高效液相色谱法 大学课件

色谱理论：速率理论-影响柱效的因素
1. 速率方程（也称范· 弟姆特方程式）
H = A + B/u + C· u H：理论塔板高度， u：载气的线速率(cm/s)。 减小A、B、C三项可提高柱效。 存在着最佳流速。 A，B，C三项各与哪些因素有关？
载气流速与柱效——最佳流速
载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效的 主要因素，流速，柱效。 载气流速低时： 分子扩散项成为影响柱效 的主要因素，流速,柱效 。 H - u曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影 响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度 对流速的一阶导数有一极小值。 以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即 为最佳流速。
一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；
试样一定时，K主要取决于固定相性质；
每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。
3.分配比 （partition radio）k
关，它表示了固定相对
这两种组分的选择性。
4.区域宽度
衡量色谱峰宽度的参数，三种 表示方法：
（1）标准偏差()：即0.607倍峰
高处色谱峰宽度的一半。
（ 2 ）半峰宽 (Y1/2) ：色谱峰高一
半处的宽度 Y1/2 =2.354 。
（3）峰底宽(Wb)：Wb=4 。
分配系数（ partition coefficient） K
二、HLPC与经典液相色谱和气相的比较
高效液相色谱与经典液相色谱比较
经典液相色谱 常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测 高效液相色谱 高压，40～50MPa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高,40000～60000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次使用 能在线检测
色谱理论：塔板理论-柱分离效能指标
1.塔板理论（plate theory）
半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过 程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过 程的重复。
塔板理论的假设：
(1) 每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；
(2) 将载气看作成脉动（间歇）过程； (3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略； (4) 每次分配的分配系数相同。
一、基本概念
俄国植物学家茨维特使用的装置： 色谱原型装置如图，用来分离植物叶 片的色素。管子中的填充物固定不动 ，称为固定相（碳酸钙）；将色素提 取物置于管子上端，靠重力往下流， 同时用石油醚淋洗；石油醚称为流动 相（携带试样混合物流过固定相）。 管子及填充物可以称为色谱柱。 色谱三元素！
一、基本概念与特点
组分在固定相和流动相间发生的吸附、解吸，或溶解、 挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间 分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系 数，用K 表示，即：
组分在固定相中的浓度 cS K 组分在流动相中的浓度 cM
分配系数是色谱分离的依据。
分配系数 K
的讨论：
组分在固定相中的浓度 K 组分在流动相中的浓度
有效塔板数和有效塔板高度
• 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。
• 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 • 组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效 塔板高度：
tR 2 tR 2 n理 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Wb
t t 2 5.54( ) 16( )2 Y1/ 2 Wb
分离度的表达式：
2(t R 2 t R1 ) R Wb 2 Wb1 2(t R 2 t R1 ) 1.699[Y1 / 2 ( 2 ) Y1 / 2 (1) ]
R=0.8：两峰的分离程度可达89%； R=1：分离程度98%； R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。
三、HPLC仪器结构
注射器 进样器 高压泵 混合室
预柱
接头
溶剂
色谱柱
检测器 数据系统
图10－1 HPLC仪器结构图
第2 节
HPLC的分类与基本原理
一、 高效液相色谱法的原理 HPLC与经典LC和GC在基本原理、概念和方法 基本上相同，主要差别是流动相的性质不同。 因此，某些公式的表现形式或参数的含意有些 差别。 化合物的极性、电荷、分子大小、旋光 性四种主要的性质可以用来产生高效液相色谱
分离机理： 吸附色谱法是被分离的组分分子(溶质分子) 与流动相分子争夺吸附剂（固定相）表面活性 中心，因溶质分子的吸附系数的差别而分离。
影响容量因子(k)的因素：
以硅胶吸附剂为例：
1. 吸附色谱法 LSC
⑴ 硅胶与溶质分子的亲和力顺序：kmin→饱和 烃＜芳烃＜…＜酯醛酮＜…＜羧酸→kmax
k大者后出峰。
⑵ 溶质的极性：常用流动相是以烷烃为底剂， 加入适当的极性溶剂组成二元或多元溶剂系 统，从而能调整溶解的极性，控制组分的保 留时间。溶剂系统的极性越大，洗脱力越强。
二、HLPC与经典液相色谱和气相的比较
高效液相色谱与气相色谱比较
气相色谱 只能分析挥发性物质，只能分 析20%的化合物 不能分析热不稳定物质 用毛细管色谱可得到很高的柱 效 有很灵敏的检测器如ECD和较灵 敏的通用检测器(FID和TCD) 流动相为气体，无毒，易于处 理 运行和操作容易 仪器制造难度较小 高效液相色谱 几乎可以分析各种物质 可以分析热不稳定物质 色谱柱不能很长，柱效不会很 高 没有较高灵敏的通用检测器 流动相有毒，费用较高 运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大
分离度
塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分
离程度。即柱效为多大时，相邻两组分能够被完全分离。
难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综 合影响：保留值之差──色谱过程的热力学因素； 区域宽度──色谱过程的动力学因素。 色谱分离中的四种情况如图所示：
讨论：
色谱分离中的四种情况：
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③柱效较低，ΔK较大，但分离的不好。 ④ ΔK小，柱效低，分离效果更差。
（动画）
色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔 板数：n，则三者的关系为 n=L/H 色谱峰的方差 与柱长或保留时间的关系为：
H
2 L
L

t2 L
t
2 R
理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
tR 2 tR 2 n 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Wb
保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!
3
HPLC
4
5
空间排阻色谱法 SEC
6 7 8 9
亲合色谱法 胶束色谱法 手性色谱法
AC MC CC
开管～OTCEC 填充～PCEC
毛细管电泳色谱法 CE
三、各类高效液相色谱法 1. 吸附色谱法(LSC) 2. 分配色谱法(LLC) 3. 化学键合色谱法(BPC) 4. 其他色谱法
1. 吸附色谱法 LSC
（2）用体积表示的保留值
保留体积（VR）： VR = tR×qv qv为柱出口处的载气流量， 单位：m L / min。 死体积（VM）： VM = tM ×qv 调整保留体积(VR＇)： V R＇ = VR －VM
3. 相对保留值r21
相对保留值只与柱 温和固定相性质有关， 与其他色谱操作条件无
' R ' R
n有效
H 有效
L n有效
塔板理论的特点和不足
(1)当L一定时，n 越大(H 越小)，被测组分在柱内被分 配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 (2)不同物质在同一色谱柱上的 K 不同，用n有效和H有效 作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。 (3) 柱效的高低不能表示被分离组分的实际分离效果 ，当两组分的分配系数 K 相同时，无论该色谱柱的塔板 数多大，都无法分离。 (4) 塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速 下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及 提高柱效的途径。
概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60 年代末，以经典液相色谱为基础，引入了气 相色谱的理论，在技术上采用了高效固定相、 高压输液系统和高灵敏度的在线检测器，从 而发展起来的一种新型分离分析技术。随着 科学和技术的不断改进与发展，目前已成为 应用极为重要、广泛的分离分析手段. 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围 广、操作自动化。
速率理论的要点：
(1) 组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯 度所造成的分子扩散、传质阻力使气液两相间的分配平衡 不能瞬间达到等是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。
(2) 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度 及载气流速可提高柱效。
(3) 为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明 了流速和柱温对柱效及分离的影响。 (4) 各种因素相互制约：载气流速增大，分子扩散项的 影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大， 又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子 扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。
讨论：
（1）分离度与柱效
分离度与柱效 (n) 的平方根成正比，r21一定，增加柱 效，可提高分离度。但通过增加柱长来增加 n 使组分保留 时间增加且峰扩展，分析时间长。
（2）分离度与r21
增大r21是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相 同分离度下，当r21增加一倍，需要的n有效 减小10 000倍。 增大r21的最有效方法是选择合适的固定液。
第2 章
第1 节 第2 节 第3 节 第4 节 第5 节 第6 节 第7 节 第8 节
高效液相色谱法
概述 HPLC的分类与基本原理 各类高效液相色谱法 固定相 流动相 高效液相色谱仪 定性、定量分析方法 应用与示例