T-SPOT.TB

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T-SPOT_TB操作说明电子版

结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）说明书【产品名称】通用名称：结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）英文名称：T-SPOT.TB【包装规格】24人份/盒。

【预期用途】该产品用于检测人外周抗凝全血中的结核特异抗原刺激活化的效应T细胞，仅适用于临床疑似结核病的辅助诊断。

结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数。

从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。

两个单独的抗原模仿ESAT-6和CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。

T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。

ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。

这使得ELISPOT检测更加的灵敏，超过传统的ELISA实验。

T-SPOT.TB 被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。

T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。

【检验原理】外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。

记数PBMCs，保证有标准的细胞数量用于检测。

这可以保证因为免疫系统削弱（免疫力低下和免疫抑制）而导致T细胞浓度低的样本也有足够的细胞数加入反应孔检测。

与ELISPOT技术一样的洗涤和记数过程，提高了检测结核病和结核感染的性能。

抗原和PBMCs一起孵育，刺激所有的致敏T细胞。

分泌的细胞因子被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，然后细胞和其它不必要的物质通过洗涤被去除。

标记二抗，碱性磷酸酶配对的与细胞因子上不同的抗原决定簇结合，在反应孔膜上捕获细胞因子。

通过洗涤去除任何未标记的抗体。

可溶的底物溶液加入到每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。

T-SPOT.TB

风湿病：日前判断风湿病患者是否存在LTBI，除通过详细询问病史、行x线胸片检查外．主要依靠PPD试验的结果。而大部分患者在接受肿瘤坏死因子(TNF-α)拮抗剂治疗之前往往已接受免疫抑制治疗，包括甲氨蝶呤(MTX)、糖皮质激素等，这导致PPD试验假阴性率升高。糖尿病：我国9 240万成年人有糖尿病，1.482亿成年人处于糖尿病前期。糖尿病是活动性结核的一个中度甚至高强度的危险因素。可能是因为持续的高血糖损害了针对结核杆菌的机体免疫。血液病：血液病合并活动性结核发生率约为该发病率的15. 5 倍。因自身免疫功能低下, 大部分患者长期用免疫抑制剂，PPD 试验阴性占多数，同时合并其他感染，使误诊率较高。抗TNF治疗：广泛应用于免疫介导的炎性疾病(immune—mediated inflammatory diseases，IMID)，如类风湿关节炎(RA)、强直性脊柱炎(AS)、银屑病关节炎、克罗恩病等。其它疾病：肿瘤、晚期肾病、器官移植、肝硬化、肺隐球菌病、肺结核合并非结核分枝杆菌肺病、儿童结缔组织疾病等。
• 原理：干扰素释放试验
• 方法：酶联免疫斑点法 • 抗原： ESAT-6与CFP 10
γ -干扰素释放实验（IGRA）
γ干扰素检测阴性
γ干扰素检测阳性
TB抗原多肽
T细胞
活化T细胞
γ 干扰素
酶联免疫斑点技术（ELISPOT）
结核杆菌特异抗原
Tuberculosis Complex
M. tuberculosis
结果阳性说明患者结核感染，是潜伏性还是活动性需要 Chee et al Eur J Clin Microbiol Janssens et al ERJ (2007)（IF=6.35）结合临床症状。因个体差异，没有具体的斑点数字可 Infect Dis (2008)（IF=3.02）以依据。但斑点数越多越倾向于活动性结核

T-SPOT.TB阳性结果分析

T-SPOT.TB阳性结果分析T-SPOT.TB是IGRA（γ干扰素释放试验）的一种，主要用于MTB 感染的诊断，鉴于MTB感染包括潜伏性结核感染（LTBI）和活动性结核病（ATB），因此T-SPOT.TB在临床上的适应症即为这两种的辅助诊断。

目前临床上对于LTBI和ATB的关注度及处理方式有较大的不同，所以临床需要实验室提供其较明确的结果，在这种情况下，T-SPOT.TB（主要指T-SPOT.TB阳性结果）需要结合其他检查结果来达到临床需求。

目前T-SPOT.TB阳性结果可以从以下几个方面进行分析：1、患者存在结核中毒症状，影像学检查支持结核病诊断，临床排除其他疾病，考虑活动性结核病的诊断。

2、患者存在结核中毒症状，影像学等临床检查手段未发现结核病证据，临床排除其他疾病，考虑MTB感染状态，建议试验性抗结核治疗（既治疗，又诊断），观察疗效（临床症状），再做诊断。

3、患者不存在结核中毒症状，影像学显示病灶存在（钙化或陈旧性病灶），存在结核病史，考虑结核之前患过结核病，不代表目前为活动性结核。

4、患者不存在结核中毒症状，影像学等临床检查手段未发现结核病证据，考虑潜伏性结核感染。

根据发展为活动性结核病风险程度决定是否进行预防性抗结核治疗。

5、4种环境分枝杆菌的感染（海、堪萨斯、苏尔加、戈登分枝杆菌）也会造成T-SPOT.TB的阳性，上述四种情况仍未做出合理判断的可以考虑这中情况。

（我国未见大样本量的NTM病流行病学调查资料，但历年的结核病流行病学调查资料显示，NTM分离率1990年、2000年和2010年分别为4.9%，11.1%和22.9%）上述五种情况中，第1和第2种情况表明感染了MTB，且称活动状态，应积极治疗；第3和第4种情况提示体内有处于持留状态的MTB，两种情况较为稳定，需随访观察，高危人群，根据情况可以进行预防性治疗。

文章摘自《中华结核和呼吸杂志》2014年10月第37卷第10期。

T-SPOT TB解析

Antigens ESAT-6
+
+ +
Antigens Environmental Strains ESAT-6
M. abcessus
M. avium M. branderi M. celatum M. chelonae
CFP 10
+
+ +
CFP 10
-
-
moreau
tice tokyo danish glaxo
•
1.1、试剂盒研制临床背景
结核病——全球关注的问题全球
• • • 20亿人口感染结核新增活动性结核病人约900万/年每年130万患者死亡
中国
• 450万活动性结核病人
•
•
新增活动性结核病人约145万/年
死亡人数约13万/年
活动性结核与潜伏感染
接触活动性结核病患者暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除
终身处于感染状态
潜伏感染
活动性结核
控制结核的关键
早发现早治疗
结核病的常规诊断方法
（1）细菌学检查是结核病诊断的金标准，但涂片阳性率低，培养又耗费时日
（2）分子生物学检查
虽然快速、灵敏，但操作烦琐、技术要求高（3）结核抗体诊断诊断价值有限，但其简便、快速，可以作为结核病的辅助诊断方法之一（4）PPD（TST）实验传统的结核感染检测方法，对于接种过卡介苗(BCG)或环境分枝
ROC曲线
ROC Plot 1 0.9 0.8
机体被感染
- 没有症状,结核杆菌仍旧存在而不能被侦测
5%
- X-光/ CT 扫描显示正常
- 没有抗体应答 - 诊断困难 - 传统的结核感染检测只有 TST（PPD）

TSPOT分析

不能确定病变部位。
国外文献报道应用ELISPOT方法检测活动性肺结核的敏感性可达到 78% ~100%, 特异性可达到80% ~100%。
国内学者研究应用ELISPOT方法检测活动性肺结核的敏感性为83%~98.8%，特异性 65%~100%，阴性预测值81.8~91.6%，阳性预测值45.3~67.9%。
目前尚无统一的界值用来鉴别潜伏结核感染及活动性肺结核。
在 5岁儿童、近期暴露于结核杆菌者、免疫功能低下者和需要二次检测者中使用的证据不足。
对标本要求高：室温保存和运输血液样本（1825℃），不能冷冻或冷藏；血液样本从采集到检测不超过8小时。
结果需结合临床和其它检测进行判断，阴性结果不能排除暴露或感染结核杆菌的可能性。
只与外周血中结核特异性抗原刺激产生的效应T细胞有关，与感染部位无关。
与年龄、机体免疫状态、HIV感染、营养不良的程度无关。
抗结核治疗后效应T细胞消失，可使斑点数减少或使结果呈阴性。
与是否排菌无关。
三、临床应用
活动性结核与潜伏性结核感染的鉴别 “菌阴”结核患者的辅助诊断肺外结核的鉴别诊断结核发病风险的预测免疫力低下或受抑制患者的结核病诊断区别结核感染者与BCG点）
敏感性及特异性高：不受卡介苗接种及环境分枝杆菌影响，不受机体免疫状态影响。
应用广泛：在活动性肺结核、肺外结核、结核性浆膜炎、潜伏性结核感染及免疫抑制的结核患者均能检测。
诊断快速：24小时可报告结果。可进行疗效评估：治疗有效则T-SPOT.TB斑
点数减少甚至阴性。
四、评价（弊端）
有学者指出：
诊断活动性结核病患者外周血T-SPOT.TB斑点形成细胞中位数为442SFCs/10^6 PBMC 。

T-SPOT介绍

10
内容
结核病基础概念 T-SPOT.TB 产品知识 T-SPOT.TB 临床应用病例分享
11
T-SPOT®.TB原理
T-SPOT®.TB原理：结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原（ESAT-6，CFP 10）刺激时会分泌多种细胞因子（ IFN-γ ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断
WHO warns against the use of inaccurate commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB
9
小结
活动性结核病与潜伏性结核感染的区别 LTBI危险因素结核中有20%左右的肺外结核，诊断困难传统结核诊断方法不能满足临床需要
T-SPOT®.TB
——结核感染T细胞检测（免疫斑点法）
列入欧美等20多个国家结核诊疗指南
内容
结核病基础概念 T-SPOT.TB 产品知识 T-SPOT.TB 临床应用病例分享
a
2
ห้องสมุดไป่ตู้
内容
结核病基础概念 T-SPOT.TB 产品知识 T-SPOT.TB 临床应用病例分享
a
3
2000-2008年我国肺结核报告发病情况
基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率
美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
• 快速简便
简单的血液检测，隔天报告结果
15
国外文献汇总——灵敏度
Reference Kobashi et al. J Infect. 2009; 58(3):197-204 Domínguez et al. Diagn Microbiol Infect Dis. 2009; 63(1):43-51 Bosshard et al. Respir Med. 2009; 103(1):30-4. Higuchi Med Microbiol Immunol. 2009; 198(1):33-7 Kim et al. Am J Med 2009 ;122(2):189-95 Nicol et al. Pediatrics. 2009; 123:38-43 Markova et al. Biotechnol. & Biotechnol. 2009;23(1): 1103-1108 Soysal et al IJTLD 2008 12(1):50-56* Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71* Chee et al J Clin Microbiol. 2008; 46(6):1935-40 Connell et al PLoS ONE 2008. 3; 7:e2624* Kobashi et al. Scand J Infect Dis 2008. 40; 8: 629-34* Goletti et al. PLoS ONE. 2008. 3; 10: e3417.* Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65* Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-8 Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44. Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8* Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-703 Vincenti et al Clin Exp Immunol. 2007 Oct;150(1):91-8* Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-8 Losi et al Eur Respir J. 2007 Dec;30(6):1173-9 Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259 Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53 Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34* Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30* Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*

T-SPOT_TB操作说明电子版(中文版)

4．用PBS缓冲液200倍稀释浓缩标记抗体试剂。
4．不能用含有Tween或其它去污成分的PBS缓冲液，
这会导致高的本底结果。确保标记抗体工作液有少
量剩余（考虑到耗损）。因而，对于8孔板条（每孔
需要50ul），配制500ul标记抗体工作液，取2.5ul的
浓缩标记抗体试剂加497.5ul的PBS缓冲液
5．每个反应孔加入50ul标记抗体工作液，2-8℃孵 5．不按照推荐的孵育时间会导致检测结果的不正
3.每吸取100ul细胞终溶液前都必须保证彻底混匀。推荐每孔加样后都更换新的枪头以避免4个反应孔出现交叉污染。 4. 为避免干扰，培养板应立即放入孵育箱。不要把培养板堆叠，会导致温度的不均匀和空气的不流通。不按照推荐的时间孵育会导致不正确的检测结果。
2.斑点记数
在培养板的洗涤和斑点形成阶段，不要让移液枪枪头或洗板仪枪头触碰反应孔底部的膜。移液枪枪头或洗板仪枪头产生的凹
注意：细胞培养液使用前需预温至 37℃
步骤 1.依照说明书的要求采集全血样本。室温保存（18-25℃），不能冷冻或冷藏 2.对于使用CPT采血管的，根据厂家说明书要求来分离PBMCs。对于其它方法采集血样的，利用Ficoll-PaqueTMPlus 按照操作说明分离PBMCs
3.用吸液管吸取白色、云雾状PBMCs层并转移至15ml 尖底离心管中。加入细胞培养液至10ml。 4.600g离心7分钟。弃去上清液用1ml培养液重悬沉淀。 5.加培养液至10ml，350g离心7分钟。 6.弃去上清液加0.7ml培养液重悬沉淀。
痕会导致斑点假象，影响斑点记数。
步骤
注意点
1．从培养箱中取出培养板弃去细胞培养液。
1．此时从试剂盒取出底物显色溶液恢复至室温。

结核抗体三项的标准

结核抗体三项的标准
结核抗体三项是指结核杆菌抗体（TB抗体），结核分枝杆菌
抗体（MTB抗体）和结核菌素结合试验（T-SPOT.TB）三个
指标的检测。

不同的标准可能会有所差异，以下是一般常用的标准：
1. 结核杆菌抗体（TB抗体）：
- 阳性：典型肺结核病例的IgG抗体滴度≥1:100。

- 阴性：IgG抗体滴度<1:100。

2. 结核分枝杆菌抗体（MTB抗体）：
- 阳性：MTB抗体滴度≥1:20。

- 阴性：MTB抗体滴度<1:20。

3. 结核菌素结合试验（T-SPOT.TB）：
- 阳性：大于切割值（一般为6-8个纤维）的T-细胞反应。

- 阴性：小于切割值的T-细胞反应。

需要注意的是，这些标准仅供参考，具体的标准可能会有所差异，还需要根据具体的实验室和医生的建议进行解读和判断。

实际诊断和判断结核病还需综合考虑患者的临床症状、病史、病灶影像学表现等综合因素。

因此，如果有疑似结核病的症状，应及时就医并咨询专业医生的建议。

结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）临床研究进展

结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）临床研究进展2.保山市人民医院感染科云南保山 678000摘要：结核感染T细胞斑点实验作为临床上日益普遍的肺结核诊断方法，具有检测结果不受患者临床症状干扰，能排除接种卡介苗引发的假阳性结果，检测标本易于获得，操作简便、灵敏度高等优点，临床价值得到肯定；但是作为单纯的检测方法还存在不能确定结核发病阶段、发病部位及假阳性等问题，需要与其他检测方法联合应用才能提高检测效果；进一步运用该检测方法诊断结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、非典型肺结核等结核相关疾病，提升疾病诊断的准确性。

关键词：肺结核；结核感染T细胞斑点试验；临床研究肺结核是一种肺部常见慢性传染性疾病，主要致病因素是结核分枝杆菌，我国在党和政府的领导下对结核病的防治取得了巨大成效，但近年来结核病防治形势不容乐观。

目前我国作为世界上30个结核病高负担国家之一，2019年新发结核病例83.3万人，结核病发病率为58/10万。

带菌患者为其重要的传染源，大多数肺结核患者病程呈慢性过程，主要表现有低热、盗汗、消瘦、乏力等全身症状及咳嗽、咯血等呼吸系统表现。

1.T-SPOT.TB的概念在疾病早期尽早尽快确诊对疾病治疗具有关键指导意义。

针对早期快速诊断，结核感染T细胞斑点试验，又叫作结核感染干扰素释放试验，该检查方法的机理在于：结核分枝杆菌入侵人体后，T淋巴细胞会相应地留下印记，然后分离出T淋巴细胞，再进行培养增殖，同时通过特异抗原对其进行作用，使其分泌γ干扰素，再经过免疫染色后，进行斑点计数，计算干扰素的量，推算抗原特异性细胞的频率,判断是否存在结核感染。

该检测方法的标本需要采集患者的静脉血，因此摆脱了传统痰涂片、痰培养法受痰标本质量影响的弊端，并且不受机体免疫力及卡介苗接种的影响。

此法得到国内外专家的普遍认同，可以辅助早期诊断。

2.传统检测方法的不足目前肺结核主要通过症状体征，借助辅助检查，综合考虑为诊断提供依据。

T-SPOT.TB产品简介

结核感染T细胞检测试剂盒（T-SPOT.TB）一、T-SPOT.TB产品介绍我国是世界上仅低于印度的第二大结核病国家。

受限于检测手段，中国的结核感染率较难准确统计，2009年流行病调查结果为总人口的44.5% （因采用PPD检测，假阳性较多）。

而年新发活动性结核患者超过107万人次，年死亡人数达13万。

结核病的早期快速诊断已经成为制约结核病控制的关键因素。

目前，常规结核感染实验室检测方法诊断检出率不到50％。

2011年7月20日，世界卫生组织（WHO）发出正式声明，要求禁止将血清学检测方法用于肺结核和肺外结核的诊断。

因此，开发特异、敏感、快速、简便的结核病感染的诊断方法已经成为全球共识。

结核感染T细胞检测试剂盒（T-SPOT.TB））是由英国Oxford Immunotec 公司研发生产的体外诊断产品，用于结核感染的筛查，结核病辅助诊断及疗效评价等。

它改变了以往的结核检测方法特异性低，敏感度差，耗时长的缺点。

作为当前全球最先进的结核感染诊断产品，该产品已经成为发达国家结核感染检测的首选方法，获得欧盟CE 认证、美国FDA认证。

美国CDC、美国胸科学会、英国及欧洲的结核病防治指导原则中，均已将本试剂盒方法列为结核感染诊断的推荐实验室诊断标准，并已经在欧洲（英国、德国、法国、意大利、瑞士、西班牙、爱尔兰、荷兰、丹麦、挪威、瑞典）、北美洲(加拿大、美国)、非洲（南非）、澳大利亚、亚洲（韩国、新加坡、日本、中国）等国家均已上市销售，并写入部分国家的诊疗指南中。

T-SPOT.TB用于结核感染的诊断与鉴别诊断具有独特优势：高灵敏度和特异性:特异性达到97.1％（美国FDA临床研究数据），敏感度达到95.6％（美国FDA临床研究数据），不受环境分枝杆菌感染和卡介苗（BCG）接种影响基本不受机体免疫抑制影响，适用于HIV感染和免疫抑制剂治疗人群简单的实验室血液检查，24小时快速报告结果结核感染T细胞检测试剂盒（T-SPOT.TB）应用的方法学为酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。

T-SPOT_TB操作说明电子版(中文版)

散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。这使得 ELISPOT 检测更加的灵敏，超过传统的 ELISA 实验。T-SPOT.TB
被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应 T 细胞。T-SPOT.TB 记数每个活化的结核特异效应 T 细胞。
【检验原理】
外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。记数 PBMCs，保证有标准的细胞数量
步骤 1.从包装袋中取出培养板条，嵌入培养板架内恢复至室温。
2.每个样本需要用到4个检测孔：（1）加入50ul细胞培养液至每个空白对照孔内；（2）加入50ul抗原A溶液至每个必要的检测孔内；（3）加入50ul抗原B溶液至每个必要的检测孔内；（4）加入50ul阳性质控至每个细胞功能控制孔内。 3.每个患者样本使用4个检测孔，每个检测孔加入 100ul细胞终溶液（含有25万个活细胞）
育1小时
确。
6．弃去标记抗体工作液，按上述的步骤2和3洗涤。
7.每个反应孔加入50ul底物显色溶液室温孵育7分 7. 不按照推荐的孵育时间会导致检测结果的不正
钟。
确。
8.用蒸馏水或去离子水彻底洗涤培养板终止反应。
9.在通风处或37℃温箱干燥培养板
9.斑点会因为干燥而变的清晰。可以37℃温箱干燥4
小时或室温过夜。
(4) 阳性质控
2 瓶 0.8ml/瓶主要成分为植物血凝素 PHA，牛血清白蛋白和抑菌剂
(5) 浓缩标记抗体
1 管 50ul/管含有碱性磷酸酶标记的小鼠的抗人 γ-干扰素单抗
(6) 显色底物溶液
1 瓶 25ml/瓶含 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）和氯化硝基四氮唑蓝（NBT）
(7) CD 光盘

QB—SPOT结核实验

QB—SPOT结核实验
结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）是一种运用IGRA技术，检测被结核分枝杆菌特异的早期分泌靶抗原6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP 10）分别刺激后释放γ-干扰素的效应T淋巴细胞，以辅助诊断结核感染的实验室检测技术。

TBspot试验通常指T-SPOT试验，即结核杆菌感染T细胞斑点试验，又称为结核菌感染干扰素释放试验，是利用结核特异性抗原，通过酶联免疫斑点技术，检测受试者体内是否存在结核效应的T淋巴细胞，从而判断被检查者是否感染结核杆菌。

该检查的原理是结核杆菌感染之后，T淋巴细胞会形成免疫记忆。

通常在体外分离到T淋巴细胞之后，培养增殖T细胞的同时，用相应的特异性抗原，进行刺激，激活T细胞记忆，有记忆的细胞则会分泌大量的干扰素。

结核T-SPOT检查即为结核菌T细胞斑点检测，是临床用于诊断结核病的新型检查方法。

通过检测干扰素的量，判断该细胞是否存在结核感染形成的记忆，进而通过进一步的反应判断是否存在结核菌感染。

但它的结果不能作为单独或决定性诊断活动性结核的证据，阳性结果仅提示患者体内存在结核杆菌特异性的效应T细胞。

但是否为活动性结核，则需要结合患者的临床症状及其他检测指标，进行综合判断。

现在已经有多项研究的结果显示，T-SPOT试验只能判断是否感染过结核，但无法鉴别活动性结核与潜伏性结核，因此对于活动性结核的诊断价值有限。

TB-SPOT

• 敏感性与特异性评价 • 活动性结核与潜伏性的鉴别 • 结核发病风险的预测
敏感性
• Pai等对近3年的13项研究进行Meta分析，共纳入726例受试者，大多为结核培养阳性、 HIV阴性的成年人，分析表明T.SPOT.BT的综合敏感性为90％。 • Chapman等研究显示39例HIV阳性的结核患者中T.SPOT.TB的敏感性为90％，而 PPD皮试的阳性率仅为72％。 -细胞免疫低下不影响其敏感性
特异性
Pai等的Meta分析中纳人了6项研究290名受试者，其中5项中的受试者都常规地接受 BCG免疫。93％为无结核接触史的健康成年人，其综合特异性为93％。
活动性与潜伏性
• 每一个斑点代表一个与相应抗原反应的单个细胞
活动性与潜伏性
• hee等对230例培养阳性活动性结核患者和 183例结核接触者进行了T.SPOT.TB检测 • 在ESAT一6肽段库中，活动性结核患者与结核接触者的SFCs数分别为108vs40 SFCs／106PBMCs(P<0．001) • 在CFP.10肽段库中，分别为148vs52 SFCs ／106PBMCs(P<0．001) • 两2例怀疑肺外结核患者的前赡性研究显示，对于活动性肺外结核，T.SPOTBT和PPD的敏感性分别为94％和47％，二者比较差异具有显著性(P<0．001)。47％的随诊对象合并有导致免疫低下的情况,包括HIV感染、肿瘤、移植、糖尿病以及自身免疫病等，可能是导致PPD皮试的阳性率显著降低的原因。 -肺外结核诊断的敏感性高
敏感性
Liebeschuetz等报道了对293例怀疑结核的非洲儿童的随访结果，这些儿童的平均年龄为3岁，约46％HIV阳性，多数合并营养不良，对于确诊结核或高度怀疑结核的病例，T-SPOT· TB的阳性率为83％，PPD皮试的阳性率为63％. -年龄、HIV感染状态和营养不良的严重程度对T.SPOT-TB结果无影响，但均能导致 PPD皮试结果的显著差异

T-SPOT TB解析

•
由结核杆菌基因组 RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区
•
•
结核杆菌特异抗原
Tuberculosis Complex
M. tuberculosis
M. africanum M. bovis BCG substrain gothenburg -
•
•
2.2、试剂盒主要原材料研究（续）
预包被的培养板、标记二抗、显色液 • 采购自瑞典Mabtech公司的半成品试剂盒（Mabtech AB, Stockholm, Sweden）由供应商进行测试并附有合格文件。
包被板：反应孔底部的膜用1.5μg/孔的小鼠抗人γ-干扰素单抗包被。标记二抗：碱性磷酸酶标记的小鼠抗人γ-干扰素（100ug/ml）单抗（Mabtech AB）。工作浓度为0.5μg/mL。（200倍稀释）
ROC曲线
ROC Plot 1 0.9 0.8
•
研究结论：试验的特异性不受因被测的细胞因子产生的交叉反应影响。
3.3、精密度
T-SPOT.TB的精密度通过重复检测145例临床样本来确定 • • 批内差通过比较同一个操作人员在同样的板子的实验结果进行。由3个操作者完成9块板子的检测，统计CV值。在高斑点数(210.40+11.59)的结果中，CV值的范围为2.21% - 5.7%；中等范围斑点数(71.17+8.47)的结果中，CV值的范围为6.57% - 17.13%；在临界值附近的结果中，CV值的范围为19.73% - 30.55%。批间差通过3个不同的操作人员用同样的3个样本在3个批号的试剂上重复6次试验得到。3 个样本结果的斑点数平均为210.40，变异系数CV值为5.51%；接近临界值时的批间差CV值为25.03%；中等水平斑点数结果，平均CV值为12.12%。每批试剂的CV值结果均一致，证明ELISPOT技术的工艺水准是可接受的。操作人员间差异采用3个操作人员用3批试剂的各1块板子进行检测来评估其重复性。评估操作人员间的变异系数CV值为3.64%-6.18%。这是一个良好的重复性结果当重视在实验过程中发生的随机误差，例如细胞记数、细胞混匀和移取时。批次差异采用3个操作人员用3个批次的8孔板各1块进行检测来评估其重复性。在3个生产批次间获得一个很低的CV值2.63%

TSPOT.TB

• TB：结核杆菌
优势
• 该检测方法采用的结核杆菌特异性抗原为ESAT-6和CFP-10，其编码基因RD1在BCG〔卡介苗〕和绝大多数非结核杆菌中是缺失的，因此较好的防止了穿插抗原反响，提高了特异性。
原理
1.从全血中别离出外周血单个核细胞PBMCs
2.将样本参加反响孔，每个样本需要4个检测孔：
生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特
异性抗体。由于其较难提纯，且胞增殖的
试剂。
原理
3.孵育，刺激T细胞，分泌的细胞因子被预包被在反响孔膜上的特异抗体捕获
4. 洗涤、标记、计数。
结果
前提：通常正常结果，空白对照孔没有或有很少的斑点而植物血凝素PHA对照孔斑点数超过20个。 1.阳性结果：
• 2.T-SPOT.TB结果不能作为单独或是决定性的诊断结核病的依据。
• 3.虽然ESAT-6和CFP10在所有的BCG菌株，以及绝大多数环境分枝杆菌中缺失，但TSPOT.TB的阳性结果有可能是堪萨斯、苏氏、戈登或海分枝杆菌的感染引起的。
阴性结果：
• 提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。如出现以下情况，阴性结果不能排除结核杆菌感染的可能：
①空白对照孔斑点数为0～5个且〔抗原 A或抗原B斑点数)-〔空白对照孔斑点数〕 ≥6
②空白对照孔斑点数6-10个时且〔抗原 A或抗原B斑点数〕≥2倍空白对照孔斑点数
2.阴性结果：不符合上述标准且对照孔正常
结果的诊断
阳性结果：
• 1.提示患者体内存在结核杆菌特异的效应T 细胞，患者存在结核感染。但是否为活动性结核病，需结合临床病症及其它检测指标综合判断。
风湿免疫科 1. 生物制剂/免疫抑制剂治疗前后的筛查 2. 大剂量激素治疗前后的结核筛查 3. 自身免疫性疾病与结核病的鉴别诊断 4. 发热待查患者的结核排筛

结核感染T细胞(T-SPOT.TB)

结核感染T细胞（T-SPOT.TB）一、名称结核感染T细胞（T-SPOT.TB）二、项目简介、临床意义及收费标准T-SPOT.TB是一种记数单个结核特异的效应T细胞的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法，其灵敏高于ELISA方法。

该检测通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染。

该检测适用于所有具有结核潜伏感染风险或怀疑是结核病的人群，无论年龄、性别、种族、治疗还是免疫状况，其诊断结核感染的敏感性为90%-95%，特异性为93%-100%。

对临床诊断或排除结核病具有重要的参考价值。

收费标准：740元/人份，收费依据：混合淋巴细胞培养（W0309050020）（250元）×2次；干扰素测定（W0309060008）（120元）×2种抗原。

三、标本采取1.静脉血：肝素锂（绿头管）抗凝管采集静脉血4ml，立即颠倒数次，充分混匀，以免血液凝固。

采血后向试管中注入血液时请缓慢进行，避免用力过猛造成细胞破坏影响检测结果。

2.脑脊液：无菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混匀。

3.浆膜腔积液（胸水、腹水、心包积液）：无菌密闭容器留取50ml以上，每100毫升加2500IU（0.4ml）抗凝并立即混匀。

4.关节液：无菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混匀。

四、检测时间、报告时间检测时间：每周二（节假日除外）进行检测，标本必须在上午9点前送达实验室。

报告时间：周三出报告。

五、注意事项1.标本采集后4小时内必须送到实验室进行检测，标本采集后如果超过4小时未送检将严重影响检测结果。

2.检测脑脊液、浆膜腔积液、关节液，须同时送检静脉血。

3.冬季运送标本时注意保温，避免冷冻。

六、联系科室和电话检验科微生物室(TeL：84205491)。

T-SPOT-TB说明书翻译

T-SPOT®.TB用于结核感染的诊断8孔反应板条规格（TB.300）说明书用于体外诊断T-SPOT.TB 88孔反应板规格（TB.300）内容目录页码预期用途 3 前言 3 原理 3 局限性 4 安全警告及防范 4 原料 5 储藏条件 5 稳定性 5 仪器和配套试剂 5 试剂准备 6 步骤 6 样本采集和准备 6 细胞的洗涤和记数7 板条组装和孵育7 斑点记数8质量控制9结果解释和判断标准9性能指标10参考文献10术语和标识11预期用途T-SPOT.TB是一种体外诊断试剂，通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染。

T-SPOT.TB是一种记数单个结核特异的效应T细胞的ELISPOT检测方法。

酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)是一种从单细胞水平检测分泌抗体或细胞因子细胞的免疫学新技术前言结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4（Cluster of Differentiation 4）和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数1,2。

从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（Bacillus Calmette - Guerin）（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。

两个单独的抗原模仿ESAT-6和CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。

T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。

ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。

这使得ELISPOT检测更加的灵敏超过传统的ELISA实验5。

T-SPOT.TB被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞3、4、6-9。

T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。

结核感染T细胞斑点试验

T-SPOT-TB—应用
在活动性结核病中的诊断意义 1.敏感性86-94%，特异性89-99% 2.在肝移植术后、艾滋病、血液肿瘤等免疫抑制患
者中， T-SPOT-TB阳性率略低于免疫正常组，但仍具有较高的敏感性，且优于结核菌素试验。
3.在肺外结核患者诊断中的，敏感性优于结核菌素试验。
4.对小于4岁儿童，与结核菌素实验比较敏感性无优势，美国CDC更推荐结核菌素实验。
结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT-IGRAs）
在2001年前，美国仅批准结核菌素皮肤试验（TST）用于结核分支杆菌的检测。在认识到IFN-γ在调节对结核分支杆菌的细胞介导的免疫反应中起重要作用，从而使得（interferon gamma release assays） IGRAs用于检测结核感染。IGRAs通过检测代表结核分支杆菌的抗原刺激T淋巴细胞反应后释放IFN-γ的量来判断是否存在结核杆菌感染。
T-SPOT-TB—示意
T-SPOT-TB—解释
非黄金标准定性检测而不是定量检测敏感性95.3%-98.8% 特异性94.1%-100% 萨斯分枝杆菌( My cobacter ium kans asii ) 、海
分枝杆菌(My cobacter ium mar inum ) 、斯氏分枝杆菌( My cobacter ium sz ul gai ) 等少数分枝杆菌中也存在完整RD1区，编码ESAT�� 6 和CFP�� 10, 可造成检测结果成假阳性。
T-SPOT-TB—应用
在结核性脑膜炎、结核性胸膜炎中的诊断意义 1.敏感性优于ADA、TB-DNA，约在62-75%，特异性无
统计学差异。 • 在结核病治疗中的评价意义