分子量为3000的壳聚糖与牛血清白蛋白相互作用的研究_吴锦绣

3． 585 × 1012 3． 183 × 1012
Ｒ
0． 9989 0． 9938
内部的色氨酸和酪氨酸残基的芳杂环疏水基团裸露出
图 2 为壳聚糖与牛血清白蛋白相互作用的紫外光 来，从而使其吸收强度增强。这与荧光光谱分析的结
谱图。从图 2 可知，随着 CS 的加入，BSA 在 278 nm 处 吸收强度逐渐增强，并且峰位蓝移 1 ～ 2 nm。BSA 在
在一系列 10 mL 的比色管中，分别加入一定量的 1． 0 × 10 － 5 mol / L 的 BSA 溶液，然后依次加入一定量的 CS 溶液，以 pH 值 = 7． 36 的缓冲溶液定容至 5 mL，摇 匀后放置反应 5 min，用样品池为 1 cm × 1 cm 石英吸 收池，分别测定荧光光谱（ λex = 278 nm） 和同步荧光光 谱（ Δλ = 15 和 60 nm） 及其三维荧光光谱。紫外光谱
TU-1901 双光束紫外-可见分光光度计，北京普析 通用仪器有限责任公司； F-4600 荧光分光光度计，日本 Hitachi 公司； J-810 圆二色谱仪，日本 Jasco 公司； TB-85 恒温器，日本岛津公司； pHS-25 型酸度计，上海第二分 析仪器厂； 精密电子天平，0． 0001，梅特勒-托利多仪器 有限公司； 微量移液器，0． 5 ～ 10 μL，20 ～ 200 μL，德国 eppendorf。 2． 3 实验过程
果相吻合。 3． 3 CS 与 BSA 的结合常数 K 及其结合位点数 n 的确
278 nm 处的吸收峰是其肽链上的色氨酸和酪氨酸的苯
定
杂环 π-π* 跃迁引起的，吸收强度随壳聚糖浓度的增加 3． 3． 1 紫外光谱法
而增强，说明 CS 配位诱导 BSA 分子发生类似降 pH 值 所出现的蛋白质肽链伸展现象［14］，使包围在 BSA 分子
国内海南大 学 的 学 者［11］ 利 用 荧 光 光 谱 法 研 究 了 窄分子量分布低聚糖与 HSA 的相互作用。天水师范 学院 学 者［12］ 研 究 了 水 溶 性 壳 聚 糖 与 牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） 的相互作用。而 3 000 分子量的壳聚糖（ CS） 与 牛血清白蛋白的相互作用的研究未见报道。本文在室 温和 体 温 及 近 似 生 理 酸 度 条 件 下，利 用 荧 光 光 谱、紫 外-可见吸收光谱法和三维荧光光谱法研究了 3 000 分 子量的壳聚糖（ CS） 与牛血清白蛋白（ BSA） 的相互作 用。并用同步和三维荧光光谱法及其圆二色谱法研究 了 CS 对 BSA 构象的影响。
1引言
壳聚糖（ chitosan，简称 CS） 是一种天然的高分子 多糖类物质，无毒，有良好的生物相容性和生物可降解 性，来源丰富，具有广阔的应用前景，倍受世界各国药 学研究人员的瞩目［1-6］。相对分子质量低于 10 000 的 壳聚糖具有许多优于高分子量的壳聚糖的功能，特别 是五糖至九糖的壳聚糖在抑制肿瘤方面的作用令人鼓 舞，是当今国内外研究、开发的重点领域［7］。血清白蛋 白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白，它能与许多 内源性和外 源 性 物 质 广 泛 结 合［8-10］，壳 聚 糖 及 其 新 型 衍生物进入人体内必然会与血清白蛋白发生作用，可 能影响或改变血清白蛋白固有的结构和功能。因此， 以蛋白质为药物模板，研究低分子量壳聚糖与生物大 分子血清白蛋白之间的相互作用，有助于了解壳聚糖 在体内的运输和分布的情况，对于阐明壳聚糖新型衍 生物在体内的代谢过程及生物效应的作用机理具有重 要的理论意义。
（ 1）
其中，F0 为未加猝灭剂时的荧光强度； F 为加入猝 灭剂后的荧光强度； Kq 为双分子猝灭过程的速率常 数； τ0 为没有猝灭剂存在时荧光分子的平均寿命； KSV 称为 Stern-Volmer 猝灭常数，是双分子猝灭速率常数
与单分子衰变速率常数的比值； ［Q］为 CS 的浓度。各
类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞速率常数约为 2． 0 × 1010 L / （ mol·s） ［13］，大分子物质荧光的平均寿 命为 10 － 8 s［13-14］。由表 1 可知，CS 对 BSA 荧光的猝灭
光光谱法表明了 CS 对牛血清白蛋白的构象和所处的
微环境发生了一定程度的变化。
关键词： 壳聚糖； 牛血清白蛋白； 荧光光谱； 紫外光
谱； 三维荧光光谱； 圆二色谱
中图分类号： O433； O636． 1
文献标识码： A
DOI： 10． 3969 / j． issn． 1001-9731． 2014． 17． 008
* 基金项目： 国家杰出青年基金资助项目（ 51045216） ； 内蒙古高校基金资助项目（ NJZY13134） ； 内蒙古科技大学青年创新基金
资助项目（ 81111509）
收到初稿日期： 2013-05-15
收到修改稿日期： 2014-04-30
通讯作者： 吴锦绣，E-mail： wujinxiu888@ 126． com
the presence and absence of CS
表 1 不同温度下壳聚糖与牛血清白蛋白相互作用的猝灭常数 Kq 和线性关系 Ｒ Table 1 Stern-Volmer quenching constant and the linear relation for the interaction between CS and BSA at different tem-
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文章编号： 1001-9731（ 2014） 17-17040-05
2014 年第 17 期（ 45） 卷
分子量为 3 000 的壳聚糖与牛血清白蛋白相互作用的研究*
吴锦绣1，2 ，李 梅1，2 ，柳召刚1，2 ，胡艳宏1，2 ，王觅堂1，2
（ 1． 内蒙古科技大学 材料与冶金学院，内蒙古 包头 014010； 2． 内蒙古自治区高校稀土现代冶金新技术与应用重点实验室，内蒙古 包头 014010）
图 2 壳聚糖与牛血清白蛋白相互作用的紫外光谱图
规律是一致的，即 KA 随温度的升高而降低； 但紫外光 谱得出的结合常数比荧光光谱法得出的结合常数小 1
摘 要： 在模拟人体生理条件下，利用荧光光谱、圆
二色谱、紫外-可见吸收光谱法和三维荧 光 法 研 究 了
3 000分子量的壳聚糖（ CS） 与牛血清白蛋白（ BSA） 的
相互作用。结果表明，CS 对 BSA 的紫外吸收光谱具有
增强作用，而对荧光光谱具有较强的荧光猝灭作用且
峰位明显蓝移 8 ～ 10 nm。用 Stern-Volmer 方程分别对
2实验
2． 1 实验试剂 牛血清白蛋白（ BSA） 为美国 Sigma 公司产品，用
缓冲溶液配制成 0． 01 mol / L 的溶液，在冰箱（ 0 ℃ ） 中 储存，3 000 分子量的壳聚糖（ CS） 为浙江金壳生物化 学有 限 公 司 产 品，用 1% 的 HAC 配 制 成 2． 5 g / L （ 8． 33 × 10 － 4 mol / L） 的储备液。配制 0． 01 mol / L TrisHCl 缓冲溶液，pH 值 = 7． 36（ 内含 0． 15 mol / L NaCl 的 溶液，维持离子强度） ，实验用水为去离子二次蒸馏水， 其余试剂均为分析纯。 2． 2 样品分析测试
吸收池，在波长 190 ～ 500 nm 范围内逐次测定。
形成了复合物。BSA 在 340 nm 附近的发射峰是其色
3 结果与讨论
氨酸残基所产生的，而色氨酸残基的最大发射波长与 它所处的环境有关，发射波长蓝移表明 BSA 的构象发
3． 1 荧光发射光谱及荧光猝灭机制
生了变化，说明色氨酸残基周围的疏水性有所增加。
作者简介： 吴锦绣 （ 1976 － ） ，女，内蒙古乌兰察布人，副教授，硕士生导师，主要从事生物材料和稀土功能材料研究。
吴锦绣 等： 分子量为 3 000 的壳聚糖与牛血清白蛋白相互作用的研究
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的测定用相应的缓冲溶液作为参比，用 1 cm × 1 cm 石
从图 1 可看出，固定 BSA 的浓度，依次逐渐加入
peratures
T/K 297 310
3． 2 紫外吸收光谱
F0 / F = 1 + Kq τ0［Q］
F0 / F = 0． 9793 + 3． 585 × 10 － 4［Q］ F0 / F = 0． 9933 + 3． 183 × 10 － 4［Q］
Kq / （ L·mol － 1 ·s － 1 ）
图 1 以激发波长为 278 nm 激发 BSA 和 CS 溶液，
荧光猝灭过程通常可分为动态猝灭作用和静态猝
图中 λex = 278 nm ，CBSA = 10 μmol / L，图 1 （ a） -（ l） 的 Ccs = 0，0． 6，1． 5，8． 3，12． 3，16． 3，20． 3，26． 6，32． 8，44． 9，62． 4 和 87． 3 μmol / L。BSA 在 340 nm 附近有很强
线，通过斜率和截距求出 CS 与 BSA 分子的结合常数
Kb 见表 2 所示。
2014 年第 17 期（ 45） 卷
由荧光-猝灭分子间的结合常数表达式推导求出［16-17］，
见式（ 3）
log
F0
－ F
F
=
logKA
+ nlog［Q］
（ 3）
由拟合直线的截距和斜率可求得结合常数 KA 和 结合常数 n（ 见表 2） 。
过程速率常数远远大于最大扩散控制的速率常数，可
判断 CS 对 BSA 的荧光猝灭可能是属于生成复合物的
静态猝灭。
动态猝灭与静态猝灭也可依据不同温度下的猝灭
常数得以区别。对于动态猝灭，随着温度的升高，将增
加离子有效碰撞数目，加剧电子的转移，使荧光物种的
猝灭常数随温度的升高而增大； 若是静态猝灭，则温度