安宫牛黄丸对脑外伤大鼠脑内载脂蛋白E合成的调节

实验研究论著安宫牛黄丸对脑外伤大鼠脑内载脂蛋白E 合成的调节 徐　震1　黄李法1　戴亚光1　王翼伟211浙江中医药大学附属第一医院　杭州　310006　21河北大学附属医院摘要:[目的]探讨安宫牛黄丸治疗脑外伤的机制。

[方法]给脑外伤大鼠灌服安宫牛黄丸药粉,采用逆转录—聚合酶链反应(R T 2PCR )对外伤后大鼠脑组织的载脂蛋白E m RNA 进行检测。

采用酶联免疫吸附剂测定(E L ISA )法测定脑外伤后脑脊液载脂蛋白E 的浓度。

[结果]安宫牛黄丸能显著增加外伤后脑组织载脂蛋白E mRNA 的表达和脑脊液载脂蛋白E 的浓度。

[结论]安宫牛黄丸可以通过增加脑外伤大鼠脑内载脂蛋白E mRNA 的表达和载脂蛋白E 的合成,从而促进受损神经系统的修复。

关键词:安宫牛黄丸;脑外伤大鼠;载脂蛋白;E mRNA中图分类号:R28515　文献标识码:A 文章编号:100525509(2010)0420487202E ff ects of A ngo ngniuhuang Pill o n t he Synthesis of A polipopr ote i n E in Bra ins of R a ts af ter T r aumat ic B r a in Injur y Xu Zhen 1,Huang Lif a 1,Dai Y agua ng 2,et al 11T he Fi rst A f f iliated Hospital of Zhejia ng Chinese Tr a ditional Me dicine College ,H angzhou (310006);21T he Af f ili ate d Hospital of Heb ei U niversityAbstra ct :[Objective ]To explore the effects of angongniuhuang pill o n t he synthe s i s of apolipoprotein E in brains of rat s afte r trau 2matic brain injur y 1[Methods]Using rever se tr anscription 2polymera se c hain reaction (R T 2PCR )a nd e nzyme linked immunosorbe nt assay (E L ISA ),the apolipoprotein E ’s mRNA of cont used brain tissue and the co ncent ration of apolipoprotein E in CS F at differe nt pha ses afte r traumatic br ain injur y were detected of rat s fe d wit h ang ongniuhuang pills 1[Re sult s]High exp ression of apolipoprotein E mRNA and high conce ntr ation of apolipoprotein E were found in r ats fed with a ngongniuhuang pills compar ed with controls 1[Conclusion ]Ang o ngniuhua ng pill s may increase the expression of apolipoprotein E mRNA in brains af ter t raumatic brain injur y ,thus promote the synthesizing a nd secreting of apolipoprotein E 1K ey w ords :a ngongniuhuang pill ;r ats wit h tra umatic brain injury ;apolipoprotein ;E mRNA 安宫牛黄丸具有解热、消炎、镇静、抗惊厥、复苏等[1]多种药理效应,目前仍是临床上常用的确有实效的抢救药。

在颅脑损伤患者的救治中取得明显的临床疗效[2]。

载脂蛋白E (apo E )是由肝、脾、肾等合成后进入血液循环广泛分布的胆固醇转运蛋白,同时它也是中枢神经系统中主要的载脂蛋白[3]。

载脂蛋白E 不能通过血脑屏障,中枢神经系统中载脂蛋白E 主要由星型胶质细胞合成。

近年来研究显示,载脂蛋白E 在中枢神经系统损伤的修复中发挥重要作用[425]。

本研究旨在探讨安宫牛黄丸对脑外伤后中枢神经系统载脂蛋白E 的合成和分泌的影响。

1　资料与方法111　实验动物与分组　健康SD 大鼠50只,由浙江中医药大学动物中心提供,雌雄各半,随机分为两组,每组25只。

I 组为安宫牛黄丸治疗组,脑损伤后每只每天予安宫牛黄丸0121g/2ml 灌服,共12d 。

II 组为对照组相应给予等量2ml 生理盐水。

112　动物模型制作　采用改进的Feeney 法[6],腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg )麻醉大鼠,头部消毒,沿正中线切开头皮,矢状缝右侧旁开2m m 、冠状缝后两毫米用牙科钻磨开一直径5mm 的骨窗。

取50g 砝码从高处落下,撞击在骨窗内硬膜上,锥体下陷深度3。

模型制成以后在立体定向仪引导下取得脑组织并行侧脑室穿刺留置静脉留置针针管,作为引流管,用于收集脑脊液,末端封闭后固定于颈项部皮肤。

113　脑组织mRNA 的表达　分别在伤后即时、3、7、13d 在立体定向仪引导下取挫伤灶周围脑组织100μl ,采用半定量逆转录—聚合酶链反应(R T 2PCR)进行检测。

取挫伤脑组织置冻存管,存于液氮中备用。

采用T rizol 总试剂进行脑组织总RNA 提取,然后逆转录合成cDNA 第一链,在DNA 循环合成仪上进行PCR 扩增,质量分数为115%的琼脂糖凝胶电泳。

应用凝胶成像分析系统对条带扫描,计算apoE mRNA RT 2PCR 产物条带平均吸光度值,以G AP 2DH 作为内参照,将apoE 条带吸光度值与相应G APDH 吸光度值比较,得出apoE mRNA 的相对含量。

114　脑脊液载脂蛋白E 浓度的测定　分别于伤后30mi n ,3、5、7、9、11、13d 从侧脑室留置管中缓慢抽取脑脊液100μl ,采用EL ISA 方法测定脑脊液apo E 含量。

第一抗体羊抗人apoE 抗体(GαE/E ),第二抗体辣根过氧化酶(GαE/EPO )标记抗体。

操作步骤是微孔板加稀释的第一抗体置4℃过夜。

用0105%Tween20冲洗,加011%络蛋白置37℃1h ,用15%T 冲洗,加稀释脑脊液样本和标准品,置℃孵育过夜(～6),用15%　浙江中医药大学学报2010年4月第34卷第4期20cm mm 00wee n20apoE 4121h 00徐　震,等:　安宫牛黄丸对脑外伤大鼠脑内载脂蛋白E 合成的调节t ween20冲洗,再加稀释第二抗体和正常羊血清,置37℃孵育2h,加四甲基苯(TMB)置37℃,20min。

最后用215mol/L硫酸终止反应。

比色:405nm波长,在标准曲线对数坐标上,计算出apoE的浓度。

115　统计学分析　所有数据采用sta ta统计软件进行。

计量资料以均数±标准差(x±s)表示,P<0105为差别有统计学意义。

2　结果211　脑组织m RNA的表达检测结果　安宫牛黄丸灌服组apo E m RN A的表达明显增强,与II组比较其差异具有统计学意义(P<0105),见图1。

图1　安宫牛黄丸组和对照组脑组织不同时期apoE mRNA的表达212　脑脊液载脂蛋白E浓度测定的结果　安宫牛黄丸灌服组脑脊液apo E的浓度明显增高,与II组比较其差异具有统计学意义(P<0105),见图2。

图2　安宫牛黄丸组和对照组脑脊液不同时期apoE浓度(mg/L)3　讨论安宫牛黄丸在临床上主要用于神志昏迷之窍闭证。

现代药理研究发现安宫牛黄丸具有醒神、强心、解痉的作用,可保护血脑屏障,降低毛细血管通透性,提高脑组织对缺血缺氧的耐受性[7211]。

本实验研究结果显示灌服安宫牛黄丸组在伤后随着时间的推移脊液载脂蛋E的浓度明显高于对照组。

灌服安宫牛黄丸组脑组织中apo E的m RNA的表达量随时间推移较对照组明显增加(P<0105)。

因此安宫牛黄丸是通过增加apo E的mRN A来影响受伤中枢神经apoE的合成。

但是对于安宫牛黄丸影响脑内载脂蛋白E合成是否还有其它机制的参与尚不清楚。

此外我们的结果表明两组大鼠在脑外伤后脑内apoE m RNA的表达及脑脊液apo E的浓度均随时间而增加,在以后达到高峰,而后出现下降趋势,并且脑脊液载脂蛋白的浓度与脑组织载脂蛋白mRNA的表达相一致。

而Iwat a[12]等对脑外伤大鼠研究结果认为apoE m RNA表达的增加从外伤后4d开始持续到伤后1月左右,而载脂蛋白E的浓度在脑外伤后2d左右达到高峰(即在apoE m RNA表达增加之前),两周以后降致基础水平,然后在伤后6个月内逐渐升高。

和我们的结果不一致,可能和选用的大鼠品种不同、实验方法不同及我们的实验时间较短,测定次数较少有关。

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