构建IL-4启动子区报告基因载体探讨甲基化对其启动子调控活性的影响
如何构建载体
如何构建载体1 启动子的选用和改造外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。
由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。
目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。
在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。
然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。
为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。
已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。
例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。
这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。
例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。
在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。
对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。
例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。
吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。
reporter assay的原理
reporter assay的原理Reporter assay是一种常用的生物学实验技术，用于研究基因表达和调控机制。
它通过将感兴趣的基因的启动子区域与一个报告基因（reporter gene）相连，来评估该启动子的活性。
本文将详细介绍reporter assay的原理和应用。
reporter assay的原理基于报告基因的表达能力。
报告基因是一种易于检测和定量的基因，它的产物可以通过荧光、发光或颜色变化等方式进行测量。
常用的报告基因包括β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、荧光蛋白（如绿色荧光蛋白，GFP）和火萤酶（luciferase）等。
这些报告基因的表达可以被外源性刺激或内源性转录因子的活性所调节。
在进行reporter assay之前，需要构建一个报告基因启动子结构。
这个启动子结构包括目标基因启动子区域和一个报告基因。
通常情况下，目标基因的启动子区域被克隆到一个报告基因的上游，使得报告基因的表达能够受到目标基因启动子的调控。
这个启动子结构可以被转染到细胞系或转基因动物中。
在实验过程中，首先需要将所构建的启动子结构转染到目标细胞中。
转染的方法可以是化学法、电穿孔法或病毒介导的转染。
转染后，目标基因的启动子将调控报告基因的表达。
接下来，可以通过荧光显微镜观察细胞中报告基因的表达情况，或者通过酶活性检测、光学检测或流式细胞术等方法进行定量分析。
通过reporter assay，可以评估目标基因启动子的活性和其受到的调控。
例如，研究人员可以利用reporter assay来研究转录因子的功能和调控机制。
他们可以构建一个包含目标基因启动子区域和报告基因的启动子结构，然后通过转染到细胞中，观察报告基因的表达情况。
如果某个转录因子能够结合到目标基因启动子上，并激活其转录活性，那么报告基因的表达将增加。
通过这种方式，研究人员可以鉴定转录因子与目标基因之间的相互作用，并进一步研究其调控机制。
双荧光素酶报告系统
基本原理
将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段 序列调控荧光素酶(luciferase)的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，给予其不同的处理后裂解细胞，并加 入底物荧光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin发出荧光(最强波长在560nm左右)。检测得到的荧光值高低 可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，通常会转入 Renilla luciferase的报告基因质粒作为内参(最强波长在465nm左右)，即双荧光报告系统。
3基本步骤
基本步骤
➊查询靶基因的转录调控作用位点 ➋载体的选择与构建 预测到靶基因的调控元件后，通常需要制备重组载体，根据研究种类的不同，报告基因载体及表达载体也有 所差异。研究其他分子对转录因子活性的影响时，需要构建报告基因载体和表达靶基因影响因素的载体
基本步骤
➌转染 将所要检测的质粒和带有海肾荧光素酶基因的质粒转染进入细胞内，扩增表达荧光素酶。
领域。
2 基本原理
基本原理
双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素。 萤火虫萤光素酶是一种胞内蛋白，大小为61KDa。在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下，催化底物萤火 虫萤光素氧化，生成氧化萤光素，并发出黄绿色光，其最强发光波长为560nm。
海肾萤光素酶也是一种胞内蛋白，大小为36KDa。只需要氧气就可以催化腔肠素，氧化生成高能产物 coelenteramide，并发出蓝光，其最强发光波长为465nm。
海肾报告基因，可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染
效率带来的干扰，起到校正的作用，从而使实验结果更为可靠。
浙江省名校协作体2023-2024学年高三上学期开学适应性考试生物试卷及答案
高三年级生物学科考生须知：1.本试题卷分选择题和非选择题两部分，共8页，满分100分，考试时间90分钟。
2.答题前，在答题卷指定区域填写班级、姓名、考场号、座位号及准考证号。
3.所有答案必须写在答题卷上，写在试卷上无效。
4.考试结束后，只需上交答题卷。
选择题部分一、选择题（本大题共20小题，每小题2分，共40分。
每小题列出的四个备选项中只有一个是符合题目要求的，不选、多选、错选均不得分）1.科学家们在北大西洋海底发现了一种新的古生菌Lokiarchaeota ，经DNA 序列分析被认为是在原核生物中与真核生物亲缘最近的生物，它的出现证明了真核生物正是从原核生物发展而来，而新发现的这种古菌就是桥梁。
下列叙述正确的是A.该古生菌具有生物膜系统B.该古生菌的核膜也含大量磷脂分子C.该古生菌的基因组中存在较多和真核生物相似的序列D.该古生菌细胞中存在多种细胞器2.自噬是存在于真核生物中，一种高度保守的蛋白质或细胞器降解的过程。
自噬发生时，一些损坏的蛋白质或细胞器等被双层膜结构的自噬小泡包裹，并最终送到溶酶体中降解。
下列叙述错误的是A.自噬溶酶体中溶液pH 值可能小于7B.自噬溶酶体可以水解蛋白质，也可水解多糖、DNA 、RNA 等物质C.降解产生的氨基酸等小分子物质可被细胞再利用，但不用于能量的产生D.自噬将消化作用局限在特定结构中，这对保证细胞中其他结构的完整性有重要意义3.百山祖冷杉特产于浙江南部，被认为第四纪冰川期冷杉从高纬度的北方向南方迁移的结果。
冷杉的果实是多种动物的食物来源，九十年代，由于当地群众有烧垦的习惯，加上其开花结实的周期长，被列为世界最濒危的12种植物之一。
下列相关叙述正确的是A.就地保护是对生物多样性最有效的保护B .随冷杉数量的减少，该地物种多样性受到影响C.人类活动不影响物种生成速度和物种灭绝速度的平衡D.冷杉对植物演变和气候变迁有重要科研价值，这属于生物多样性的直接价值第2题图2023学年第一学期浙江省名校协作体适应性试题4.如图为不同浓度生长素对植物生长的影响，下列相关叙述错误的是A.若此图表示生长素对植物根的影响，则E 点浓度对该植物的茎可能为促进生长B.若此图表示生长素对双子叶杂草的影响，则单子叶作物的最佳促进生长的浓度比B 点浓度大C.将生长素换成赤霉素，其他条件不变，也可以获得如图的曲线D.若植物幼茎向光侧生长素浓度对应A 点，则植物背光侧生长素浓度大于A 而小于C 点5.生态位表示生态系统中每种生物生存所必需的生境最小阈值。
启动子ebs顺式元件
启动子ebs顺式元件1.引言1.1 概述启动子ebs顺式元件是在基因组中起调控基因表达作用的重要元件。
它位于基因的上游区域，相当于基因的开关，能够启动或抑制基因的转录。
启动子ebs顺式元件的主要特点是其一致性和高度保守性，即在不同物种中保持高度相似的序列和功能。
这使得我们能够通过在不同物种中寻找具有相似启动子ebs顺式元件的基因来预测其功能和调控网络。
启动子ebs顺式元件在各种生物过程中发挥重要作用，包括胚胎发育、器官发生、细胞分化和疾病发生等。
通过结合生物信息学和实验手段，研究人员能够鉴定具有启动子ebs顺式元件的基因，并进一步揭示其调控网络和基因表达调控机制。
这将有助于我们更好地理解生物体的复杂性，并为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
总之，启动子ebs顺式元件在基因调控中具有重要作用，其功能和特点的研究将为我们揭示基因组的复杂性，推动生物学和医学的发展。
在下文中，我们将详细介绍启动子ebs顺式元件的定义和特点，以及它在不同领域中的应用。
1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：文章结构部分将为读者介绍本篇长文的整体框架和组织方式，以帮助读者更好地理解和阅读本文的内容。
本文共分为三个部分：引言、正文和结论。
在引言部分，将对启动子ebs顺式元件进行概述，介绍其定义、特点和目的。
这部分旨在引起读者的兴趣，并提供对本文主题的整体认识。
在正文部分，将深入探讨启动子ebs顺式元件的定义和特点。
通过对其组成和工作机制的详细介绍，读者将更好地理解启动子ebs顺式元件的实质和功能。
接着，将探讨启动子ebs顺式元件的应用领域，介绍其在科学研究、医学和工程领域中的具体应用案例。
这部分将为读者展示启动子ebs顺式元件的广泛应用及其潜在的影响力。
在结论部分，将对启动子ebs顺式元件的重要性进行总结，并强调其在科学研究和技术发展中的价值。
同时，展望启动子ebs顺式元件的未来发展，探讨可能的研究方向和应用前景。
这部分将为读者提供对启动子ebs 顺式元件未来趋势的展望，引发读者对进一步深入研究的兴趣。
(2024年高考真题含解析)2024年北京市普通高中学业水平等级性考试生物试卷(含解析)
2024年普通高中学业水平等级性考试北京卷生物试卷本试卷满分100分，考试时间90分钟。
养成良好的答题习惯，是决定成败的决定性因素之一。
做题前，要认真阅读题目要求、题干和选项，并对答案内容作出合理预测;答题时，切忌跟着感觉走，最好按照题目序号来做，不会的或存在疑问的，要做好标记，要善于发现，找到题目的题眼所在，规范答题，书写工整;答题完毕时，要认真检查，查漏补缺，纠正错误。
第一部分本部分共15题，每题2分，共30分。
在每题列出的四个选项中，选出最符合题目要求的一项。
1．关于大肠杆菌和水绵的共同点，表述正确的是（）A．都是真核生物B．能量代谢都发生在细胞器中C．都能进行光合作用D．都具有核糖体2．科学家证明“尼安德特人”是现代人的近亲，依据的是DNA的（）A．元素组成B．核苷酸种类C．碱基序列D．空间结构3．胆固醇等脂质被单层磷脂包裹形成球形复合物，通过血液运输到细胞并被胞吞，形成的囊泡与溶酶体融合后，释放胆固醇。
以下相关推测合理的是（）A．磷脂分子尾部疏水，因而尾部位于复合物表面B．球形复合物被胞吞的过程，需要高尔基体直接参与C．胞吞形成的囊泡与溶酶体融合，依赖于膜的流动性D．胆固醇通过胞吞进入细胞，因而属于生物大分子4．某同学用植物叶片在室温下进行光合作用实验，测定单位时间单位叶面积的氧气释放量，结果如图所示。
若想提高X，可采取的做法是（）A．增加叶片周围环境CO2浓度B．将叶片置于4℃的冷室中C．给光源加滤光片改变光的颜色D．移动冷光源缩短与叶片的距离5．水稻生殖细胞形成过程中既发生减数分裂，又进行有丝分裂，相关叙述错误的是（）A．染色体数目减半发生在减数分裂ⅠB．同源染色体联会和交换发生在减数分裂ⅡC．有丝分裂前的间期进行DNA复制D．有丝分裂保证细胞的亲代和子代间遗传的稳定性6．摩尔根和他的学生们绘出了第一幅基因位置图谱，示意图如图，相关叙述正确的是（）果蝇X染色体上一些基因的示意图A．所示基因控制的性状均表现为伴性遗传B．所示基因在Y染色体上都有对应的基因C．所示基因在遗传时均不遵循孟德尔定律D．四个与眼色表型相关基因互为等位基因7．有性杂交可培育出综合性状优于双亲的后代，是植物育种的重要手段。
白细胞介素4的研究进展
白细胞介素4的研究进展邢应如;陈蓓(综述);张荣波(审校)【摘要】白细胞介素4( IL-4)主要是活化T细胞产生的,来源于多种细胞的细胞因子。
IL-4对人体多种细胞具有生物学转化作用,IL-4与效应细胞表面IL-4Rα结合,促进靶基因转录,其生物学信号转导主要通过JAK-STAT通路、Ras-ERK通路、PI3K-PKB 通路三种途径。
IL-4对肿瘤、过敏性疾病、类风湿关节炎、造血干细胞移植、妊娠、再生障碍性贫血、缺血性心脏病、疫苗免疫等疾病具有多重生物学功能和治疗作用。
%Interleukin-4(IL-4) is mainly produced from the activated T cells,a cytokine derived from a variety of cells. IL-4 has a biological conversion function to a variety of cells in the human body:IL-4 com-bines with IL-4R alpha on the effector cell surface,promoting the transcription of target genes,and the biolog-ical signal transduction is mainly through three ways of JAK-STAT pathway,Ras-ERK pathway,andPI3K-PKB pathway. IL-4 has many biological functions and therapeutic effects on tumor,allergic disease,rheuma-toid arthritis,hematopoietic stem cell transplantation,pregnancy,aplastic anemia,ischemic heart disease,and vaccine immunity etc.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2015(000)019【总页数】5页(P3457-3461)【关键词】白细胞介素4;白细胞介素4受体;细胞因子;免疫反应【作者】邢应如;陈蓓(综述);张荣波(审校)【作者单位】安徽理工大学附属肿瘤医院检验科，安徽淮南232035;安徽理工大学附属肿瘤医院检验科，安徽淮南232035;安徽理工大学医学院免疫与检验教研室，安徽淮南232001【正文语种】中文【中图分类】R392.1白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)是一种多效性细胞因子，在调节T、B淋巴细胞和其他类型细胞的增殖、分化、凋亡［1-2］，促进以Th2细胞为特征的免疫应答过程中发挥重要作用。
ILT4在乳腺癌中的表达及其临床意义的开题报告
ILT4在乳腺癌中的表达及其临床意义的开题报告1. 研究背景和目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年增加，对女性健康产生严重威胁。
因此，研究乳腺癌发生的分子机制及其生物标志物潜在应用具有重要意义。
ILT4是一种免疫调节分子，可以调节T细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞的活性。
因此，在乳腺癌中的IL-4T表达及其临床意义有待深入研究。
本研究的目的是探讨ILT4在乳腺癌中的表达水平，评估其与临床病理特征的关系，并探讨其在乳腺癌患者预后中的应用价值。
2. 研究方法本研究将采用多种方法进行研究，具体如下：2.1 病例收集：收集50例乳腺癌患者的组织样本，包括癌组织和对照组织。
2.2 组织病理学分析：采用光学显微镜和病态分析方法对组织样本进行组织病理学分析，包括肿瘤大小、浸润性、组织分级等指标。
2.3 免疫组化：采用免疫组化方法检测ILT4在乳腺癌中的表达水平，并分析其在癌组织和对照组织中的差异。
2.4 数据分析：采用统计学方法对数据进行分析，并评估ILT4与临床特征、预后等指标之间的关系。
3. 预期结果预期本研究可以获得以下结果：3.1 在乳腺癌中，ILT4的表达水平较高，并且在癌组织中表达更为显著。
3.2 ILT4的表达水平与肿瘤大小、浸润性等临床病理特征密切相关。
3.3 高ILT4表达组的患者预后较差，与低ILT4表达组相比具有更高的死亡率和复发率。
4. 讨论和未来研究方向本研究的结果可以为进一步研究乳腺癌的分子机制及其生物标志物提供重要基础。
未来可以考虑采用更加精确的实验方法和更大样本量的临床研究来进一步验证本研究的结果，并探讨ILT4在乳腺癌治疗中的应用前景。
CRISPR-dCas9系统简介
CRISPR-dCas9系统简介dCas9蛋⽩是Cas9蛋⽩的突变体，即Cas9内切酶的RuvC1和 HNH两个核酸酶活性区域同时发⽣突变。
因此，dCas9蛋⽩的内切酶活性全部消失，只保留由gRNA引导进⼊基因组的能⼒。
CRISPR-dCas9系统提供了⼀个研究定点转录调控的平台。
在这个平台中，dCas9主要是与其他效应蛋⽩融合（如GFP、转录因⼦、组蛋⽩修饰等），进⾏基因调控，基因组成像，染⾊质或DNA修饰以及染⾊质免疫沉淀等。
Figure 8 :The Cas9 null mutant has lostboth of its DNA cleavage domains while still retaining its ability to targetgenomic loci through gRNA:DNA interactions. By fusing effector domains to theCas9 null mutant, it is possible to activate gene expression (i.e. V964 orNF-kB), repress gene expression (i.e. KRBA domain), visualize genomic loci(i.e. EGFP), perform chromatin remodelling (i.e. TET proteins), and simplifychromatin immunopercipitation (through an antibody epitope tag)⼀、转录调控系统2013年，齐等⼈将来⾃化脓性链球菌的Cas9的核酸酶结构域（在HNH结构域中产⽣H840A突变和在RuvC结构域中产⽣D10A突变）进⾏突变，以产⽣核酸酶缺陷的“dCas9”。
这种“钝化”和“死亡”Cas9失去切割DNA的功能，但在gRNA的指导下仍能以相同的精确度靶向和结合DNA。
双荧光素酶报告基因实验
双荧光素酶报告基因实验引言。
双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告基因实验是一种常用的生物学实验技术，用于研究基因表达调控机制。
该实验利用双荧光素酶系统，通过测定荧光素酶和荧光素酶的活性，来研究基因的转录和翻译水平。
本文将介绍双荧光素酶报告基因实验的原理、步骤和应用。
原理。
双荧光素酶报告基因实验基于双荧光素酶系统，该系统包括两种荧光素酶，火榴荧光素酶（Firefly Luciferase）和海洋荧光素酶（Renilla Luciferase）。
火榴荧光素酶是一种广泛应用的报告基因，在转录和翻译水平均可用于检测基因表达水平。
海洋荧光素酶则常用作内参基因，用于校正样品中的变异。
在双荧光素酶报告基因实验中，研究者首先将感兴趣的启动子区域或转录因子结合位点克隆到双荧光素酶报告载体中。
然后将该载体转染入目标细胞中，通过测定火榴荧光素酶和海洋荧光素酶的活性，来研究基因的转录和翻译水平。
步骤。
双荧光素酶报告基因实验的步骤主要包括载体构建、细胞培养、转染、荧光素酶活性测定和数据分析。
1. 载体构建，将感兴趣的启动子区域或转录因子结合位点克隆到双荧光素酶报告载体中，构建实验所需的报告基因载体。
2. 细胞培养，选取适当的细胞系，进行细胞培养并分装到96孔板中。
3. 转染，将构建好的双荧光素酶报告载体转染入目标细胞中，使其表达双荧光素酶。
4. 荧光素酶活性测定，使用双荧光素酶检测试剂盒，分别测定火榴荧光素酶和海洋荧光素酶的活性。
5. 数据分析，根据荧光素酶活性测定结果，计算目标基因的表达水平，并进行统计学分析。
应用。
双荧光素酶报告基因实验在基因表达调控机制研究中有着广泛的应用。
它可以用于研究转录因子结合位点的功能、筛选miRNA的靶基因、评估药物的影响等。
此外，双荧光素酶报告基因实验还可以用于高通量筛选和药物开发。
结论。
双荧光素酶报告基因实验是一种重要的生物学实验技术，它通过测定火榴荧光素酶和海洋荧光素酶的活性，来研究基因的转录和翻译水平。
白细胞介素4参与调控骨改建的研究进展
白细胞介素4参与调控骨改建的研究进展唐榕1，2，31 山东大学齐鲁医学院口腔医学院·口腔医院骨代谢研究室山东省口腔组织再生重点实验室，济南250012；2 山东大学骨质疏松与骨矿盐疾病研究中心；3 山东大学口腔医学院口腔基础医学教研所摘要：骨骼系统的稳定依赖骨改建的动态平衡，其受到体内复杂微环境的调控，免疫系统也参与其中。
异常的免疫微环境会打破机体内骨改建的平衡，进而诱发多种骨相关疾病。
白细胞介素4（IL-4）作为一种经典的适应性免疫调节细胞因子，通过多种途径直接或间接参与骨改建的调控，在很多骨相关疾病中发挥重要作用。
IL-4可通过信号通路直接影响成骨细胞和破骨细胞，还可通过影响T细胞、B细胞和巨噬细胞间接调控骨改建，且参与骨相关疾病（关节炎、骨质疏松症、牙周炎、骨移植不良反应）的发生、发展。
关键词：骨相关疾病；白细胞介素4；骨改建；免疫调节细胞因子doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.31.024中图分类号：R681 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）31-0097-05骨改建是指旧骨不断吸收，新骨不断形成的过程，是骨骼系统经历的有序且耦合的动态连续过程。
骨改建可分为3个阶段，即破骨细胞介导骨吸收、骨髓间充质干细胞（BMSC）来源的成骨细胞被募集到骨吸收的部位、成骨细胞介导骨形成［1］。
成骨细胞和破骨细胞共同参与骨改建过程，它们构成的动态平衡决定体内骨骼系统的稳定。
同时，骨改建的过程受多种病理因素的影响，包括雌激素缺乏、衰老、疾病、药物和免疫系统紊乱。
免疫细胞分泌的各种可溶性介质会影响成骨细胞和破骨细胞的活性，包括细胞因子、趋化因子和生长因子［1］。
其中白细胞介素（IL）是免疫细胞产生的细胞因子，能够激活和调节免疫细胞，在炎症反应中发挥重要作用。
IL-4作为一种经典的适应性免疫调节细胞因子，不仅参与免疫功能的调节，还在皮炎、过敏、哮喘、肿瘤等疾病中发挥作用。
RNA沉默survivin基因及其对启动子甲基化的影响的开题报告
RNA沉默survivin基因及其对启动子甲基化的影响的开题报告研究背景和意义survivin是一种在肿瘤细胞中高度表达的IAP蛋白，具有抗凋亡和促增殖的功能。
因此，survivin已成为肿瘤治疗中的重要靶点。
RNA干扰技术是一种有效的治疗肿瘤的方法之一，因为它能特异性地降低某一基因的表达，包括survivin。
而且，启动子甲基化是被认为是导致基因沉默的一种重要方式。
因此，研究RNA沉默survivin基因及其对启动子甲基化的影响的机制，对于深入理解survivin在肿瘤发生和发展中的作用，以及肿瘤治疗方面的推广应用都具有重要的意义。
研究内容和方法本研究拟采用RNA干扰技术对人肺癌A549细胞中survivin基因进行沉默，通过Western blot和Real-time PCR检测survivin蛋白和mRNA 的表达水平，验证RNA干扰的效果。
同时，采用甲基化特异性PCR （MSP）和甲基化敏感的限制酶切分析（MSRE）检测survivin基因启动子区域的甲基化状态，定量分析survivin启动子区域的甲基化水平的变化。
最后，通过CCK-8试验和Transwell实验检测RNA干扰survivin基因对A549细胞增殖和迁移的影响，以及甲基转移酶抑制剂5-Aza对RNA干扰survivin基因的影响。
研究预期结果预计RNA干扰可有效地降低A549细胞中survivin的表达，同时，survivin基因启动子区域的甲基化水平将发生显著的变化，且甲基转移酶抑制剂5-Aza可影响RNA干扰survivin基因的效果。
最终，本研究可深入探讨survivin基因在肺癌中的作用机制，为寻找治疗和预防肺癌的新靶点提供重要的理论依据。
基因甲基化与启动子的关系
基因甲基化与启动子的关系
基因甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式，它通过在DNA分子中添加甲基基团来影响基因表达。
甲基化通常发生在基因的启动子区域，这些区域包含了调控基因表达的关键序列。
甲基化的程度可以影响基因的表达水平。
在启动子区域高度甲基化的基因通常表达较低，而在这些区域甲基化较低的基因则表达较高。
此外，甲基化的模式也可以对基因表达产生差异。
例如，在一些基因中，只有在特定的位置甲基化才会影响基因表达，而在其他基因中，整个启动子区域的甲基化状态都会对基因的表达产生影响。
最近的研究表明，甲基化可以通过多种方式影响基因表达。
其中一种方式是通过影响转录因子的结合。
转录因子是一种能够结合到DNA中的蛋白质，它们在基因表达调控中起着关键作用。
一些甲基化的位置在影响转录因子的结合，从而影响基因表达。
另一种影响基因表达的方式是通过影响染色质结构。
染色质是一种由DNA和蛋白质组成的复杂分子，它对基因表达的调控起着关键作用。
甲基化可以影响染色质的结构和可访问性，从而影响基因的表达。
总的来说，基因甲基化在调控基因表达中起着重要作用。
了解基因甲基化与启动子的关系，可以为人们深入理解基因表达调控机制提供重要的线索。
- 1 -。
启动子序列调控基因表达功能与遗传性疾病关系紧密讨论
启动子序列调控基因表达功能与遗传性疾病关系紧密讨论引言：启动子序列是基因表达的关键调控元件，它在转录起始点上游的DNA序列上存在，并通过与转录因子的结合来调节基因的表达。
近年来的研究表明，启动子序列调控异常与多种遗传性疾病之间存在密切关系。
本文将探讨启动子序列调控基因表达功能与遗传性疾病之间的关系，并讨论其在疾病诊断和治疗上的潜在应用。
1. 启动子序列调控基因表达的机制启动子序列是一段DNA序列，通常位于基因转录起始点上游，包含有转录因子结合位点。
启动子序列的调控可以通过多种机制实现，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、转录因子结合和非编码RNA的干扰等。
这些调控机制相互作用，共同决定了基因的表达水平和时机。
2. 启动子序列调控异常与遗传性疾病之间的关系许多遗传性疾病与启动子序列调控异常密切相关。
首先，某些基因的启动子序列突变导致转录因子无法结合，从而使基因的表达受到限制或抑制。
例如，突变引起的启动子序列异常在乳腺癌发生中发挥了重要作用。
其次，启动子序列调控异常还可以导致基因的过度表达，从而引发疾病。
例如，某些免疫系统疾病可能与启动子序列过度活化引起的免疫反应过强有关。
此外，启动子序列调控异常还与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关。
因此，深入研究启动子序列调控异常和遗传性疾病之间的关系，有助于揭示疾病的发病机制和找到治疗相关疾病的新靶标。
3. 应用启动子序列调控研究于遗传性疾病的诊断和治疗通过对启动子序列调控的研究，可以为遗传性疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
首先，通过研究不同遗传性疾病中的启动子序列突变模式，可以发展出一种基于序列分析的遗传性疾病快速筛查方法。
其次，对启动子序列调控的深入了解可以帮助我们鉴定疾病相关的转录因子，进而针对这些转录因子进行研究和疾病治疗。
例如，一些药物研发团队正在致力于开发可以调控特定启动子序列的药物，用于治疗与这些序列异常有关的遗传性疾病。
此外，通过研究启动子序列的调控机制，还可以开发出基于RNA干扰的新治疗方法，用于治疗与特定启动子序列异常有关的疾病。
gal启动子作用原理
gal启动子作用原理Galactose（半乳糖）是一种单糖，是蔗糖和乳糖的组成部分。
在生物体内，半乳糖的代谢需要多个酶的参与。
其中，Galactokinase （GALK）是一个重要的酶，它能够催化半乳糖和ATP反应生成半乳糖-1-磷酸和ADP。
GALK基因启动子（GALK promoter）是一段DNA序列，它能够调控GALK基因的转录过程。
本文将详细介绍GALK启动子作用原理。
一、GALK基因及其调控1.1 GALK基因GALK基因位于人类染色体17号上，编码Galactokinase酶。
该酶主要存在于肝脏、小肠、肾脏和红血球中，负责将半乳糖转化为半乳糖-1-磷酸。
1.2 GALK基因调控GALK基因的转录过程受到多种调控机制的影响。
其中，最为重要的是启动子区域上结合转录因子（Transcription factor, TF）所形成的复合物对其活性进行调节。
二、启动子结构与功能2.1 启动子结构GALK启动子是一个位于GALK基因上游的DNA序列，其长度约为1.5 kb。
该启动子区域包含了多个结合转录因子的DNA结合位点（Transcription factor binding site, TFBS）。
2.2 启动子功能GALK启动子的主要功能是调节GALK基因的转录活性。
当TF与其DNA结合位点发生作用时，可以促进或抑制GALK基因的转录过程。
三、TF在GALK启动子上的作用3.1 TF种类在GALK启动子上，有多种TF参与其调控过程。
其中，最重要的TF 包括CREB、HNF1和Sp1。
3.2 CREB作用机制CREB（cAMP response element-binding protein）是一种重要的转录因子，它能够与cAMP响应元件（cAMP response element, CRE）结合，并促进基因转录。
在GALK启动子上，CREB可以通过与其相应的CRE位点结合来增强GALK基因的转录活性。
双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验引言。
双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告实验是一种常用的生物学实验技术，用于研究基因表达调控、转录因子活性、信号转导通路等生物学过程。
该实验利用双荧光素酶作为报告基因，通过测定其产生的荧光信号来研究目标基因的表达水平和调控机制。
本文将介绍双荧光素酶报告实验的原理、操作步骤和数据分析方法，以及该技术在生物学研究中的应用。
一、双荧光素酶原理。
双荧光素酶系统由火萤酶（Luciferase）和甲基火萤酶（Renilla Luciferase）两种荧光素酶组成，分别对应于两种不同的底物荧光素和甲基荧光素。
在双荧光素酶报告实验中，将目标基因的启动子区域与火萤酶基因或甲基火萤酶基因连接，构建成双荧光素酶报告载体。
通过转染该报告载体到细胞中，利用双荧光素酶底物依次检测火萤酶和甲基火萤酶的活性，从而测定目标基因的表达水平和调控机制。
二、实验操作步骤。
1. 构建双荧光素酶报告载体，将目标基因的启动子区域克隆至双荧光素酶报告载体中，构建成双荧光素酶报告载体。
2. 细胞培养和转染，选择适当的细胞系进行培养，将构建好的双荧光素酶报告载体转染到细胞中。
3. 荧光素酶活性检测，使用双荧光素酶检测试剂盒，按照说明书进行火萤酶和甲基火萤酶的活性检测。
4. 数据采集和分析，测定荧光素酶活性的荧光信号，并进行数据的统计分析和图表展示。
三、数据分析方法。
1. 荧光素酶活性比较，分别测定转染实验组和对照组的火萤酶和甲基火萤酶活性，计算两者的荧光信号比值，用于比较目标基因的表达水平。
2. 荧光素酶活性调控分析，在不同处理条件下进行双荧光素酶报告实验，比较不同条件下的火萤酶和甲基火萤酶活性，分析目标基因的调控机制。
四、双荧光素酶报告实验的应用。
1. 研究基因表达调控，通过双荧光素酶报告实验，可以研究转录因子对目标基因启动子的调控作用，揭示基因表达调控的分子机制。
2. 研究信号转导通路，利用双荧光素酶报告实验，可以分析信号转导通路中的关键分子对目标基因表达的调控作用，揭示信号转导通路的调控机制。
DNA甲基化在基因表达调控中的意义及研究进展
DNA甲基化在基因表达调控中的意义及研究进展钟焱;徐慧;彭凤兰【摘要】DNA甲基化修饰作用是目前表观遗传学的研究热点.其参与基因表达调控、基因沉默、DNA损伤修复以及癌症发生等重要生物学过程,大多癌症的致病过程、免疫系统疾病、阿尔茨海默病等疾病都涉及表观遗传学改变,基因的甲基化主要发生在富含GC碱基序列的CpG区域,基因在相应的甲基化转移酶的作用下调控癌基因、致癌基因的表达和DNA的损伤修复等.本文结合最新研究进展综述DNA 甲基化在基因组中的基因表达调控中的意义及研究进展.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2019(016)014【总页数】4页(P33-36)【关键词】启动子;甲基化;基因表达调控【作者】钟焱;徐慧;彭凤兰【作者单位】长沙卫生职业学院科研处,湖南长沙410100;长沙卫生职业学院护理系,湖南长沙410100;长沙卫生职业学院医学基础部,湖南长沙410100【正文语种】中文【中图分类】R34表观遗传学指基因的核酸序列不发生改变的情况下基因的表达却发生了可遗传改变的现象，甲基化是一种重要的表观遗传修饰作用，它可在不改变基因序列的前提下，对基因序列中的碱基进行甲基基团修饰，以此抑制或促进基因的表达而影响机体功能，是生物体内蛋白质和核酸的一种重要的修饰方式，与癌症、衰老、免疫系统等多种疾病的发生发展密切关联，是表观遗传学的热点研究内容[1-2]。
如结直肠癌细胞中有许多异常的甲基化基因，主要包括非启动子区域的总体低甲基化和启动子区域的高甲基化[3]，基因低水平甲基化或去甲基化可激活基因的表达，导致癌基因表达上调或细胞染色体空间结构不稳定；基因高水平甲基化则关闭或沉默某些基因的活性，使得抑癌基因表达下调或DNA损伤修复受抑制，进而影响细胞周期、细胞凋亡等功能。
1 DNA甲基化与基因表达DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的作用下，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程，可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等，哺乳动物的DNA甲基化主要发生在G/C含量丰富的5′-CpG-3′序列的C碱基上。
IDO启动序列GAS和ISRE荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测
IDO启动序列GAS和ISRE荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测江冠民;匡艳华;邱瑜;谢婉莹;张秋桂;欧阳新平【摘要】Objective To construct two luciferase reporter gene vector pGL3-Enhancer-ISRE4 and pGL3-Enhancer-GAS7 , and to identify their biological activity of them. Methods The promoter sequences ISRE4 (4 series ISRE sequence) and GAS7 (7 series GAS sequence) were synthesized which regulate the expression of IDO,then they were cloned into empty vector pGL3-Enhancer respectively to construct two luciferase reporter vectors pGL3-Enhancer-ISRE4 and pGL3-Enhancer-GAS7 ,which were amplified by transformation and identified by restriction enzymedigestion,sequencing,and the biological activity detecting. Re-sults Two luciferase reporter vectors pGL3-Enhancer-ISRE4 and pGL3-Enhancer-GAS7 were successfully constructed,the ex-pression of luciferase could be induced by IFN-γ. Conclusion The two luciferase reporter gene vectors of pGL3-Enhancer-ISRE4 and pGL3-Enhancer-GAS provide a very important tool for studying the regulation mechanisms of IDO protein expression and supplying a fast,high-throughput screening for anti-tumor immune tolerance drug which targeting the IDO.%目的构建pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS两个荧光素酶报告基因载体,并对其进行生物活性鉴定。
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全科 医学 论 著 ・
构建 Ｉ Ｌ ４ 启动 子区报告基 因载体探 讨 甲基化 对 其 启动 子调 控 活 性 的影 响
邹颖 ， 顾 军， 王 学 民
摘要： 目的 白细胞介素 ４ （ Ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｌ ｅ ｕ ｋ ｉ ｎ － ４ ， Ｉ Ｌ － ４） 在特 应性皮 炎等疾 病 的发 病机制 中发 挥着关键 的作用 ， 但 其基 因
． １ ２ ３ ８
中华全科医学
２ ０ １ ５年 ８月第 １ ３卷第 ８期
Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｌ Ｐ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｃ ｅ ， Ａ ｕ ｇ ｕ ｓ ｔ ２ ０ １ ５ ， Ｖ ｏ １ ． １ ３ ， Ｎ ｏ ． ８
ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｅ ｉ ｎ Ｉ Ｌ ４ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ． ｗ ｈ ｉ ｃ ｈ ｉ ｎ ｃ ｒ ｅ ａ ｓ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ ｌ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｆ Ｉ Ｌ ４ ｗａ ｓ ｔ ｉ ｌ ｌ ｕ ｎ ｋ ｎ ｏ ｗ ｎ ｃ ｕ ｒ ｒ ｅ ｎ ｔ ｌ ｙ ． Ｔ ｈ ｅ ａ ｉ ｍ ｏ ｆ ｔ ｈ ｉ ｓ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｗａ ｓ ｔ ｏ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｌ ｕ ｅ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｓ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ｅ ｐ ｏ ￣ ｅ ｒ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ＤＮＡ ｍｅ ｔ ｈ ｙ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｎ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｃ ｉｐ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｉ Ｌ ４ ｇ ｅ ｎ ｅ ｐ ｒ ｏ ｍｏ ｔ ｅ ｒ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ
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关键词 ： 白细胞介 素 ４ ； 甲基 化 ； 报告基 因载体
中图分类号 ： Ｒ ７ ５ ８ ． ２ Ｒ ４ ４ ６ ． ７ 文献标 识码 ： Ａ 文章编 号 ： １ ６ ７ ４ ４１ ． ５ ２ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ８ ． １ ２ ３ ８ － ０ ４
Ｃｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｌ ｕ ｃ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｓ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｐ ｓ ｉ ＣＨＥＣＫ － Ｉ Ｌ４－ ｐ ｒ ｏ ｍｏ ｔ ｅ ｒ ｒ ｅ ｐ ｏ ｒ ｔ ｅ ｒ ＺＯＵ Ｙ ｉ ｎ ｇ， Ｇ Ｕ Ｊ ｕ ｎ， Ｗ ＡＮＧ
甲基化改变 与疾病 相关性 尚不明确 。本研究通 过构建 荧光素 报告 基因载 体 ， 检测 Ｄ Ｎ Ａ 甲基 化对于 Ｉ Ｌ 一 ４ 基 因启 动子转 录活性 的影响。方法 以 Ｊ ｕ ｒ ｋ ａ ｔ 细胞基 因组 Ｄ Ｎ Ａ为模 板 ， Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 Ｉ Ｌ ． ４ 启动子 调控序列 片段 ， 连接人 克 隆载体 ｐ ｓ ｉ Ｃ ＨＥ Ｃ Ｋ荧光素报告载体 。采用补丁 甲基化 （ ｐ ａ ｔ ｃ ｈ ｍ ｅ ｔ ｈ ｙ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ） 技术， 在体 外对 Ｉ Ｌ ＿ ４启 动子基 因片段进 行 甲基化处 理 ， 构建 甲基化 Ｉ Ｌ ４ 启动子报告基 因载体 。采用 电穿孔 转染技术 ， － 将ｐ ｓ ｉ Ｃ Ｈ Ｅ Ｃ Ｋ ． Ｉ Ｌ － ４ ． ｐ ｒ ｏ ｍ ｏ ｔ ｅ ｒ 荧光 素 报告载体转染 至 Ｊ ｕ ｒ ｋ ａ ｔ 细胞 ， 对 甲基化 和未 甲基 化载体 的荧 光素酶进 行检测 ， 比较其对 Ｉ Ｌ ＿ ４ 基 因转 录水 平 的影 响。结果 琼脂糖凝胶 电泳证实获得 了 Ｉ Ｌ ４ 启动子 区域基 因序列 ， － 测序结果与 Ｇ ｅ ｎ ｂ ａ ｎ ｋ中一致 ， 成功构建 了 Ｉ Ｌ － ４
启 动序 列及 其甲基化的 ｐ ｓ ｉ Ｃ Ｈ Ｅ Ｃ Ｋ — Ｉ Ｌ － ４ 一 ｐ ｒ ｏ ｍ ｏ ｔ ｅ ｒ 荧光素酶报告基 因载体。经检测 ， 甲基化报告基 因载体 的转录活 性较未 甲基 化载体明显降低 ， 相对 比例为 ０ ． ４ ３ ：１ 。结论
调 Ｉ Ｌ ＿ ４表达水平 。
Ｉ Ｌ ＿ ４ 启 动子序列 低 甲基化可 导致其 转 录活 性升高 ， 上
Ｉ Ｌ ４ ｐ ｒ ｏ ｍｏ ｔ ｅ ｒ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｗａ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｊ ｕ ｒ ｋ ａ ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｇ ｅ ｎ ｏ ｍｅ ＤＮＡ ｂ ｙ Ｐ Ｃ Ｒ． Ａｎ ｄ ｃ ｏ ｎ ｎ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ａ ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ