蛋黄卵磷脂的分离提纯及鉴定研究_高兆建

有文献报 道[ 8] , 用己烷 -异丙醇 混合溶剂 溶 解的粗磷脂通过聚 丙烯半透膜 , 收集流过膜 的溶 液 , 蒸发溶剂 , 可使粗卵磷脂得到纯化 。日本也在 试验应用膜分离技术制备高纯度卵磷脂 , 将磷脂溶
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于溶剂中 , 形成微胶囊 , 根据不同分子量进行膜分 离 , 得到不同分子量的磷脂组分 , 从而制得高纯卵 磷脂产品 。
1.5 乙ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ化法
在蛋黄中存在的 磷脂主要是卵磷脂和脑磷脂
产品开发·试验研究
肉类工业
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(比例较少)。为得到更纯的卵磷脂产品 , 必须将粗 卵磷脂中的脑磷脂除去 。 乙酰化法就是利用这两种 磷脂化学性质的不同而进行分离的 。脑磷脂能与醋 酸或乙酸乙酯等配化剂发生酰化反应 , 而卵磷脂不 能发生此反应 , 即可纯化卵磷脂 。有专利报道[ 12] , 采用乙酰化法用向日葵磷脂制备高纯卵磷脂 , 其方 法是 :将磷脂溶于氯仿溶液 , 室温下 , 加醋酸进行 酰化反应 , 反应完毕后用乙醚进行萃取 , 再用丙酮 进行 沉淀 , 沉淀物又用乙酸进行溶解 , 即可得到 高纯卵磷脂 。
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蛋黄卵磷脂的分离提纯及鉴定研究
高兆建 , 甄宗圆 , 贺稚非 , 李绶章 , 李洪军 , 祝荣 (西南农业大学食品科学学院 重庆 400716)
摘要 主 要阐述了分离提纯高纯度蛋黄卵磷脂的常用方法 及近几年的 最新研究 成果 , 对适合 于大量制备 和
1.6 超临界二氧化碳萃取法
超临界萃取法是近几年来迅速发展的一项新技 术 。 在萃取卵磷脂中也得到了很好的应用 。 较好的 萃取剂为二氧化碳 , 它无毒无味无残留 , 化学性质 稳定 , 不易燃烧且对天然产物成分具有很强的溶解 能力 , 制取费用低且易取得高纯度气体等一系列优 点 , 因此在萃 取卵磷脂中使用 的萃取剂是二 氧化 碳 。它在临界温 度 31.06 ℃和临界 压力 7.38 MP a 以上时变为超流体状态 , 兼有气态和液态的双重优 点 , 即具有气体高的扩散系数和低的黏度 , 又具有 液体的高密度优点和对物质的高的溶解能力 。所以 CO2 在超临界状态下对特定物质的溶解能力极强 。 在超 临界范 围内 , 调整 CO 2 流体的 温度 和压力 , 密度则会发生大幅度变化 , 由此它对物质的溶解能 力则会发生较大变化 。利用不同密度下的 C02 流体 对物质的溶解能力的差别即可实现对物质的分离 。 当使 CO 2 的压力较低时 , 它会变为气体状态 , 从 而将它溶 解的溶质释放 出来 , CO 2 气 体再循环 使 用 。本项目通过大量试验得出了超临界 CO2 萃取 卵磷脂的具体方法和工艺参数 。具体如下 :将萃取 缸中的 CO2压力调整 35 M Pa , 温度为 50 ℃;分离 缸中的压力调 为 6 MPa , 温度为 35 ℃, 萃取 时间 为 4 ～ 5h , 流量为 20kg/ h 。在此工艺条件下可把蛋 黄粉中的脂肪和胆固醇总量的 95 %以上萃取出来 , 剩余在萃取缸中的则为蛋白质和卵磷脂的混合物 。 再通过用超临界 CO 2 与乙醇夹带剂萃取残 留的蛋 黄粉中的卵磷脂 , 与不溶物质蛋白质 , 可获得高纯 度的卵磷脂产品 。有资料报道[ 13] :选择乙醇作夹 带剂可提高卵磷脂在超临界 CO2 流体中的溶解度 , 提高乙醇夹带剂与 CO2 流体的流量比 , 有 利于提 高磷脂在超临界 CO2 中的溶解度 , 流量比 不应小
1.3 半透膜分离法
此种分离方法主要是利用膜对组分的选择透性 而将特定组分分离出来 , 半透膜上分布着一定孔径 的大量微孔 。孔径的大小决定了分离物质的分子量 或粒度大小 。通过膜的组分以膜两侧的浓度剃度为 推动力进入到膜的另一侧 。利用膜的这种被动传递 形式将组分分离开 。 粗卵磷脂中含有一定量的蛋白 质 、 中性脂肪 、 脑磷脂 、 鞘磷脂等杂质 , 它们的粒 度大小 、 分子量与卵磷脂的有较大区别 , 所以它们 通过半透膜的难易 程度不同 , 由此卵磷脂得 到分 离。
装置 , 还未形成工业化生产规模 , 技术水平也落后 于世界先进水平[ 5] , 生 产蛋黄卵磷脂 的厂家则更 少 。国内的卵磷脂产量远远不能满足市场需要 , 因 此大部分卵磷 脂特别是高纯度卵磷脂 仍然依靠进 口。
1 卵磷脂的分离提纯
1.1 溶剂分离技术
溶剂分离技术是一种传统的分离提纯卵磷脂的 方法 。 它是根据蛋黄中各组分在溶剂中的溶解度不 同进行分离的 。 分离时 , 所用溶剂一般为 c1 --c4 的 低 级醇 、 正 己烷 、 石 油醚 、 乙 醚 、 氯 仿 、 丙酮等 。卵磷脂在低级醇中溶解度较大 , 脑磷脂和 鞘磷脂在低级醇中溶解度较小 , 但卵磷脂不溶解于 丙酮 。调整溶剂的 pH 值 , 温度 , 浓度 , 蛋白质发 生变性 、 沉淀 。利用此性质将蛋黄粉和一定量的有 机溶剂一起搅拌 , 调整 pH 值 , 静置 , 离心 , 沉淀 部分为蛋白质 , 上清液则为中性脂肪和卵磷脂的混 合物 。 将此溶液进行减压浓缩 , 去除溶剂 。由于卵 磷脂不溶于丙酮而中性脂肪易溶 , 再用丙酮对混合 溶液进行萃取 , 即可分离出卵磷脂 。 此种方法是先 去除蛋白质后 , 然后分离卵磷脂和中性脂肪 , 也可 以先去除蛋黄油 , 再分离卵磷脂和蛋白质 。具体做 法是[ 6] :精确称取 20 g 蛋黄粉 , 加入石油醚 30 ml 升溶解 , 再加入 0 ～ 5 ℃的丙酮到 500 ml , 然后分 装到 10 个 50m l 离心管中 , 冰槽中放置 15 min , 用 3 000 rpm 的离心机离心 10 min 。 将上清液加丙酮 同上处理 。 最后 95 %的 乙醇和 沉淀 物混合 搅拌 , 静置 , 取上清液 , 利用旋转蒸发仪浓缩 , 即可得到
另有资料[ 10] 报 道 , 1.5cm ×40cm 的色谱 柱 , 以硅 胶为 吸附 剂 , 用剃 度 差为 V (CH3OH ):V (CHCl3) = (1∶2) ～ (2∶1)的甲醇/ 氯仿混合液 (pH 值为 3 ～ 4)进行凹型剃度洗脱 , 可以对卵磷 脂进行分离 , 洗脱剂仅为柱体积的 5 ～ 6 倍 , 洗脱 时间仅为 6h 左右 。
1.2 无机盐复合沉淀法
卵磷脂可与金属离子发生配合反应 , 形成配合 物 , 生成沉淀 。 利用此种性质 , 可以把卵磷脂从有 机溶剂中分离出 来 , 由此除去 蛋白质 、 脂肪 等杂 质 , 再用适当溶剂分离出无机盐和磷脂杂质 (主要 是脑磷脂 、 鞘磷脂), 这样可以大大提高卵磷脂的 纯度 。CaCl2 , M yCl2 , Z nCl2 均可与卵 磷脂发生 配 合反应形成复盐 , 但 CaCl2 和 M yCl2 提取卵磷脂较 低 , 且毒性较大 , 所以 ZnCl2 是较理想的沉淀剂 。 据资料报道[ 7] , 用 ZnCl2 乙醇纯化卵磷脂的具体方 法是 :将 100 g 粗卵 磷脂溶于 1L 95 %的乙醇中 , 再加入 4.5 g Z nCl2 , 生成淡黄色卵磷脂 ZnCl2 复盐 沉淀 , 离 心 分 离 此 沉 淀 物 , 在 氮 气 保 护 下 , 用 25ml 冰丙酮与沉淀物混合 , 搅拌 1h , 可得到含量 高达 99.5 %的卵磷脂 。
卵磷脂 (lecithin)是一种含磷的类脂类生理活 性物质 , 同时 又是一种天然 表面活 性剂[ 1～ 2] , 化 学名称为磷脂酰胆碱 。常态下 , 它呈淡黄色的透明 或半透明的粘稠状 , 等电点 pH 值是 6.7 。 卵磷脂 广泛分布于动植物组织中 , 在植物性原料中 , 大豆 含量较高 ;动物性原料中蛋黄含卵磷脂最多 , 达干 物质总重的 8 %～ 10 %。
空间结构的卵磷 脂分子是由一个 极性的 “ 头 部” (甘油和胆碱磷酸脂部分)和两条非极 性的 “尾巴” (两个依附于甘油主框架上的脂肪酸) 组 成 , 它是典型 的两性电解质[ 3] 。 极性部分磷酸 上 的 H +和胆碱上的 OH —均可解离 , 呈两性 , 所以 磷酸 、 胆碱和不解离的甘油具有亲水性 ;而非极性 部分具有亲油性 , 故卵磷脂是优良的表面活性剂 , 具有很好的乳化性能 。同时 , 它是构成人体生物膜 的重要组成成分 (所有细胞膜 、 核膜 、 线粒体 、 肉 质网膜等生物膜的基础构成物质 , 还主要集中在大 脑 、 神经系统 、 免疫系统及心 、 肝 、 肾 、 生殖腺等 重要器官内), 也是人体必需的胆碱和必需脂肪酸 的重要来源[ 3] 。因此 , 卵磷脂被广泛应用于食品 、 医药 、 化工 、 石油 、 纺织等诸多领域 。 在食品工业 中 , 它可 作为乳 化剂 、 抗 氧化 剂 、 润饰 剂 、 软 化 剂 、 分散剂 、 脱模剂等 。 在医药方面 , 治疗动脉粥 状硬化 、 脂肪肝 、 神经衰弱 、 营养不良及静脉注射 脂肪乳的乳化剂和胆固醇结石的预防药物 。
1.4 柱层析法
柱层析法是一种高灵敏度 、 高效的分离技术 , 它在分离纯化卵磷脂方面得到了广泛应用 。在层析 柱内装有层析剂 , 它是 分离中的固定 相或分离介 质 , 它由基质和表面活性官能团组成 。基质是化学 惰性物质它不会与目的产物和杂质结合 , 吸附柱层 析和离子交换柱层析常被采用 。 对活性官能团而言 它则会有选择地与目的产物或杂质产生或强或弱的 结合性 。当移动相中的溶质通过固定相时 , 各溶质 成分与活性基团的吸附力和解吸力不同 , 由此它们 在柱内的移动速度产生差异 , 因此将目的产物分离 出来 。有关资料[ 9] 报道 了用吸附柱层 析制备高纯 度卵磷脂的方法 , 具体如下 :取 7.3 kg 蛋黄 , 用 9L 乙醇萃取两次 , 接着用乙醇 -己烷混合液萃取 三次 (体积比分别为 :3∶4 、 2∶4 、 1.5∶3.5), 分离 己烷上清液 , 过硅胶柱 , 用乙醇 -己烷 -水 (体积 比为 60∶130∶120) 洗脱 , 可 获卵 磷 脂含 量 高于 97 %的产品 。
对于离子交换层析而言 , 离子交换树脂作为固 定相 , 它是一种不溶于酸 、 碱和有机溶剂的固态高 分子材料 。 可以说 , 离子交换树脂是一类带有官能 团的网状骨架 , 连接在骨架上的官能团和官能团所 带的相反电荷的可交换离子 。当溶液流过柱时 , 由 于溶质所带电荷性质和电荷量的不同 , 因而在固定 相和移动相之间发生可逆交换作用 , 使各溶质移动 速度产生差异 , 从而得到分离 。 专利报道[ 11] 将粗 磷脂 200 g 溶于 2 L 热甲醇中 , 冷却 , 取上清液 , 用 2.5 L 80 %的甲醇溶液稀释 , 过 XAD -2 型离子 交换柱 , 柱温保持 20 ℃, 用 4.65 L 90 %的甲醇溶 液洗脱 , 可获得 63.2 g 卵磷脂 。
实验 室少量制备的溶剂分离技术 、 无机盐复合 沉淀法 、 半透膜 分离法 、 柱 层析法 、 乙酰化 法 、 超临界 二氧化 碳 萃取 法等进行了探讨 ;同时也简要概述了分析 、 鉴定卵 磷脂的 高效液相 色谱 、 薄 层层析 、 紫外光谱 、 红外光 谱 分析等技术 。
关键词 卵磷脂 蛋黄 分离提纯 鉴定
2003 年第 4 期总第 264 期 15
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卵磷脂 。 利用有机溶剂进行萃取时 , 有机溶剂的种类 ,
用量浓度 , 萃取的温度 、 时间 , 搅拌时间 , 溶液的 pH 值 , 萃取的次数等因素都会对萃取效果产生重 大影响 。 抽提卵磷脂时使用二元或者多元溶剂往往 比单一溶剂优越 , 同时温度不宜过高 , 这是因为卵 磷脂在高温下 , 不饱和脂肪酸极易氧化失去生理活 性 。同时溶液的 pH 值也不宜在碱性条件下 , 因为 弱碱或强碱环境中卵磷脂易发生分解 , 丧失生理活 性。
近年来 , 世界 卵磷脂 发展迅 速 , 年 产量达 到 150Kt 。美国中央黄豆公司 、 ADM 公司 、 Riceland 公司 、 德国 Lucas M ayer 公司等生产的数 10 种卵 磷脂几乎囊括了世界市场 。 目前 , 我国已经有 10 余家企业生产大豆卵磷脂 , 而且均是小规模的生产