中药活性成分的生物转化学习报告

中药活性成分的生物转化

生物转化(biotransformation, bioconversion)，也称生物催化(biocatalysis)，是指利用植物离体培养细胞或器官、动物、微生物及其细胞器等对外源化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应，其本质是利用生物体系本身所产生的酶对外源化合物进行的酶催化反应。用于转化研究的生物体系主要有真菌、细菌、藻类、植物悬浮细胞、组织或器官以及动物细胞、组织等,其中应用最多的是植物细胞悬浮培养体系和微生物体系。生物转化反应具有选择性强、催化效率高、反应条件温和、反应种类多以及环境污染小等特点，并且往往可以用于催化有机合成中难以完成的化学反应。利用生物体对底物作用的多样性，可以丰富中药活性化合物的结构,从中找到活性更好的先导化合物，从而进行新药的研究与开发。生物转化是现代生物技术的重要组成部分, 而随着生物技术在中药现代化中的应用和发展，生物转化在中药活性成分筛选、活性成分的结构修饰、寻找新的药理活性成分及新药开发等应用方面越来越受到重视。1. 生物转化的研究方法

一般的生物转化研究过程是先将所使用的生物体系接种于培养液中进行预培养，调节生物体的生长状态，使其中的酶系具有较高的反应活性，然后投加底物。底物可以固体粉末的形式加入，亦可以适量的溶剂溶解后加入。若底物为脂溶性成分，可以用乙醇、丙酮、二甲基亚砜等有机溶剂溶解，但有机溶剂在培养液中的终浓度不宜超过1%，以免影响酶的活性。底物的加入量一般为每升培养液中加入30～100 mg。转化时间一般为2～8 d，有的则需持续十余天。生物转化是一个动态的过程，随着转化时间的延长，产物的种类和转化率会不断发生变化。此外，随培养时间的延长,生物体系自身分泌的物质也有所不同，会对转化结果产生影响。所以，培养液的后处理方法的使用也很重要。传统的生物转化方法主要包括：①分批培养转化法；②静止细胞转化法；③应用微生物孢子进行生物转化，空白背景干扰小，生物转化活力较高；④应用固定化细胞进行生物转化,可以反复使用，具有产物提取简单，便于自动化和大规模的工业化生产的优势；

⑤应用渗透细胞进行生物转化，适合于胞内酶作用的生物转化；⑥利用酶进行生物转化，具有专一性强的特点。目前中药生物转化主要分为微生物转化和酶转化，

涉及的化学活性成分包括生物碱、萜类、苷类、黄酮类、甾类及醌类等。

1.1 微生物转化

高等植物细胞增殖速度较慢, 而微生物繁殖速度极快且初级代谢迅速, 体内酶系相对简单。在极端环境下生存的微生物常能提供一些在极端条件下发挥作用的酶，微生物转化与哺乳动物的分解代谢机制相类似，故可作为预测药物代谢与毒理学方面的体外模型。微生物转化中药成分的研究始于20世纪90年代初,日本的小桥恭一发现中草药成分如番泻苷, 可借助肠道细菌转化为致泻有效成分,随后对系列糖苷类化合物如黄芩苷、人参皂苷等进行了研究, 指出糖苷类化合物为天然前药。此后，有研究灰色链霉菌对芦丁的生物转化及其产物对超氧阴离子的清除能力变化，其中有4个代谢产物的抗氧化活性比底物芦丁强。转化过程涉及到黄酮苷类的去羟基化反应为首次发现，证实了微生物转化是增加天然化合物多样性的有效方法。另外，Zhao Ying等用丝状真菌对原薯预皂苷进行生物转化、分离、鉴定了5个转化产物:3个一羟基转化产物和2个二羟基转化产物，并且通过活性分析发现化合物2-6相对于化合物1对K562细胞表现出较温和的细胞毒性。具体操作过程为：将化合物溶于热乙醇至5mg/ml.取100ml锥形瓶加入30ml土豆培养基。加入丝状真菌，孵育36h,180rpm,28.8℃,然后加入2mg化合物1，相同条件下反应96h,发酵完成后，过滤，用相同体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液之后减压蒸馏干燥，残留物用甲醇溶解做TLC分析，洗脱系统：甲醇-氯仿（1：10）。

再如青蒿酸的生物转化过程。青蒿酸是合成青蒿素的重要前体化合物，利用工程酵母菌将amorpha-4,11-diene定向转化为青蒿酸。体现了生物转化在中药

活性化合物的全合成或半合成中的应用,即利用酶促反应的专属性和高产率,将一些廉价的原料,转化成为目标产物。

其是通过基因工程途径改造啤酒酵母使其高效合成青蒿酸（最高可达100ug/L）：对其甲羟戊酸途径进行调控，并且转入编码amorphadiene（等价于amorpha-4,11-diene，合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前体原料）合酶和一种特异的细胞色素P450酶(CYP71AV1)的基因。这两种酶均源自青蒿，而且后者经过三步氧化作用将amorpha-4,11-diene转变成青蒿酸。青蒿酸合成后被转运到胞外并附着在酵母外表面上，这意味着通过简单且廉价的纯化过程就可以获得目标产物。

越来越多的研究表明，微生物转化是目前对中药进行生物转化的最主要方法。它的本质就是利用微生物体系产生的酶对外源性中药底物进行结构转化的生物化学过程。

微生物转化中药具有转化酶系广泛（如生长过程中会产生多样的酶系, 如纤维素酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶等，这些丰富而强大的酶系构成了高效生物催化体系的核心,且微生物酶系所催化的反应很多是一些化学合成难以进行的反应）、反应条件温和（由微生物所介导的转化反应一般都在常温、常压下进行,运行操作的设备也比较简便,产生的公害少,后处理也很简单。中药底物在转化过程中可以最大限度地保护中药中活性成分免遭破坏,可有效解决中药在煎、煮、蒸、浸等传统工艺中活性成分难以最大限度提取的难题）、反应选择性强（主要包括化学选择性、非对映异构体选择性、区域选择性、面选择性、对映异构体选择性以及立体选择性同时微生物转化修饰中药底物某一基团时对不需要转化的基团无需保护,显示出极高的选择性）、优化条件可使转化率提高（微生物转化中药底物的过程中易受到底物溶解度低,底物和产物抑制微生物酶活性和产物进一步降解等影响。为提高转化率,可以从诱导物和底物的添加, 表面活性剂的添加,碳源、氮源、无机盐,微量元素和酶的抑制剂以及微生物细胞和酶的固定化, 反应体系等方面进行选择优化），此外,微生物转化中药的反应可以被看作微生物发酵过程, 所以可以连续进行。

微生物转化中药具有这些独特的优势,用微生物来进行中药生物转化的研究在很大程度上加快了中药新药的开发和中药现代化的进程, 特别是在高中药