pYEPlac195酵母表达载体说明
pPIC9k-His酵母表达载体说明
其他酵母表达载体：
p416GFD p53blue pACT2-AD pAD-GAL4-2.1 pADH2 pAUR123 pBridge pCL1 pDEST32 pDisplay pDR195 pESC-His pESC-Leu pESC-TRP pESC-URA pFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pFLD pFLD/CAT pFLDα pGADT7-T pGAG424 pGAPZA pGAPZB pGAPZαB pGAPZαC pGBKT7 pGBKT7-53 pGBKT7-Lam pHIC-PI pHIL-D2 pHIL-S1 pHis2 pHisSi-1 pPIC9 pPIC9K pPIC9k-His pPICZA pPICZB pPICZC pPICZαA pPICZαB pPICZαC pPICZαD pPICZαFC pPICZαGB pPink-HC pPink-LC pPinkα-HC pRS316 pRS403 pRS405 pRS406 pRS414 pRS415 pRS416 pRS41H pRS426 pRS426gal pSEP1 pSEP2 pSEP3 pSos pSos-MAFB pUG66 pYC2/CT pYC2/NTA
载体名称
pPIC9k-‐His
Invitrogen pPIC9k-‐His 酵母表达载体 -‐-‐ -‐-‐ 多克隆位点，限制性内切酶 -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ Ampicillin -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐
pMETA pMETB pMETC pMETαA pMETαB pMETαC pMyr pPIC3.5 pPIC3.5K pPIC6B pPIC6C pPIC6αA pPIC6αB pPIC6αC pYX212 SUMOprotease Ycp22lac-EGFP
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。
有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。
一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。
毕赤酵母表达操作手册(PDF精译版)
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
pDR195酵母表达载体说明
pDR195编号 载体名称北京华越洋生物VECT2970 pDR195载体基本信息出品公司: Addgene载体名称: pDR195质粒类型: 酵母菌表达载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝启动子: PMA1克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 6318bp5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: -‐-‐载体抗性: Ampicillin筛选标记: URA3备注: -‐-‐产品目录号: 36028稳定性: -‐-‐组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 非病毒载体质粒图谱和多克隆位点信息载体序列ORIGIN1 cccagcctcg agcggccgcg cggatccagc tttggacttc ttcgccagag gtttggtcaa 61 gtctccaatc aaggttgtcg gcttgtctac cttgccagaa atttacgaaa agatggaaaa 121 gggtcaaatc gttggtagat acgttgttga cacttctaaa taagcgaatt tcttatgatt 181 tatgattttt attattaaat aagttataaa aaaaataagt gtatacaaat tttaaagtga 241 ctcttaggtt ttaaaacgar aattcttatt cttgagtaac tctttcctgt aggtcaggtt 301 gctttctcag gtatagcatg aggtcgctct tattgaccac acctctaccg gcatgccaat 361 tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 421 cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 481 cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc 541 cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc ataatcggat cgtacttgtt acccatcatt 601 gaattttgaa catccgaacc 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gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 4021 caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 4081 taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 4141 ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 4201 aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 4261 agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 4321 atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 4381 tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 4441 tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 4501 gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg4561 taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 4621 aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 4681 ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 4741 catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 4801 ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 4861 ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 4921 agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 4981 taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 5041 atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 5101 cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 5161 ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 5221 accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 5281 gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc 5341 gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg 5401 agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta 5461 tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca 5521 gctatgacca tgattacgcc aagcttcctg aaacggagaa acataaacag gcattgctgg 5581 gatcacccat acatcactct gttttgcctg accttttccg gtaatttgaa aacaaacccg 5641 gtctcgaagc ggagatccgg cgataattac 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pESC-URA pPinkα-HC pFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pRS316 pFLD pRS403 pFLD/CAT pRS405 pFLDαpRS406 pGADT7-T pRS414 pGAG424 pRS415 pGAPZA pRS416 pGAPZB pRS41H pGAPZαB pRS426 pGAPZαC pRS426gal pGBKT7 pSEP1 pGBKT7-53 pSEP2 pGBKT7-Lam pSEP3pHIC-PI pSospHIL-D2 pSos-MAFB pHIL-S1 pUG66pHis2 pYC2/CT pHisSi-1 pYC2/NTA pMETA pYC2/NTB pMETB pYCP211 pMETC pYEPlac112 pMETαA pYEPlac195 pMETαB pYES2pMETαC pYES2-EGFP pMyr pYES2-kan pPIC3.5 pYES2-NTA pPIC3.5K pYES2-NTB pPIC6B pYES2-NTC pPIC6C pYES3/CT pPIC6αA pYES6/CT pPIC6αB pYES-DEST52 pPIC6αC pYIP211 pYX212 pYIP5 SUMOprotease pYRP7Ycp22lac-EGFP Ycplac33。
所有质粒载体汇总
pEZZ18 pkk232-8,pkk 233-3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK（+）,pBlueScript SK（-） pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C, 大肠杆菌冷激质 粒： pColdI pColdII pColdIII pColdTF 原核共表达质粒：pACYCduet1,pETduet-1,pCDFduet-1，pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴 侣： pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞： DH5a JM101 JM103 JM105 JM107 JM109 JM110 Top10 Top10F BL21（DE3） HB101 ER2529 E2566 C2566 MG1655 XL-10gold XL blue M15 JF1125 K802 SG1117 BL21（AI） BL21（DE3）plysS TG1 TB1 DH5a（pir） Tuner（DE3） Bl21 codonplusRIPL Novablue（DE3） Rosetta Rosetta（DE3） Rosetta（DE3）plys Rosetta-gami（DE3） RosettagamiB（DE3）, Rosetta-gamiB（DE3）plysS Orgami（DE3） OrgamiB（DE3） HMS174（DE3） 植物表达/RNAi载体农杆菌pBI121,pBI121-GFP,pBI101,pBI221,pSN1301, pUN1301,pRTL2 , pRTL2-GFP , pRTL2-CFP, pRTL2-RFP , pRTL2YFP,pCAMBIA 1300, 1301, 1302,1303,1304,1305, 1381Z,1391Z,2300, 2301,3300,3301,pCAMBIA super1300,pCAMBIA super1300GFP,pPZP212,pPZP2121,pPZP212-GFP,pGDG,RNAi载 体pART27,pHANNIBAL,pKANNIBAL, pFGC5941,pTCK303, pTRV1,pTRV2, T-DNA插入载体（随机突变体库）pSKI015,pSKI074,真 菌ATMT载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP,pBHt1 枯草芽孢杆菌表达载体pWB980,pHT43,pHP13,pHP43, pBE2,pMUTIN4,pUB110,pE194,pMA5, pMK3,pMK4,pHT304,pHY300PLK, pBest502,pDG1363,pSG1154,pAX01, pSAS144,pDL,pDG148-stu,pDG641, pAL12,pUCX05-bgaB,pHT01， 配套 菌株BS 168,WB600,WB800,WB700, WB800N,1012,FZB42,1A747,广宿主 质粒pVLT33
所有质粒载体汇总
酿酒酵母表达载体pYES2,ｐYES２／NT,ｐYＥS２/CT,pYES3,pYES6,pYCｐlａｃ2２-GＦP,酵母载体pAUR12３,pRS３03TEF,pRS30４, pRS305,pRS306,ｐY13ＴEF,ｐY14TEＦ,pY１５TEF,pＹ16TEF,酵母基因重组表达载体pUG6,pＳH４７,酵母单杂载体pHISｉ,pLacZi,pHIＳ2, pGＡD4２4, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187,酿酒酵母AＨ109;质粒pGADＴ7,pGBＫT７;对照质粒pGBKT7－5３,pGBKT７-lam,pGＡDＴ７-T,PCＬ1,酿酒酵母菌株ＩＮＶＳc1,YM42７1, AH109,Y1８７,Y１９0,毕赤酵母表达载体pPＩＣ9K,pPIC9Ｋ-His,pPＩＣ3.5K,ｐＰICZalｐhaＡ,B,C,ｐP ＩCZA,B,C,ｐGAPZαA,ｐAＯ8１5,pPIC9k-Hｉs,pＨIL-S1,pＰink ｈc,配套毕赤酵母Pｉcｈiaｐiｎk,毕赤酵母宿主Ｘ33,KＭ７１,KM71H,GS115,原核表达载体pQＥ30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括ｐET系列,ｐＥT-GST,pGEX系列(含GＳT标签),pMAL系列pMＡL-c2x,－c4x,－c4e,-c5x,-p5x,pＢＡD,pBAＤHis,ｐＢADmycHis系列,ｐQE系列,pＴｒｃ9９a,pTrcＨis系列,pＢV２2０,22１,222,pTＸＢ系列,ｐLＬP-oｍpA,pIN-III-ompA(分泌型表达系列),pQBI6３(原核表达带荧光)pEＴ3a, pET 3d, pET 11a,ｐEＴ12a, ｐEＴ14b, ｐＥT 15b, pＥT 16b, pＥT 17b,pET 19b, pET 2０b, pET 21a,b,d, pET ２2b,ｐET ２3a,ｐET 23b, pET24a,b,pET ２5ｂ, pET 2６b, ｐEＴ27b, pET ２8a,b, pET 29a,pET 30a, pET 31b, pET32a, pEＴ35b, pET 38b, pEＴ３９b,pET 40b, pEＴ４１ａ,b pET 42a,pＥT 43、1ａ,b pET 44ａ, ｐEＴ49ｂpEＴ３０2,303 pET His,pET Dsｂ,ｐET GST,ｐＥT Trx pＱE2, ｐQE9 pQE30,31,32, pQE 4０ｐQＥ７０pQE80L pＱＥTirs sｙstem pR ＳET-A pRSEＴ-B pRSET－C pGEX4T-1,-2,－3,５ｘ-１,6p-1,６p-2,2ｔk,3c ｐＢV22０,221,222 ｐTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAＤＨｉsＡ,B,C pPinPoiｎｔ-Ｘa1,Xa2,Xａ3 pMALc2x, p2x pＢV220 pGEM Ex1, pGEＭ7ZF(+), pＴrｃ99Ａ,ｐTwin1, pEZZ18ｐkk232－８,pｋk ２33-３,pAＣYＣ１８4,pBR３２2,ｐUC119 pＴYB1,pTYB2,pTYB4,pTＹB11 pＢlueＳcript SK(+),pＢlueSｃript SK(－) ｐLＬP ompA, ｐＩNIIIomｐA,ｐMＢP-P,pＭBP-Ｃ, 大肠杆菌冷激质粒: p ＣｏｌdＩpColｄII ｐColdIIＩpCｏldTF 原核共表达质粒:pＡCYCｄuet－1,ｐＥTｄuet-1,pＣＤFdｕｅt-1,ｐＲＳFduet－1 Ｔakara公司大肠杆菌分子伴侣: p Ｇ-KＪＥ8 ｐGro7 pKJE7 pＧＴｆ２ｐTf１6 大肠杆菌宿主细胞: DH5a JM101 JＭ103 ＪＭ105 JM107 JＭ１０9JM110Top1０Toｐ１０F ＢL21(ＤE３) HB１01 ER252９Ｅ２５66 C256６MＧ1655XL－10goｌd ＸＬblue Ｍ15 JＦ11２5K802 SＧ111７BL21(ＡI) BL21(DＥ3)plysS TG1 TB1 DH5ａ(ｐir) Tuner(DＥ3) Bl21 codonplusRIPL Novablue(ＤE3)RosettａＲｏsetｔa(DE3) Ｒoseｔｔa(DＥ３)plysＲosetta－ｇamｉ(ＤＥ3) Ｒｏseｔta-ｇａmiＢ(DＥ3), Ｒｏsettａ-ｇａmiB(DＥ3)plysS Orｇami(DＥ３)ＯrｇamiB(DE3) HMS174(DＥ3)植物表达／ＲNＡi载体农杆菌pＢI121,pBＩ12１-ＧFＰ,pBI101,pＢI2２1,pSN1301, pＵN1３01,pRTL２, pRＴL2-GFP ,pRTL2-CFP,pRTL2-RFＰ, pRＴL2-YFP,pCAMＢIＡ１３00, １301, １３0２,１303,１304,１305, 1３8１Z,13９1Z,230０, 2301,330０,３301,pＣAMBIA suｐer13００,ｐCAMBIＡsupeｒ1300－GFＰ,pPZＰ212,pＰＺP２1２1,pPZP21２-ＧＦP,pGDG,RNAi载体pART2７,ｐHAＮＮIBAL,pＫAＮNIBＡL,pＦGＣ５9４1,pTＣK303, pTRV１,pＴRV ２, T－ＤNＡ插入载体(随机突变体库)pSKＩ0１5,ｐSKI07４,真菌ＡTＭT载体p ＢＩG2RHPＨ2-GUＳ-GFＰ,ｐＢHt1枯草芽孢杆菌表达载体pWB980,ｐＨT4３,pHP１３,pHＰ４3, pBE2,pMUTＩN4,pUB11０,ｐＥ1９4,ｐMA5, pMＫ３,ｐＭK４,pHT304,pHY300PLK, pＢest5０2,pDＧ1363,pSG1154,pＡX01, ｐＳAS1４4,ｐDＬ,ｐDG148-stu,pDG641,ｐA Ｌ12,ｐUＣX０5-ｂgaB,pHT0１,配套菌株ＢS １６８,WＢ60０,ＷB800,WB7００, WB800N,1０１2,FZB42,1A7４７,广宿主质粒ｐＶＬT３3RNＡi基因沉默干扰敲除载体pSilenｃer1、0,pSｉlencer ２.１-U６hｙｇｒo, pSｉlenｃer 3.1-H1hygｒo,pSilencer 3、１-H1 neo,ｐSileｎcer 4、1-CMＶne ｏ, pSileｎｃｅｒ4、1－CMV puro pMIR－RＥPORT Lｕciferase RNＡi载体(olｉｇoｅngine) pSuｐer-puro RＮＡｉ逆转录病毒载体(cloｎtｅｃh): RＮＡi －Ｒｅady pＳＩREN-Retro Q, RNAi-Reａdy ｐＳIＲEN-ＲｅtroQ-ZsGreeｎ(LuｃiferasｅshRNＡAnneａlｅdＯlｉgonucｌeotiｄe) RNＡi慢病毒载体(addgeｎe): pLKO.1哺乳动物表达载体ｐｃDNA3、1＋/-,pｃDNA4/HｉsＭax B,pSecTaｇ2 A,pVAＸ1,pBｕdCE4.1,pTrａcer CMＶ２,pcＤNＡ３、1(-)/ｍyc－Ｈis A ,pcDNA6-Ｍｙc/His Ｂ,pＣEＰ4,ｐIRES,pIRＥSnｅo,pIRES hyg3,pCMＶ-ｍyc,pCMV－HA,pＩRES-puｒｏ３,ｐIＲＥS-neo3,pCAGGS哺乳动物双杂交系统pACＴ,ｐBIND,pACＴ-MyｏD,pBＩND-Ｉd,pG5luc,pＣMＶ-BD,pCMV－AD, pBD-p5３, ｐＦR-ｌuｃ,CｙtotraｐＴwo－HybrｉｄSysｔem:ｐSｏs, pSoｓMAFＢ, ｐMｙr蜕皮激素诱导系统ｐＩND, ｐVｇＲxR,LacSwith ＩI哺乳动物诱导表达系统:ｐOPＲＳVI ,pOPI3ＣＡＴ,pCMVLacI,GｅneSwitcｈSyｓtｅm:pＳwiｔｃh哺乳动物表面展示系统:pDiｓplａy, 四环素调控系统(Invitrｏｇeｎ):pcＤNA4／TＯ／Myｃ-HiｓA,pcDＮA4/TO/Myc-HiｓB,ｐcDNＡ４/TO/Myc-Ｈis C,ｐｃDNA4/ＴO/Mｙｃ－His/ＬacＺ,pcDNA６/TR四环素调控系统(Cｌｏntech):pTeｔ-On,pTeｔ-Ｏff,ｐTRE2,pRevTRE,pReｖTｅｔ-On,ｐRevTet-off 信号通路报告载体:pＧAS-TA-Ｌｕc,ｐＳTAＴ3-TＡ-Ｌｕc,ｐISRE-TA－Lu ｃ, pTＡ-Luc,pIκB－EＧFＰ,pNFＡＴ-TA－Luc,pCasｐase3-sensor,pAP１(PMA)－Luc;pGL4.26[lｕc2P/ｍｉnＰ/Hｙgro],pGL4.２9[lｕc2Ｐ/ＣＲＥ/Hygｒｏ],pGL４.３0[luc2P/NFAT-RＥ/Ｈygｒo],pGL4、75;p５3-Luc,pAP-1-Lｕc, pNF-κB－Lｕc,pSRE-Lｕc,pFＡ２-Elk１,pFC-ＭＥKK,pFR-luc,Gaｔeｗａy系统(inviｔrｏｇen)pcDNＡ6、2－GＷEmＧFP-miR ｎegａtive, pＬeｎｔi6／TR,pcDNＡ6、２-GＷEmＧFP-mｉR,乳酸菌表达载体及各种乳酸菌乳酸杆菌菌株,pNZ8148,pLEISS,pMG3６e,ｐBB Ｒ1ＭCＳ-5,pBBＲ1MCＳ－6,ｐＲV61０,pLＥＭ4１5,ｐＨY300ＰLＫ,分泌型乳酸菌表达载体pVＥ5523,pＰG611、1,pＰG６１２.1等与乳酸杆菌菌株宿主菌NZ ９００0,ＭG13６3,Laｃtoｂaｃｉｌluｓcaｓei １.539,Ｌacｔｏbacｉｌｌuｓcasei,acidophilｕsＮCFM,1、2,Lactobaciｌｌus sａkei 23K,Ｌ、planｔaｒuｍ,L.rh ａmnosus GG,B、ｃoaguｌans,Biｆidobactｅrium ｂiｆiduｍ,Ｂifidｏbactｅrｉｕｍinfantis,Laｃtococcus lacｔｉs M17,1663,Lactobａcillus reuｔｅrii广宿主表达载体链球菌表达敲除载体假单胞菌表达载体pVLT33,pBBR1MＣS-2,3,4,5,6, ｐJＲD2１５,pJN105,ｐＭE60３２,Ｃos载体pLＡＦR３,pMP2444(ＧFＰ),pHY３00ＰLＫ,pＲT1０２,pRＬ１0６3a, 转座子载体ｐUT-minｉＴn ５,pMＧS100,pWHＭ10,pKＣ1139,pＳＥT１52,pOJ260,pPＧ６11、1,ｐPG6１2、1,腺病毒载体/慢病毒,逆转录病毒表达载体及包装包膜质粒,腺病毒系统(Strａtagene): pAdEａsy-1,pSｈuttle-CＭＶ,pShutｔｌe,pAdTrack,pAdＴracｋ-CＭV, ｐＳhuttle-ＩRＥS-ｈrＧＦP-１、pShuttle-IRＥS－hｒＧＦP-2、pShuttlｅ-CMV-lacZ, pShuｔtｌe－CMV-EGＦP-Ｃ,pXC1, pBHGE3, 配套大肠杆菌BＪ5183,2９３,２93T cｅll ｌｉｎe 腺相关病毒系统(Strataｇene):ｐAAＶ-MCS,pAＡＶ-RＣ,pHｅｌｐer,pAAV-LacZ,pAAＶ-IRES-hrＧFP,pＣMV-MCS,慢病毒载体:ｐLVX-DsRed-Ｍoｎomｅr－N1,pLVX－IREＳ－ZｓGreen1,pLVＸ-AcＧFP1-N1,Lｅｎti6/v5-EDST－EＧFP,pＷPXL, FＵGW,pLeｎｔilox 3、7,ＲNＡｉ－ReａｄｙpＳIREN-Reｔro Ｑ, RNＡi-Ready pSIREN－Retro Q－ＺsGreen, ｐSUＰEＲ、Rｅtro-ＧＦP／Neo,ｐＳUPER-Ｒetrｏ-Ｎeo, pSUPＥR.Retro-puro,PLＮＣＸPLNＣX2 pMＳＣV-HYG pMSCＶ-ｎeo ｐＭSCＶ-puro pLEGFP-C1 ｐLＯX-CW-CRE pＬOＸ-GFP-IＲＥS-TK pRｅtｒoＸ－IREＳ-ＤsＲｅdExprｅsｓ, pLVX-ＩRＥS-ｍＣherry质粒载体。
真核细胞常见表达载体
真核细胞罕见表达载体之马矢奏春创作真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对, 主要由CMVp启动子、兔β-球卵白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成, 在年夜大都真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是, 由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在, 转染细胞后, 用G418筛选, 可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株.拔出外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点.注意在此载体中有二个EcoR1位点存在.2、pEGFP, 增强型绦色荧光卵白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光卵白, 在PCMV启动子驱动下, 在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成, 能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在年夜肠杆菌中的表达.用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点, 将外源基因扦入这些位点, 将合成外源基因和EGFP的融合基因. 借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位.亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1). 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光卵白/人肌动卵白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光卵白和人胞浆β-肌动卵白基因, 在PCMV启动子驱动下, 在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成, 能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在年夜肠杆菌中的表达.用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合卵白, 该卵白能整合到胞内正在生的肌动卵白, 因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动卵白的亚细胞结构.4、pSV2表达载体特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的, 克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性.此载体不含neo基因, 故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株.5、CMV4 表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动, 多克隆区域酶切位点选择性较多.含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点.但值得注意的是, 该表达载体不含有neo基因, 转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株. 其他经常使用克隆Vector：pBluscript II KS DNA 15 ugpUC18 DNA 25 ugpUC19 DNA 25 ug说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等.这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点, 当外源DNA片段扦入, 转化lacZ基因缺乏细胞, 并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时, 含有外源DNA 载体的细胞将为白色菌落, 而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落, 由此易于筛选有无外源DNA片段的载体.另外, 这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序. 保管液: TE BufferTE Buffer组成: 10mM Tris.HCL(Ph 8.0) 1mM EDTA用途:克隆外源DNA片断. 进行基因表达. 使用M13、T7和T3引物进行测序. 存在的问题细胞的生命活动是一个复杂的调控过程, 有些生命活动的机理还不完全清晰, 由于插人的目的基因分歧, 载体构建栗用的顺式组件分歧, 组装的空间位置分歧, 采纳的表达系统分歧, 目的基因表达水平和阳性克隆筛选率城市有很年夜不同.另外, 由于所有的顺式元件存在种属和组织特异性, 所构建的高效表达载体纷歧定在所有细胞株中均高效表达.再者, 细胞生长状态的不同, 转染方法的分歧培养时阉的长短, 筛选药物浓度的高低, 对表达量都有很年夜影响.所以, 需要综合评价一个表达载体和表达系统, 排除一些不定因素, 筛选出最佳组合真核表达载体趋向于既有利于扩增目的基因又有利于筛选阳性克隆的载体的构建.许多有效的应用范围广的强启动子和增强子被人发现并应用于载体中, 年夜年夜提高了目的基因的表达量, 另外一些强的组成型启动子, 如 SV40早期启动子+PHTLv, 已应用于年夜规模生产的细胞系中. 应用以GS为筛选标识表记标帜的表达载体可兼有筛选和扩增目的基因两种功能, 是目前研究的重点.以IRES连接的双顺反子表达载体已成为核表达载体的主体.在同一启动子操纵下, 筛选基因或陈说基因与目的基因转录在同一mRNA上通过IRES的作用, 表达出两种卵白, 因而在理论上可认为, 通过了筛选或表达了陈说基因的克隆必为阳性克隆, 即表达目的基因的克隆, 有报道说这种双顺反子的共表达率为90％.这就年夜年夜提高了筛选率, 简化了实验过程. 将强启动子、增强子和可扩增的筛选标识表记标帜组装在同一载体上, 构建高效表达和筛选的表达载体并将其运用于最合适的表达系统中, 是现今真核表达载体构建研究发展方向.。
pPICZ A酵母表达载体说明
pPICZ A编号 载体名称北京华越洋生物VECT2440 pPICZ ApPICZA载体基本信息出品公司: Invitrogen载体名称: pPICZA, p PICZ A质粒类型: 毕赤酵母蛋白表达载体表达水平: 高拷贝启动子: AOX1克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 3329 b p5' 测序引物及序列: 5´ A OX1:5´-‐GACTGGTTCCAATTGACAAGC-‐3´ 3' 测序引物及序列: 3´ A OX1:5´-‐GCAAATGGCATTCTGACATCC-‐3´ 载体标签: C-‐Myc, C-‐His载体抗性: Zeocin 博来霉素筛选标记: HIS4备注: 插入基因是必需包含起始密码子ATG。
产品目录号: -‐-‐稳定性: 稳定 Stable组成型: 组成型 Constitutive病毒/非病毒: 非病毒pPICZA载体质粒图谱和多克隆位点信息pPICZA多克隆位点pPICZA载体简介pPICZ A，B和C是3.3 k b的毕赤酵母蛋白载体。
表达的重组蛋白是融合蛋白，含有一个C-‐端多肽，多太重含c-‐myc和C-‐His标签。
载体能够在毕赤酵母中利用甲醇诱导的高水平的表达目的蛋白，并且可以用在任何毕赤酵母中，包括X33，GS115菌株，SMD1168H，KM71H。
pPICZ系列载体包含以下元素：•5'片段含有AOX1启动子的严格调控，利用甲醇诱导表达任何感兴趣的基因（Ellis等，1985; Koutz等人，1989;tschopp等人，1987A）。
•Zeocin抗性基因在大肠杆菌和毕赤酵母都能用于筛选（Baron等人,1992; D rocourt等人，1990）。
酵母表达手册
酵母表达手册
酵母表达系统是一种常用于生产重组蛋白质的方法，其利用酵母细胞作为宿主来表达外源基因。
以下是酵母表达系统的基本步骤：
1. 基因克隆和转化：将目的基因克隆到酵母表达载体中，常用的载体有质粒和整合型载体。
转化方法包括电转化和化学转化。
2. 重组蛋白表达：将转化后的酵母细胞接种到发酵罐中进行培养，在适宜的温度、pH和营养条件下，目的基因在酵母细胞中表达出重组蛋白。
3. 蛋白质纯化：通过一系列的纯化技术，如离心、过滤、沉淀、亲和层析等，将重组蛋白从酵母细胞中分离出来并进行纯化。
4. 蛋白质后处理：根据需要，对纯化的重组蛋白进行进一步的后处理，如去盐、脱色、除菌等。
5. 蛋白质检测：通过SDS-PAGE、Western blot等方法检测重组蛋白的表达水平和纯度。
6. 蛋白质功能研究：对纯化的重组蛋白进行生物活性检测和功能研究，如酶活测定、免疫分析等。
在实际应用中，需要根据不同的需求选择不同的酵母表达系统，如酿酒酵母表达系统、毕赤酵母表达系统等。
同时，还需要对重组蛋白进行质量分析和稳定性研究，以确保其用于后续的实验或生产中具有可靠性和有效性。
酵母表达系统步骤
酵母表达系统步骤毕赤酵母表达系统步骤（参考Invitrogen公司说明书）：一、pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存1取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB （含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。
2挑取转化子，甘油保存。
二、载体构建1将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。
2提质粒酶切鉴定或PCR鉴定3载体测序测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物三、线性化DNA1提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒）2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全；4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）；四、线性化DNA的去磷酸化处理线性化质粒43μlCIAP Buffer 5μlCIAP酶2μl四、总体积为50μl的样品37℃ 1h，过柱纯化，用30μl ddH2O 洗脱；五、感受态细胞的制备实验前准备：无抗性YPD平板一个、无抗生素液体YPD培养基，100μg/ml Zeocin YPD 平板和液体、50ml离心管两个、500ml预冷的无菌水、20ml 1M 山梨醇（灭菌预冷的），0.2cm预冷的电击杯；1YPD平板划线培养菌，30℃培养2-3d；250ml三角瓶中，加入5ml YPD，挑取酵母单菌落，30℃培养过夜；3吸取0.5ml菌液，加入至含有200ml新鲜YPD的1L三角瓶中，30℃，225rpm/min培养至OD值1.3-1.5；41500g，4℃离心5min收集菌体；540ml冰预冷的无菌水重悬沉淀；61500g，4℃,5min；730ml无菌水重悬；81500g，4℃,5min；910ml 1M 山梨醇重悬；101500g，4℃,5min；11加入1ml山梨醇，重悬冰上放置，直接做转化，或加入灭菌甘油每管80ul分装，冻存于-80℃(长时间保存会影响转化效率)；六、电击转化15-10μg线性化DNA（20μl<）与80ul上述感受态细胞混合，转移至预冷的0.2cm电击杯中（点击条件：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω，电击时间为4～10msec）；2冰上放置5min3电击（按生产厂商提供的适合酵母用的参数）4迅速加入1ml预冷的1M 山梨醇，转移至1.5ml EP管中530℃静置培养1-2h（如果要增加存活率，获得更多的转化克隆，可在30℃静置培养1h后，加入1mlYPD培养基，30℃200rpm培养1h后取部分涂布与不同浓度抗生素的平板）6取50、100、200ul分别涂布于含有Zeocin的YPD平板，30℃培养2-10 d至有菌落出现；7如果要筛选多拷贝转化子，将转化克隆混合在一起，涂布在Zeocin 浓度为500、1000、2000μg/ml的YPD平板，培养2-3d。
酵母菌表面展示操作步骤之载体选择与构建
酵母菌表面展示操作步骤之载体选择与构建酵母菌表面展示是一种重要的生物工程技术，在生物学研究、抗原制备和疫苗研发等领域有广泛应用。
在进行酵母菌表面展示实验前，我们需要选择适合的载体并进行构建，以实现目标蛋白的表面展示。
本文将介绍酵母菌表面展示实验的载体选择与构建步骤。
一、载体选择在酵母菌表面展示实验中，常用的载体有质粒和整合载体两类。
质粒载体是通过直接瞬时表达目标蛋白来实现表面展示的，而整合载体则是通过将目标蛋白融合到约束表面展示区域的酵母细胞膜蛋白上，以实现表面展示。
根据实验要求和目标蛋白的特性，我们可以选择适合的载体进行后续实验。
二、质粒载体构建1. 提取质粒：选择适合的质粒载体并进行提取，一般可使用常见的质粒提取试剂盒进行操作，并按照试剂盒说明书进行操作。
2. 构建质粒：将提取的载体与目标蛋白基因进行连接。
可以选择PCR扩增、酶切和连接等方法进行操作。
在连接时注意选择合适的连接酶，避免不必要的损失和错误连接。
3. 转化酵母细胞：将构建好的质粒导入酵母细胞内。
可以采用电穿孔、化学转化等方法进行转化。
转化后，将转化后的细胞分别接种于含有适当选择压力的培养基上，筛选出含有目标质粒的酵母菌株。
三、整合载体构建1. 目标蛋白选择：根据实验需要选择合适的约束表面展示区域的酵母细胞膜蛋白，并设计引物进行PCR扩增。
2. 构建整合载体：将扩增得到的目标蛋白基因与整合载体中相应的表达位点进行连接，常用的有插入杂交、连接酶法等。
连接后的整合载体经测序确认无误后，可继续进行后续实验。
3. 酵母细胞转化：通过适当的方法，将构建好的整合载体导入酵母细胞内，使其整合到酵母细胞染色体上。
4. 酵母菌培养与筛选：将转化后的酵母菌培养在选择性培养基上，筛选出能够稳定表达目标蛋白的酵母菌株。
四、确认载体构建效果1. PCR鉴定：通过PCR方法对含有目标蛋白基因的质粒或整合载体进行鉴定。
根据目标蛋白的特异性引物，可以进行PCR扩增，并通过电泳分析判断目标蛋白基因的连接情况。
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酿酒酵母表达载体pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP,酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF，pY15TEF，pY16TEF,酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47,酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109；质粒pGADT7,pGBKT7；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T，PCL1，酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,Y187,Y190,毕赤酵母表达载体pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZαA,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc，配套毕赤酵母Pichiapink,毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115，原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括pET系列，pET-GST，pGEX系列（含GST标签），pMAL系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis系列，pQE系列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA （分泌型表达系列）,pQBI63（原核表达带荧光）pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPinPoint-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF（+）, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk233-3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK （+）,pBlueScript SK（-）pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C, 大肠杆菌冷激质粒： pColdI pColdII pColdIII pColdTF 原核共表达质粒：pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1，pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣： pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞： DH5a JM101 JM103JM105 JM107 JM109 JM110 Top10 Top10F BL21（DE3）HB101 ER2529 E2566 C2566 MG1655 XL-10gold XL blue M15 JF1125 K802 SG1117 BL21（AI）BL21（DE3）plysS TG1 TB1 DH5a（pir）Tuner（DE3）Bl21 codonplusRIPL Novablue （DE3）Rosetta Rosetta（DE3）Rosetta（DE3）plys Rosetta-gami（DE3）Rosetta-gamiB（DE3）, Rosetta-gamiB（DE3）plysS Orgami（DE3）OrgamiB（DE3）HMS174（DE3）植物表达/RNAi载体农杆菌pBI121,pBI121-GFP,pBI101,pBI221,pSN1301,pUN1301,pRTL2 , pRTL2-GFP , pRTL2-CFP, pRTL2-RFP , pRTL2-YFP,pCAMBIA 1300, 1301, 1302,1303,1304,1305, 1381Z,1391Z,2300, 2301,3300,3301,pCAMBIA super1300,pCAMBIAsuper1300-GFP,pPZP212,pPZP2121,pPZP212-GFP,pGDG,RNAi载体pART27,pHANNIBAL,pKANNIBAL, pFGC5941,pTCK303, pTRV1,pTRV2,T-DNA插入载体（随机突变体库）pSKI015,pSKI074,真菌ATMT载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP,pBHt1枯草芽孢杆菌表达载体pWB980,pHT43,pHP13,pHP43,pBE2,pMUTIN4,pUB110,pE194,pMA5, pMK3,pMK4,pHT304,pHY300PLK,pBest502,pDG1363,pSG1154,pAX01, pSAS144,pDL,pDG148-stu,pDG641,pAL12,pUCX05-bgaB,pHT01，配套菌株BS 168,WB600,WB800,WB700,WB800N,1012,FZB42,1A747,广宿主质粒pVLT33RNAi基因沉默干扰敲除载体pSilencer1.0，pSilencer 2.1-U6 hygro， pSilencer 3.1-H1 hygro，pSilencer 3.1-H1 neo， pSilencer 4.1-CMV neo， pSilencer 4.1-CMV puro pMIR-REPORT Luciferase RNAi载体（oligoengine）pSuper-puro RNAi逆转录病毒载体（clontech）: RNAi-Ready pSIREN-Retro Q， RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen（Luciferase shRNA Annealed Oligonucleotide）RNAi慢病毒载体（addgene）: pLKO.1哺乳动物表达载体pcDNA3.1+/-,pcDNA4/HisMax B，pSecTag2 A，pVAX1，pBudCE4.1,pTracer CMV2，pcDNA3.1（-）/myc-His A ，pcDNA6-Myc/His B，pCEP4， pIRES，pIRESneo，pIRES hyg3，pCMV-myc，pCMV-HA，pIRES-puro3，pIRES-neo3,pCAGGS哺乳动物双杂交系统pACT，pBIND，pACT-MyoD，pBIND-Id，pG5luc,pCMV-BD, pCMV-AD, pBD-p53, pFR-luc,Cytotrap Two-Hybrid System:pSos, pSos MAFB, pMyr蜕皮激素诱导系统pIND, pVgRxR,LacSwith II哺乳动物诱导表达系统:pOPRSVI ，pOPI3CAT，pCMVLacI,GeneSwitch System:pSwitch哺乳动物表面展示系统:pDisplay, 四环素调控系统（Invitrogen）：pcDNA4/TO/Myc-His A，pcDNA4/TO/Myc-His B，pcDNA4/TO/Myc-His C，pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ，pcDNA6/TR四环素调控系统（Clontech）：pTet-On，pTet-Off，pTRE2,pRevTRE，pRevTet-On，pRevTet-off信号通路报告载体:pGAS-TA-Luc，pSTAT3-TA-Luc, pISRE-TA-Luc, pTA-Luc，pIκB-EGFP，pNFAT-TA-Luc，pCaspase3-sensor，pAP1（PMA）-Luc;pGL4.26[luc2P/minP/Hygro],pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro],pGL4.30[luc2P/NFA T-RE/Hygro]，pGL4.75;p53-Luc，pAP-1-Luc， pNF-κB-Luc，pSRE-Luc，pFA2-Elk1，pFC-MEKK，pFR-luc,Gateway系统（invitrogen）pcDNA6.2-GWEmGFP-miR negative, pLenti 6/TR,pcDNA 6.2-GW EmGFP-miR，乳酸菌表达载体及各种乳酸菌乳酸杆菌菌株，pNZ8148,pLEISS,pMG36e,pBBR1MCS-5,pBBR1MCS-6,pRV610,pLEM415,pHY3 00PLK,分泌型乳酸菌表达载体pVE5523，pPG611.1,pPG612.1等和乳酸杆菌菌株宿主菌NZ9000,MG1363,Lactobacillus casei 1.539,Lactobacillus casei,acidophilus NCFM,1.2,Lactobacillus sakei 23K,L.plantarum,L.rhamnosusGG,B.coagulans,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium infantis,Lactococcus lactis M17,1663,Lactobacillus reuterii广宿主表达载体链球菌表达敲除载体假单胞菌表达载体pVLT33,pBBR1MCS-2,3,4,5,6, pJRD215,pJN105,pME6032,Cos载体pLAFR3,pMP2444（GFP）, pHY300PLK,pRT102,pRL1063a, 转座子载体pUT-miniTn5,pMGS100, pWHM10,pKC1139,pSET152,pOJ260,pPG611.1,pPG612.1，腺病毒载体/慢病毒，逆转录病毒表达载体及包装包膜质粒，腺病毒系统（Stratagene）: pAdEasy-1,pShuttle-CMV,pShuttle,pAdTrack, pAdTrack-CMV, pShuttle-IRES-hrGFP-1、pShuttle-IRES-hrGFP-2、pShuttle-CMV-lacZ,pShuttle-CMV-EGFP-C,pXC1, pBHGE3, 配套大肠杆菌BJ5183,293,293T cellline 腺相关病毒系统（Stratagene）： pAAV-MCS，pAAV-RC，pHelper，pAAV-LacZ，pAAV-IRES-hrGFP，pCMV-MCS，慢病毒载体:pLVX-DsRed-Monomer-N1,pLVX-IRES-ZsGreen1,pLVX-AcGFP1-N1,Lenti6/v 5-EDST-EGFP,pWPXL, FUGW,pLentilox 3.7,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q-ZsGreen,pSUPER.Retro-GFP/Neo,pSUPER-Retro-Neo, pSUPER.Retro-puro,PLNCX PLNCX2 pMSCV-HYG pMSCV-neo pMSCV-puro pLEGFP-C1 pLOX-CW-CRE pLOX-GFP-IRES-TK pRetroX-IRES-DsRedExpress, pLVX-IRES-mCherry质粒载体。
2017-01-15 酵母表达系统 陈凯
甲醇的代谢途径
1）营养缺陷型菌株
2）蛋白酶缺陷型菌株
3、表达载体
由于毕赤酵母没有稳定的游离型载体，故应用整合型载体，通过 同源重组整合到酵母染色体来实现稳定表达。
分泌表达型载体
pPICZα A
EcoRI、XbaI、KpnI…… HIS4
α-Factor，Zeoncin
胞内表达型载体
常用启动子
4、转化及筛选鉴定
2、酿酒酵母分泌系统
1）信号肽结构：
2）常用分泌信号肽： ①性结合因子---MF-α； ②酸性磷酸酯酶---PHO5；
③蔗糖酶---SUC2；
3）信号肽特点： ①保守性低；
④ 杀手毒素因子KIL。
②大多异源宿主系统的信号肽不能互用；
4）MF-α信号肽： ①由88个AA组成； ②分泌效率高； ③在酵母系统具有通用性。
3、酿酒酵母糖基化系统
1）糖基化位点： Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸） 2）糖基化类型：
①N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，对蛋白
质的折叠、稳定性及活性较重要。
②O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化。
3）糖基化特点：过糖基化（超糖基化修饰）
4、酿酒酵母表达系统缺点：
2）G418平板筛选多拷贝 质粒上含有细菌的Kana基因（其与表达盒之间有遗传连锁），赋予毕 赤酵母遗传霉素抗性。 遗传霉素抗性水平主要依赖整合的kana基因的数目；每个单拷贝的基 因赋予毕赤酵母约0.25mg/ml的遗传霉素抗性水平。
五、外源基因表达优化
1、基因拷贝数（基因剂量）：
目的基因的拷贝数对表达量影响极大，不同的基因对拷贝数的要求不 同。因此，实验时要对不同拷贝的菌株进行表达量筛选。
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酿酒酵母表达载体pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP,酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF，pY15TEF，pY16TEF,酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47,酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109；质粒pGADT7,pGBKT7；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T，PCL1，酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,Y187,Y190,毕赤酵母表达载体pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZαA,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc，配套毕赤酵母Pichiapink,毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115，原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括pET系列，pET-GST，pGEX系列（含GST标签），pMAL系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis系列，pQE系列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA （分泌型表达系列）,pQBI63（原核表达带荧光）pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPinPoint-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF（+）, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk233-3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK （+）,pBlueScript SK（-）pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C, 大肠杆菌冷激质粒： pColdI pColdII pColdIII pColdTF 原核共表达质粒：pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1，pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣： pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞： DH5a JM101 JM103JM105 JM107 JM109 JM110 Top10 Top10F BL21（DE3）HB101 ER2529 E2566 C2566 MG1655 XL-10gold XL blue M15 JF1125 K802 SG1117 BL21（AI）BL21（DE3）plysS TG1 TB1 DH5a（pir）Tuner（DE3）Bl21 codonplusRIPL Novablue （DE3）Rosetta Rosetta（DE3）Rosetta（DE3）plys Rosetta-gami（DE3）Rosetta-gamiB（DE3）, Rosetta-gamiB（DE3）plysS Orgami（DE3）OrgamiB（DE3）HMS174（DE3）植物表达/RNAi载体农杆菌pBI121,pBI121-GFP,pBI101,pBI221,pSN1301,pUN1301,pRTL2 , pRTL2-GFP , pRTL2-CFP, pRTL2-RFP , pRTL2-YFP,pCAMBIA 1300, 1301, 1302,1303,1304,1305, 1381Z,1391Z,2300, 2301,3300,3301,pCAMBIA super1300,pCAMBIAsuper1300-GFP,pPZP212,pPZP2121,pPZP212-GFP,pGDG,RNAi载体pART27,pHANNIBAL,pKANNIBAL, pFGC5941,pTCK303, pTRV1,pTRV2,T-DNA插入载体（随机突变体库）pSKI015,pSKI074,真菌ATMT载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP,pBHt1枯草芽孢杆菌表达载体pWB980,pHT43,pHP13,pHP43,pBE2,pMUTIN4,pUB110,pE194,pMA5, pMK3,pMK4,pHT304,pHY300PLK,pBest502,pDG1363,pSG1154,pAX01, pSAS144,pDL,pDG148-stu,pDG641,pAL12,pUCX05-bgaB,pHT01，配套菌株BS 168,WB600,WB800,WB700,WB800N,1012,FZB42,1A747,广宿主质粒pVLT33RNAi基因沉默干扰敲除载体pSilencer1.0，pSilencer 2.1-U6 hygro， pSilencer 3.1-H1 hygro，pSilencer 3.1-H1 neo， pSilencer 4.1-CMV neo， pSilencer 4.1-CMV puro pMIR-REPORT Luciferase RNAi载体（oligoengine）pSuper-puro RNAi逆转录病毒载体（clontech）: RNAi-Ready pSIREN-Retro Q， RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen（Luciferase shRNA Annealed Oligonucleotide）RNAi慢病毒载体（addgene）: pLKO.1哺乳动物表达载体pcDNA3.1+/-,pcDNA4/HisMax B，pSecTag2 A，pVAX1，pBudCE4.1,pTracer CMV2，pcDNA3.1（-）/myc-His A ，pcDNA6-Myc/His B，pCEP4， pIRES，pIRESneo，pIRES hyg3，pCMV-myc，pCMV-HA，pIRES-puro3，pIRES-neo3,pCAGGS哺乳动物双杂交系统pACT，pBIND，pACT-MyoD，pBIND-Id，pG5luc,pCMV-BD, pCMV-AD, pBD-p53, pFR-luc,Cytotrap Two-Hybrid System:pSos, pSos MAFB, pMyr蜕皮激素诱导系统pIND, pVgRxR,LacSwith II哺乳动物诱导表达系统:pOPRSVI ，pOPI3CAT，pCMVLacI,GeneSwitch System:pSwitch哺乳动物表面展示系统:pDisplay, 四环素调控系统（Invitrogen）：pcDNA4/TO/Myc-His A，pcDNA4/TO/Myc-His B，pcDNA4/TO/Myc-His C，pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ，pcDNA6/TR四环素调控系统（Clontech）：pTet-On，pTet-Off，pTRE2,pRevTRE，pRevTet-On，pRevTet-off信号通路报告载体:pGAS-TA-Luc，pSTAT3-TA-Luc, pISRE-TA-Luc, pTA-Luc，pIκB-EGFP，pNFAT-TA-Luc，pCaspase3-sensor，pAP1（PMA）-Luc;pGL4.26[luc2P/minP/Hygro],pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro],pGL4.30[luc2P/NFA T-RE/Hygro]，pGL4.75;p53-Luc，pAP-1-Luc， pNF-κB-Luc，pSRE-Luc，pFA2-Elk1，pFC-MEKK，pFR-luc,Gateway系统（invitrogen）pcDNA6.2-GWEmGFP-miR negative, pLenti 6/TR,pcDNA 6.2-GW EmGFP-miR，乳酸菌表达载体及各种乳酸菌乳酸杆菌菌株，pNZ8148,pLEISS,pMG36e,pBBR1MCS-5,pBBR1MCS-6,pRV610,pLEM415,pHY3 00PLK,分泌型乳酸菌表达载体pVE5523，pPG611.1,pPG612.1等和乳酸杆菌菌株宿主菌NZ9000,MG1363,Lactobacillus casei 1.539,Lactobacillus casei,acidophilus NCFM,1.2,Lactobacillus sakei 23K,L.plantarum,L.rhamnosusGG,B.coagulans,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium infantis,Lactococcus lactis M17,1663,Lactobacillus reuterii广宿主表达载体链球菌表达敲除载体假单胞菌表达载体pVLT33,pBBR1MCS-2,3,4,5,6, pJRD215,pJN105,pME6032,Cos载体pLAFR3,pMP2444（GFP）, pHY300PLK,pRT102,pRL1063a, 转座子载体pUT-miniTn5,pMGS100, pWHM10,pKC1139,pSET152,pOJ260,pPG611.1,pPG612.1，腺病毒载体/慢病毒，逆转录病毒表达载体及包装包膜质粒，腺病毒系统（Stratagene）: pAdEasy-1,pShuttle-CMV,pShuttle,pAdTrack, pAdTrack-CMV, pShuttle-IRES-hrGFP-1、pShuttle-IRES-hrGFP-2、pShuttle-CMV-lacZ,pShuttle-CMV-EGFP-C,pXC1, pBHGE3, 配套大肠杆菌BJ5183,293,293T cellline 腺相关病毒系统（Stratagene）： pAAV-MCS，pAAV-RC，pHelper，pAAV-LacZ，pAAV-IRES-hrGFP，pCMV-MCS，慢病毒载体:pLVX-DsRed-Monomer-N1,pLVX-IRES-ZsGreen1,pLVX-AcGFP1-N1,Lenti6/v 5-EDST-EGFP,pWPXL, FUGW,pLentilox 3.7,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q-ZsGreen,pSUPER.Retro-GFP/Neo,pSUPER-Retro-Neo, pSUPER.Retro-puro,PLNCX PLNCX2 pMSCV-HYG pMSCV-neo pMSCV-puro pLEGFP-C1 pLOX-CW-CRE pLOX-GFP-IRES-TK pRetroX-IRES-DsRedExpress, pLVX-IRES-mCherry质粒载体。
酵母表达载体是什么？
酵母表达载体是什么？
结构组成及表达元件
来⾃pBR322基本⾻架含有该质粒复制起始位点(ori)，lacZ基因、bla或ampr、tetr等基因。
含有URA3、HIS3、LEU2、TRPl、LYS2与特定的宿主营养缺陷突变体互补筛选或利⽤zeocin、basticidin（杀稻瘟菌素）的抗性基因筛选。
启动⼦有GAP、AOXl、AUGl和GAL1等。
特点或优点
GAP是组成型启动⼦。
其余是诱导型启动⼦。
酵母表达载体多为穿梭载体：既可以在⼤肠杆菌中繁殖，获得⾜够的载体DNA进⾏体外操作，⼜可以在酵母中复制、表达和选择。
融合蛋⽩表达载体：于外源基因插⼊位点的C端或N端插⼊了1个6×His标签，或在5’端插⼊了α-因⼦作为分泌信号
备注
由于原核⽣物和真核⽣物存在糖基化、酰基化等翻译后修饰反应机制的差异，真核基因的原核表达难以获得有活性的蛋⽩。
酵母成为真核表达的⾸选系统。
毕赤酵母表达实验手册--生物秀
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实验
虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活 生产PCR仪已有十年历史, 产品畅销国内 外多个城
电书 ——
性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变
市.欢迎来电咨询!
实验 视频
性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，
——
同时增加了成本。
实验
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过 下载
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pMyr酵母表达载体说明
pMyr编号 载体名称北京华越洋生物VECT2650 pMyr载体基本信息出品公司: Stratagene载体名称: pMyr质粒类型: 酵母双杂交系统载体高拷贝/低拷贝: -‐-‐启动子: GAL1克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 6.0kb5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素（Ampicillian）筛选标记: -‐-‐备注: -‐-‐产品目录号: #217431稳定性: -‐-‐组成型: -‐-‐病毒/非病毒: -‐-‐载体质粒图谱和多克隆位点信息pMyr载体多克隆位点pMyr载体特征其他酵母表达载体：p416GFD pPIC9p53blue pPIC9KpACT2-AD pPIC9k-HispAD-GAL4-2.1 pPICZApADH2 pPICZBpAUR123 pPICZCpBridge pPICZαApCL1 pPICZαBpDEST32 pPICZαCpDisplay pPICZαDpDR195 pPICZαFCpESC-His pPICZαGBpESC-Leu pPink-HCpESC-TRP pPink-LCpESC-URA pPinkα-HCpFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pRS316pFLD pRS403pFLD/CAT pRS405pFLDαpRS406pGADT7-T pRS414pGAG424 pRS415pGAPZA pRS416 pGAPZB pRS41H pGAPZαB pRS426 pGAPZαC pRS426gal pGBKT7 pSEP1 pGBKT7-53 pSEP2 pGBKT7-Lam pSEP3pHIC-PI pSospHIL-D2 pSos-MAFB pHIL-S1 pUG66pHis2 pYC2/CT pHisSi-1 pYC2/NTA pMETA pYC2/NTB pMETB pYCP211 pMETC pYEPlac112 pMETαA pYEPlac195 pMETαB pYES2pMETαC pYES2-EGFP pMyr pYES2-kan pPIC3.5 pYES2-NTA pPIC3.5K pYES2-NTB pPIC6B pYES2-NTC pPIC6C pYES3/CT pPIC6αA pYES6/CT pPIC6αB pYES-DEST52 pPIC6αC pYIP211 pYX212 pYIP5 SUMOprotease pYRP7Ycp22lac-EGFP Ycplac33。
毕赤酵母表达常用载体与14种培养基配方大全
毕赤酵母表达常用载体与14种培养基配方大全相关专题LB培养基的配方及实验指南本文总结了毕赤酵母表达常用的一些载体以及14种毕赤酵母表达所用培养基，即：LB(Luria-Bertani)培养基、LLB(Low Salt LB)培养基、YPD (又称YEPD)、BMGY培养基、BMMY培养基、YPDS + Zeocin 培养基、最小甘油培养基(MGY)、葡萄糖再生培养基（RD)等。
更多毕赤酵母信息一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子和转录终止子(5'AOX1和3'AOX1)，它们被多克隆位点(MCS)分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因(HIS4)选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 (AOX1)，KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut+，即甲醇利用正常型;而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
酵母表达体系
酵母表达体系毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的30%以上。
AOX2 基因与AOX1 基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2 基因的菌株比带AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts 菌株。
毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。
利用含有α因子序列的分泌型载体即可。
翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。
菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts）分泌型载体:pPICZα A,B,and C(5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签)胞内表达型载体：pPICZ A,B,and C，一：分子克隆1.设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C）2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer（10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture(各2mM): 4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μlddHO up to 50μl2PCR 反应流程预变性98℃ 2min变性98℃ 10sec退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec完全延伸72℃ 10min保存4℃3.双酶切及其回收双酶切反应体系（40μl）DNA(空载体或目的基因) 30μlBamHⅠ 1.5μlXholⅠ 1.5μl10×Buffer K 4.0μl4.酶连接首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。