：
3.4.1 本菌特征：菌体细长，抗酸染色呈红色；生长缓慢，菌落乳白或米黄
色，呈干燥颗粒状，形似菜花状；不发酵糖类，尿素酶、中性红试验阳性。
3.4.2 与牛分枝杆菌的鉴别：结核分枝杆菌菌体细长，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阳性；牛分枝杆菌菌体较短、较粗，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阴性。
3.5 操作步骤
3.5.1 中性培养基
3.5.1.1 标本的处理
痰液：挑取约5ml痰液至已标记的50ml离心试管中，加等量的2%N-乙酰
半胱胺-氢氧化钠前处理液（去污染）；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.
体液（包括脑脊液、腹水、胸水）：无菌体液直接接种；标本量>10ml,离心3000r/min，15分钟，取沉淀物接种；污染标本，须同痰液处理方法后再接种。
组织：加1gNALC至组织上溶解组织；加5ml7H9肉汤，以剪刀或研磨器将
组织均匀研碎；取约5ml研磨液至标记的50ml离心试管中，加等量的2%N-乙酰半胱胺-氢氧化钠前处理液；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.
粪便：挑取约1g粪便至已标记的50ml离心试管中，；加5ml7H9肉汤，混匀；等量的2%N-乙酰半胱胺-氢氧化钠前处理液（去污染）；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.
3.5.1.2 固体培养基接种无菌毛细管吸取消化液后标本0.1ml,滴于中性罗
-琼培养基，将接种过的斜面来回晃动，使菌液均匀铺于斜面上，斜面朝上放37 恒温箱内培养。
每一标本同时接种2支。
3.5.1.3 液体培养基接种标本接种前，在BBL MGIT
便培养管中先加入0.5ml营养添加剂（OADC）和0.1ml杂菌抑菌剂（PANTA）。
接种0.5ml标本至BBL MGIT培养管中。
若一次处理标本较多，可用营养添加剂（OADC）直接溶解杂菌抑菌剂（PANTA），在BBL MGIT培养管中0.8ml混合添加剂；然后接种0.5ml标本至BBL MGIT培养管中。
3.5.2 酸性培养基培养在约5ml痰液中加入等量的4%nNaOH溶液，漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟。
无菌吸取消化后标本0.1ml滴于酸性罗-琼培养基，将接种过的斜面来回晃动，使菌液均匀铺于斜面上，斜面朝上放37 恒温箱内培养。
每一标本同时接种2支。
3.6 结果观察
3.6.1 固体培养基接种后3日、7日观察，此后，每周观察一次。
阳性结果涂片证实随时报告。
若7日内报阳，则为快速生长菌，超过7日则为缓慢生长菌。
阴性结果至8周后报告，必要时可延长。
3.6.2 液体培养基系统每天自动记录信号的变化而测知有无分枝杆菌生长，阳性结果经涂片证实后报告。
4. 检验结果解释与分析
4.1 固体培养基报告方式
菌落生长不足斜面1/4 分枝杆菌培养阳性（N个细菌）。
菌落生长占整个斜面1/4 分枝杆菌培养阳性（1+）。
菌落生长占整个斜面1/2 分枝杆菌培养阳性（2+）。
菌落生长占整个斜面3/4 分枝杆菌培养阳性（3+）。
菌落生长铺满整个斜面分枝杆菌培养阳性（4+）。
培养8周仍无菌落生长分枝杆菌培养阴性
4.2液体培养基报告方式
42日内系统显示养阳性，涂片染色抗酸杆菌阳性分枝杆菌液体培养阳性。
42日内系统显示养阳性，涂片染色为非抗酸杆菌阳性标本污染，请重送。
42日内系统显示养阴性，涂片染色为无细菌生长分枝杆菌液体培养阴性。
5.药敏
6. 质量控制
以结核分枝杆菌H37RV为阳性质控，大肠杆菌ATCC25922为阴性质控，每次检测均进行质量控制。
7. 临床意义
结核分枝杆菌为结核病的病原体，不产生内、外毒素，其毒性物质为索状因子硫脂。
人类对其有较高的易感性，最易受损的器官是肺，绝大多数由呼吸道入侵导致感染和发病，很少经消化道和接触感染。
人类初次感染以后有较高的免疫力，可阻止入侵的细菌经淋巴-血流播散，但不能预防再感染。
8.安全防护
8.1 所有操作均在生物安全柜中进行。
8.2 检验人员操作时要穿隔离衣，戴口罩和手套。
8.3 痰盒、试管、离心后上清液、剩余或废弃物标本等污染物装入生物危险袋中，先浸泡消毒，再放入防漏容器中经高压灭菌30分钟后，才能丢弃或清洗。
8.4 实验结束后以75%酒精喷洒安全柜台面；必要时对地面和墙面进行消毒，每周至少一次；清洗完毕，安全柜至少工作15分钟后关机。
打开安全柜及实验室紫外灯消毒2小时。
培养阳性标本的保存参见菌种保存程序。
参考文献
[1]ISO15189；2003医学实验室---质量和能力认可准则
[2]严碧涯,端沐宏瑾主编.结核病变.北京:北京出版。