人hepcidin真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立
人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达
人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达王中华;窦科峰;杜建军;陈勇【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2003(024)011【摘要】目的: 构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白. 方法: 采用反转录-聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2 cDNA中,分别扩增出Heparanase编码基因,用限制性内切酶BamHI消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1中,经酶切鉴定与测序证实后,连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体. 以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白. 结果: 构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实, 与GenBank登录结果完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pcDNA3.1及pRSET;SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功. 结论: 成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体,成功正确表达了6His/Heparanase融合蛋白.【总页数】4页(P968-971)【作者】王中华;窦科峰;杜建军;陈勇【作者单位】第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西,西安,710033【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.正、反义Heparanase基因荧光真核表达载体的构建及胰腺癌SW1990细胞转染 [J], 杨彦;陈陵;崔明;段体德2.人β-防御素-3基因定点突变,原核表达载体构建和融合蛋白表达 [J], 金琳;韩跃武3.人线粒体融合蛋白-2基因真核表达载体的构建与鉴定 [J], 徐弋;曹成建;赵丽;徐华;杨晓玲;韩学波;田珏;姜怡邓4.人分化抑制因子3基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达 [J], 贾丽;李晓军5.人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定 [J], 王春美;盛光耀;卢洁;郝庆飞;谢垒;白松婷;许松涛;薛乐勋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
最新 人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立-精品
人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立作者：杨俊霞石华魏丽丽袁成福陈济易发平马永平宋方洲【关键词】 MCHR2；真核表达载体；转染；基因表达【Abstract】 AIM: To construct the eukaryotic expression vector of human melaninconcentrating hormone receptor 2 (MCHR2) and stably transfect HEK293 cells with it. METHODS: The fulllength MCHR2 cDNA fragment was amplified by PCR from the human fetal brain cDNA library and was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). After identification of restriction digestion and PCR, the recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells by lipofectamine. After screening culture by G418, a stablytransfected cell line was established, and the transcription and expression of the MCHR2 gene were identified by RTPCR, Western blot and immunofluorescence assay. RESULTS: The eukaryotic expression vector pcDNA3.1MCHR2 was successfully constructed and the MCHR2 gene was transfected stably into HEK293 cells. A stablytransfected cell line was established and the MCHR2 gene was expressed successfully. CONCLUSION: The establishment of the stablytransfected cell line and the expression of the target gene provide a solid experimental foundation forfurther studies on the function of the MCHR2 gene.。
如何构建稳定转染的细胞系（株）？
如何构建稳定转染的细胞系（株）？稳定细胞株构建包含哪些关键步骤？A：如下♀一般稳定细胞株的构建包含以下几个部分：表达之类构建细胞转染pool细胞筛选单克隆筛选细胞库建立表达质粒构建A：如下♀将带有内切酶位点的抗体轻重链碱基序列通过聚合酶链反应(PCR) 方法合成，然后与载体连接构建表达质粒，抗体的轻重链可放在不同载体上。
为保证克隆到载体中的靶基因的准确性，在转染宿主细胞前需对表达质粒中的靶基因进行测序。
细胞转染A：如下♀将表达质粒通过四种不同的方法（化学法、物理法、脂质体转染、病毒转染）导入哺乳动物细胞内，最为常用的是电穿孔转染法、脂质体转染法和聚乙烯亚胺介导的转染方法。
转染的成功率取决于细胞的活性、质粒DNA 的纯度、转染试剂及转染方法。
Pool细胞筛选A：如下♀细胞池筛选与评估：转染后的细胞需要在选择性培养基中培养至活率完全恢复，用以产生稳定的细胞池。
选择试剂的使用取决于表达载体携带的选择基因及宿主细胞的类型。
过于CHO K1细胞，通常不含谷氨酰胺的培养基中添加MSX进行筛选；而DG44和DXB11细胞通过不含呈甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶，并对细胞池增加MTX的选择压力来提高抗体表达水平。
在细胞池筛选阶段，需要对细胞池表达抗体的产量和关键质量进行评估，根据评估结果选择3-4个细胞池进行克隆。
单克隆筛选A：如下♀单克隆筛选与评估：传统的单克隆筛选方法多采用有限稀释法，形成率呈泊松分布。
为保证单克隆的单一性，需要一轮以上的克隆筛选，通常低于1个细胞/孔的方法进行铺板，挑选300个克隆经过24孔板、6孔板、T方瓶的摇瓶逐级扩增，最后挑选出10-20个克隆进行摇瓶规模评估，根据细胞生长和产物质量特性，挑选出4-6克隆进一步在反应器中评估，并建立RCB。
三级细胞库的建立A：如下♀细胞库的建立为满足大规模抗体生产的需要。
根据生物反应器评估结果及细胞株稳定性研究数据，选择生产用工程细胞株及备选细胞株，并建立原始细胞库PCB，然后GMP条件下建立主细胞库和工作细胞库。
FKBP12真核表达载体的构建及稳定转染A549细胞株的建立
------------------------------华 美 制 作------------------------------豆 丁 推 荐↓精 品 文 档华美制作------------------------------华美制作FKBP12真核表达载体的构建及稳定转染A549细胞株的建立*汤莹1方琦2史道华2△（1福建医科大学福总临床医学院福建福州350025；2南京军区福州总医院药学科福建福州350025）摘要目的：构建FK506结合蛋白12(FK506binding proteins 12,FKBP12)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。
方法：RT-PCR 扩增人平滑肌细胞FKBP12基因片断，构建pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12真核表达载体，经琼脂糖电泳、特异性内切酶切割及测序验证其正确性。
脂质体法转染真核细胞A549，Hygromycin B 筛选建立稳定转染的细胞株，免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。
结果：构建了FKBP12真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株，成功表达FKBP12蛋白。
结论：FKBP12真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立，为深入研究基于FKBP12靶点药物的机制奠定基础，进而为探索安全、高效的免疫抑制剂提供新的途径。
关键词：FK506结合蛋白12(FK506Binding proteins 12,FKBP12)基因；真核表达载体；稳定转染中图分类号：Q782，R734.2文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2010）04-617-03Construction of Eukaryotic Expressing Vector of FKBP12and Establishmentof Stable Transfectant A549Cell Line*TANG Ying 1,FANG Qi 2,SHI Dao-hua 2△(1Fuzhong Medical school of Fujian Medical University,Fuzhou 350025,China;2Dept.of Pharmacy,Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command,Fuzhou 350025,China)ABSTRACT Objective:To construct the eukaryotic plasmid of FK506Binding proteins 12(FKBP12)and transfect A549cell so as to establish stable cell line.Methods:The whole objective gene was cloned by RT-PCR from VSMCs.Eukaryotic victor pcDNA3.1/Hy-gro(+)-FKBP12was connected and by enzyme digestion and DNA sequencing .We transfected the recombinant vector into A549cell by lipofectamine TM 2000.Stable transfected A549cell line was established after screening culture by Hygromycin B and was identified by Western blot.Results:The eukaryotic expression vector pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12was constructed,stable transfected A549cell line was established and FKBP12protein was expressed successfully.Conclusion:The construction of the eukaryotic expression vector pcD-NA3.1/Hygro (+)-FKBP12and the establishment of stable transfected A549cell line not only lay the foundation for the further research into the mechanism of drug targets based on FKBP12but also provide a safe and efficient way for myocardial new immunosuppressive agents.Key words:FK506Binding proteins 12（FKBP12）;eukaryotic expression vector;stable transfection Chinese Library Classification:Q782,R734.2Document code :A Article ID:1673-6273(2010)04-617-03*基金项目：福建省自然科学基金项目(No.2008J0103)；南京军区医学科学技术研究"十一五"计划课题（06MA154）作者简介：汤莹（1986-），女，硕士研究生，主要研究方向：分子药理及心血管药理学△通讯作者：史道华，教授，电话：*************，E-mail:**************（收稿日期：2009-12-15接受日期：2010-01-10）前言FKBPs 属于免疫亲和素(Immunophilin )的一个亚类，现已发现FKBP 家族成员20多个[1]，FKBP12是免疫抑制剂FK506结合蛋白(FK506-binding protein ，FKBP)家族的主要成员。
人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立
人Ｐ２Ｘ７真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立 魏林郁，卢娜，孟莉，李新娟，李璐，李超【基金项目】国家自然科学基金（８１２７１３７６）；河南省教育厅科学技术重点研究项目（１４Ａ３１００１９，１４Ａ３１０００９，１６Ａ３１００１１）；河南省基础与前沿技术研究计划资助项目（１１２３００４１０１６４）【收稿日期】２０１６ ０２ ２９【修回日期】２０１６ ０５ ３０△【通讯作者】Ｔｅｌ：０３７３ ３０２９１０４；Ｅ ｍａｉｌ：ｘｙｌｄｌ８＠１２６．ｃｏｍ共表达，并且不同Ｐ２Ｘ受体亚型彼此之间有着密切的拮抗或协同效应，又都以ＡＴＰ作为同一配体，因此难以在原代细胞中单独研究Ｐ２Ｘ７受体的结构、信号转导与调控机理。
因此本研究构建了ｐＥＧＦＰ Ｎ１／Ｐ２Ｘ７真核表达载体，转染人胚肾细胞（ＨＥＫ２９３），观察人Ｐ２Ｘ７的蛋白表达及在细胞内定位，建立稳定表达的ＨＥＫ２９３细胞株，旨在体外单独研究Ｐ２Ｘ７离子通道结构与功能，为进一步探讨Ｐ２Ｘ７受体相关疾病发病机理、治疗靶点及药物研发奠定基础。
１材料与方法１．１材料人脑组织Ｐ２Ｘ７全长ｃＤＮＡ（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，美国）；感受态细菌Ｅ．ｃｏｉｌＤＨ５ａ（北京天根生化科技有限公司）；质粒ｐＥＧＦＰ Ｎ１（上海吉凯基因化学技术有限公司）；ＨＥＫ２９３细胞由本实验室保存。
１．２仪器和试剂胎牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，美国）；ＤＭＥＭ高糖培养基（杭州吉诺生物医药技术有限公司）；Ｘ ｆｅｃｔ转染试剂盒（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，美国）；限制性内切酶ＤｐｎＩ（ＴａＫａＲａ，日本）；质粒提取试剂盒（ＯＭＥＧＡ，美国）；Ｇ４１８（Ｓｉｇ ｍａ，美国）；兔源Ｐ２Ｘ７多克隆抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ，以色列）；ＳＤＳ ＰＡＧＥ凝胶配制试剂盒、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ碱性磷酸酯酶显色试剂盒、Ｔｕｂｕｌｉｎ兔抗大鼠多克隆一抗、ＡＰ标记羊抗兔ＩｇＧ二抗（上海碧云天生物技术有限公司）；ＰＣＲ反应引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；倒置荧光显微镜（ＺＥＩＳＳ，德国）；ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ Ｒａｄ，美国）；激光共聚焦显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ／ＦＶ１０００，日本）；流式细胞仪（ＢｅｃｋＭａｎ／ＦＣ５００，美国）。
SARI基因真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立
南京军区福州总医院临床遗传与实验医学科 （ 福州 ３ ５ ０ ０ ２ ５ ） 郑 德 柱
【 摘 要】 目的 构 建 人 Ｓ ＡＲ Ｉ 基 因真 核 表 达 载体 ，并 建 立稳 定 转 染 的 Ｈｅ Ｌ ａ细 胞 系 。 方 法 采 用 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ 技 术 从 正
Ｈｏ ｓ ｐｉ ｔ ａ ｌ ，Ｆｕ ｚ ｈ ｏ ｕ，Ｆｕ ｊ ｉ ｎ ｎ ３ ５ ０ ０ ２ ５ ，Ｃｈ ｉ ｎ ａ
［ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔｏ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｔ ｈ ｅ ｅ ｕ ｋ ａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｏ ｆ Ｓ Ａ ＲＩ ｇ ｅ ｎ ｅ ａ ｎ ｄ ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｔ ｈ ｅ Ｈｅ Ｌ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｉ ｎ ｅ ，ｏ ｂ ｓ ｅ ｒ ｖ ｅ
常人外周血单个核细胞 ｃ Ｄ ＮＡ 文 库 中扩 增 ｓ Ａ Ｒ Ｉ 基 因序 列 ，连 接 插 入 至 ｐ Ｃ ＭＶ— Ｎ — Ｆ ｌ ａ ｇ真 核 表 达 载 体 ，并 对 重 组 质 粒 进 行 酶 切 及 测 序 鉴 定 ； 阳离 子 聚合 物 介 导 重组 质 粒 转 染 Ｈｅ Ｌ ａ细 胞 后 ，用 Ｇ４ １ ８抗 生 素 筛 选 稳 定 转 染 的 细 胞 系 。 间 接 免 疫 荧 光 检 测
Ｆ ｌ ａ ｇ — Ｓ Ａ ＲＩ 融 合 蛋 白在 Ｈｅ Ｌ ａ 细 胞 系 中 的表 达 定 位 。Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ及 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 检测 Ｓ ＡＲＩ ｍＲ ＮＡ 及 蛋 白 的 表 达 变 化 。 结 果 双酶切 和 Ｄ ＮＡ 测 序 表 明 ｐ ＣＭＶ － Ｆ ｌ ａ ｇ — Ｓ Ａ ＲＩ 真 核 表 达 质粒 构 建 成 功 。经 Ｇ ４ １ ８筛选 后 ，Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ和 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 表 明 ，转 染 重 组 质粒 的 Ｈｅ Ｌ ａ细胞 系 中 Ｓ Ａ ＲＩ ｍＲ ＮＡ 及 蛋 白的 表 达 明 显 升 高 。 间 接 免 疫 荧 光 结 果 显 示 ，Ｆ ｌ ａ ｇ － Ｓ ＡＲ Ｉ 融 合 蛋 白 在 Ｈｅ Ｉ ａ 细 胞 系 的胞 质 和 胞 核 中 均 有 表 达 ，且 胞 质 荧 光 信 号 强 于 胞 核 。 结 论 成 功 构 建 ｐ Ｃ ＭＶ － Ｆ ｌ ａ ｇ — Ｓ ＡＲ Ｉ 真 核 表 达 载 体 ，表 达 的 Ｆ ｌ ａ ｇ －
人肿瘤抑素基因真核表达载体的构建及其活性研究
（． ３ ±０ ０ １ 。结 论 成 功 构 建 了 ｐ １ ｍ 重组 载体 ， 建 的 重组 载 体 能 有 效 表 达 ， 其 后 的 抗 肿 瘤 血 管 生 ０３５ ． １） ＡＡＶ Ｔｕ 构 为
成 治 疗研 究 奠 定 了基 础 。
【 键 词 】 肿 瘤 抑 素 ； 腺 相 关病 毒 ； 基 因治 疗 关
检验 医 学 与 临 床 ２ ｌ 年 １ ０１ ２月第 ８卷 第 ２ ４期 Ｉ ｂＭｅ ｌ Ｄ ｃｍｂ ｒ Ｏ １ Ｖｏ． ， ． ４ ｄＣ ｉ ｅｅ ｅ ｌ ， １８ Ｎｏ ２ ａ ｎ， ２
酶 双 酶 切 ， 后 与 经 同 样 酶 部 分 酶 切 处 理 的 ｐ ＡＶ ＭＣ 然 Ａ Ｓ载 体 进 行 连 接 ， Ａ 连 接 酶 连 接 。取 ５ Ｉ转 化 ＤＨ５ 大 肠 埃 Ｔ４ＤＮ
Ｃｈｉ ａ） ｎ
［ ｓｒ ｃ］ Ｏｂｅ ｔ ｅ Ｔｏｃ ｎ ｔｕ ｔｔ ｅｒｃ ｍｂｎ ｎ ｄ ｎ —ｓ ｏ ｉｔｄｖｒ ｓ（ ＡＡＶ）ｖ ｃｏ ｏ ｔｉｉｇ ｔｍｓａ Ａｂｔａ ｔ ｊｃｉ ｖ ｏ ｓｒ ｃ ｈ ｅｏ ｉａ ｔａ ｅ ｏａ ｓ ｃａｅ ｉｕ ｒ ｅ ｔ ｒｃ ｎ ａｎｎ ｕ ｔ
血 管 的牛 成 。
Ｔ Ｔ Ａ 由 大 连 宝 生物 工 程 有 限公 司合 成 。 ＴＴ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ ３，
１ ２ 方 法 ．
本 研 究 通 过 构 建 人 Ｔ ｍｓ ｔ ｕ ｔ ｉ 因 真 核 表 达 载 体 ， 步 研 ａ ｎ基 初
究 其 在 体 外 对 血 管 内皮 细 胞 生 长 的 影 响 ， 探 讨 Ｔｕ ｔｉ 为 ｍｓａｎ基
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
有 研 究 证 明 ， 瘤 的新 生 血 管 能 为 肿 瘤 提 供 营 养 、 泄 及 肿 排 代 谢 产 物 ， 进 肿 瘤 生 长 ， 为 肿 瘤 细 胞 的 转 移 提 供 途 径 】 促 并 。
稳定转染细胞株（系）详细构建流程
稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
人Hepcidin融合表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达
人Hepcidin融合表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达张怀;袁其朋;朱亚平;马润宇【期刊名称】《中国生物工程杂志》【年(卷),期】2005(25)3【摘要】为了在大肠杆菌中表达生产hepcidin ,根据大肠杆菌密码子偏好性 ,化学合成了人hepcidin的基因序列 ,并构建了hepcidin的融合表达载体pET -hpc。
pET- hpc在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中表达的hepcidin融合蛋白以包涵体形式存在 ,其N端带有 6个组氨酸。
通过优化诱导表达条件 ,该融合蛋白表达水平显著提高 ,占总蛋白的 2 5 . 2 %。
表达的包涵体经 1 %TritonX 1 0 0洗涤后溶于8mol L 尿素 ,在变性条件下采用金属螯合层析进行纯化 ,所得融合蛋白纯度大于 95 %。
【总页数】5页(P44-48)【关键词】融合表达载体;ET;融合蛋白;大肠杆菌;包涵体;总蛋白;表达水平;诱导表达;密码子;变性【作者】张怀;袁其朋;朱亚平;马润宇【作者单位】北京化工大学生命科学与技术学院制药工程系【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q786【相关文献】1.嗜铬颗粒蛋白B-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 油红捷;毋晓涛;潘颖;王泽生2.重组人肝刺激因子非融合性蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化[J], 刘贺佳;吴媛;杨琳;安威3.融合蛋白表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 [J], 李莉;高秀来;宋一志;陆涛;景鹏4.pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 张晓红;夏春波;刘源劼;蒋常文;门楠K39/UreB双基因融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 张炜阳;李岩;吴同山;罗文华;胡斌;胡文锋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达
[文章编号] 16712587Ⅹ(2008)0120057204[收稿日期] 2007205223[基金项目] 吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(20061550)[作者简介] 舒振波(1972-),男,吉林省长春市人,主治医师,在读医学博士,主要从事胃肠道肿瘤研究。
[通讯作者] 张桂珍(Tel :0431284995423,E 2mail :zhangguizhenjlu @yahoo 1com )核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其在CH O 细胞中的表达舒振波1,操海萍2,王大民3,张桂珍3(11吉林大学中日联谊医院胃肠外科,吉林长春130033;21吉林大学中日联谊医院泌尿外科,吉林长春130033;31吉林大学中日联谊医院中心实验室,吉林长春130033)[摘 要] 目的:构建人核心蛋白聚糖(DCN )真核表达载体,并在CHO 细胞中进行表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。
方法:以含有人DCN cDNA 的质粒pBluescript 为模板,采用聚合酶链式反应(PCR )扩增目的基因片段。
真核表达载体pcDNA3及PCR 产物经X ba Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切后连接,转化大肠杆菌J M109,获得重组载体pCDNA 2DEC ,进行酶切鉴定和测序鉴定。
脂质体lipofectamine 介导重组载体转染CHO 细胞,经G418(800mg ・L -1)筛选建立稳定转染细胞株。
采用细胞免疫组织化学方法检测稳定转染CHO 细胞中DCN 表达。
结果:PCR 获得与预期大小一致约1000bp 的特异性DNA 片段;重组载体pCDNA 2DEC 经双酶切鉴定及测序证实,人DCN 基因cDNA 片段正确插入真核表达载体中;在稳定转染的CHO 细胞株中可见DCN 蛋白表达。
结论:成功构建DCN 真核表达载体pCDNA 2DEC ,并建立稳定转染CHO 细胞株。
[关键词] 核心蛋白聚糖;基因表达;转染;CHO 细胞[中图分类号] R329128 [文献标识码] AConstruction of decorin expression vector andits expression in CH O cellsSHU Zhen 2bo 1,CAO Hai 2ping 2,WAN G Da 2min 3,ZHAN G Gui 2zhen 3(11Department of Gastroenterology ,China 2J apan Union Hospital ,Jilin University ,Changchun 130033,China ;21Department of Urinary Surgery ,China 2J apan Union Hospital ,Jilin University ,Changchun 130033,China ;31Central Laboratory ,China 2J apan Union Hospital ,Jilin University ,Changchun 130033,China )Abstract :Objective To construct a eukaryotic expression vector of decorin (DCN ),and observe its expression in CHO cells ,in order to provide a basis for further study on the anti 2tumor effect of DCN.Methods DCN cDNA was amplified by PCR.The human f ull 2length DCN cDNA ligated into pBluescript was used as template.The fragment was ligated to the expression vector pCDNA3previously digested with X ba Ⅰand Eco R Ⅰ.The ligation mixture was transformed into competent E.coli J M109cells.Transformants containing inserts were confirmed by restrictive digestion and DNA sequencing.The expression vector was transfected into CHO cells using lipofectamine ,and transfected cells were cultivated in DM EM containing G 418(800mg ・L -1)for about 2months.Immunohistochemistry method was used to detect the expression of DCN protein in stably transfected cells.Results The PCR product was about 1000bp.The recombinant expression vector was identified by restrictive digestion and DNA sequencing.DCN protein was detectable in stablely transfected cells.Conclusion The recombinant eukaryotic expression vector pCDNA 2DEC is constructed successf ully and stablely transfected CHO cells are established.K ey w ords :decorin ;gene expression ;transfection ;CHO cells75第34卷 第1期2008年1月吉 林 大 学 学 报 (医 学 版)Journal of Jilin University (Medicine Edition )Vol.34No.1 J an.2008 核心蛋白聚糖(decorin,DCN)是细胞外基质的重要组成成分。
人PSCA真核表达质粒的构建及稳定转染B16细胞系的建立
ｃｌ ｒ ｂ ４８ ａ ｔ ｌ ｔ ｎｆ ｔ １ ｌｌ ｅ ａ ｔ ｌｈｄ Ｔ ｅ ｘｒｓｏ Ｐ Ｃ ｎ ａ ｉ ｎｆｄｂ ｌ ｙ ｍ ｔ ， ｍ ｎｆｏ ｕｕｅ ｙ １ ， ｓ ｂ ａｓ ｃ ｄＢ ６ｃ ｌｉ ｓ ｅ ａ ｉ ｅ ．ｈ ｐｅｓ ｎｏ Ｓ Ａｇ ｅ ｓ ｄ ｔ ｅ ｙＦ ｗＣｔ ｅ ｙＩ ｕｏ ｕ一 ｔ Ｇ ａｙｒ ｅｅ ｅ ｎ Ｗ ｓ ｂ ｓ ｅ ｉ ｆ ｅ Ｗ ｅ ｉ ｉ ｏ ｏ ｒ ｍ ｌ
色素瘤 Ｂ ６细胞系。方法 ： １ 利用 Ｐ Ｒ扩增出人 ＰＣ Ｃ Ｓ Ａ全长基 因的 ｅ Ｎ Ｄ Ａ编码 区序列 ， 使用基因重组 技术将其 克隆到真核表达载
体 ｐＤ Ａ ． 中 ， ｃ Ｎ ３ １ 得到重组表达质粒 ｐＤ Ａ ．－Ｓ Ａ ｃ Ｎ ３ １ＰＣ 。双酶切 及测序鉴 定后 ， 利用 脂质体 法将其 转染入 小 鼠黑色素瘤 Ｂ ６细 １
人 ＰＣ Ｓ Ａ真榜表达厦犍 掏建 塑宣筮塑 望 绁堕丕 蕉童 筮
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分பைடு நூலகம் 与细胞 免疫 学 ・
人 ＰＣ Ｓ Ａ真 核 表达 质粒 的构 建 及 稳定 转 染 Ｂ ６细胞 系的建 立① １
ｔ ｎ ｅ ｚ ｍｅ ｄｇ ｓ ｏ ｎ ＮＡ ｓｑ ｅ ｃｎ ． ｈ ｎ ｔｅ ｐａ ｍｉ ｃ Ｎ ． － Ｓ Ａ ａ ｒｎ ｆｃｅ ｎｏ Ｂ１ ｅ ｓｂ ｉｏｅ ｔ ｎ Ａ ｔｒｓ ｒｅ ｉｇ ｉ ｎｙ ｉｅ ｔ ｎ ａ ｄ Ｄ ｕ ｎ ｉｇ Ｔ ｅ ｈ ｌ ｏ ｉ ｅ ｓ ｄ ｐ Ｄ Ａ３ １ Ｐ Ｃ Ｗ ｔ ｓｅ ｔｄ ｉｔ ６ ｃ ｌ ｙ ｌ ｆｃｉ ． ｆ ｃ ｅ ｎｎ ｓ ａ ｌ ｐ ｏ ｅ
tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立
ｔ Ｓ真核表达载体构 建及稳定转 染 Ｈｅ Ｇ Ｔ ｐ ２细胞 系的建立
帅 丽 芳 赵 勇 张 若 霜 银 涛 唐 博 恒 ， ， ， ，
（．广 州 军 区 疾 病 预 防 控 制 中 心 ， 东 广 州 ５ ０ ０ ；２ １ 广 １ ５ ７ ．中 山大 学 实验 动 物 中心 ， 东 广 州 ５ ０ ８ ） 广 １０ ０
经 酶切 和 测序 鉴 定后 ， 脂 质 体 转 染 法 转 染 Ｈｅ Ｇ２细 胞 ， 过 Ｇ４ ８筛 选 ， 立 稳 定 转 染 的 Ｈｅ Ｇ２细 胞 系， ＲＴ－ 用 ｐ 通 １ 建 ｐ 用
Ｐ Ｒ、 ｓｅｎ ｂｏ Ｃ Ｗｅ ｔｒ ｌｔ法 检 年 测 ｔ ＴＳ的 表 达 ， 功 构 建 了 ｐ ｏ —ｔ Ａ ｔ Ｓ Ｎ ｏ真 核 表 达 载 体 ， 建 立 了稳 定 转 染 的 成 Ａｐ Ｅ ｒＴ —Ｔ — ｅ 并 Ｈｅ Ｇ２细 胞 系 ， 功 地 表 达 目的基 因 。 真 核 表 达 载 体 成 功 构 建 和 稳 定 转 染 Ｈｅ Ｇ２细 胞 系的 建 立 为 进 一 步 研 究 ｔ Ｓ ｐ 成 ｐ Ｔ
ＳＥＮ ｉ ｒ ｉｙ ， ｕ ｇｚ ｕＧ ｕ Ｕｎ ｖｅ ｓ ｔ Ｇ ａｎ ｈｏ ａｎｇｄｏ ｇ １０ ８０， ｎ ５ ０ Ｃｈｉ ｎａ） Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｉ ｒ ｅ Ｏ ｃ ｓ ｒ ｃ ｕｋ ｙ ｉ ｘｐ ｅｓ ｉ ｃｏｒｏｆｔ ｅ ｒ ｃ ｃｉ ｅ ｏ ｒ ｌｄ ｔ ａ ｃ ｉ ｉｎａ ｉｅ ｅ （ Ｔ Ｓ）， ｓｒ ｃ ：ｎ ｏ ｄ ｒ ｔ ｏｎ ｔ ｕ ｔｅ ａｒ ｏｔｃ ｅ ｒ ｓｏｎ ｖｅ ｔ ｈｅ ｔ ｔ ａ ｙ ｌｎ ｃ ｎｔｏｌｅ ｒ ｎｓ ｒｐｔｏ １ｓｌｎｃ ｒ ｔ ａ ｒ ｎ ｆ ｃ ｅ Ｇ ２ ｃ ｌｓｔ ｓａ ｉｈ ｓ ａ ｅ Ｈ ｅ Ｇ ２ ｃ ｌ ｌｎｅ ｔ ｕｌ ｌ ｎ ｈ ｔ Ｓ ｎｄ ｔ ａ ｓ ｅ ｔＨ ｐ ｅｌ ｏ ｅ ｔ ｂｌｓ ｔ ｂｌ ｐ ｅｌ ｉ ． ｈｅ ｆ ｌ ｅ ｇｔ Ｔ ＤＮ Ａ ｒ ｇ ｅ ｓ ａ ｐｌ ｉ ｄ ｂｙ ＰＣＲ ｆ ａ ｍ ｎｔｗａ ｍ ｉ ｅ ｆ
人p75 NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达
人p75 NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达鲁秀敏;朱枫;黄鹏;余瑛;王永堂【期刊名称】《重庆理工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2008(022)012【摘要】构建了人p75神经营养素受体(p75 neurotmphinreceptor,p75NTR)cDNA序列的绿色荧光真核表达载体,并鉴定其在人胚肾293(human embryo kiddy 293,HEK293)细胞中的表达.采用PCR方法从含人p75NTR的pDC316-HP75质粒中扩增目的片段,经EcoRI和SalI双酶切,定向克隆于pEGFP-N1质粒中,构建绿色荧光真核表达载体pEGFP-N1-HP75,经酶切及测序鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,激光共聚焦及Western blot法鉴定人p75NTR的表达.结果表明,酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有人p75NTR编码序列,转染实验表明,重组质粒能够在HEK293细胞中表达出具有活性的人p75NTR 片段.【总页数】5页(P48-52)【作者】鲁秀敏;朱枫;黄鹏;余瑛;王永堂【作者单位】重庆工学院,化学与生物工程学院,重庆,400050;重庆工学院,化学与生物工程学院,重庆,400050;重庆工学院,化学与生物工程学院,重庆,400050;重庆工学院,化学与生物工程学院,重庆,400050;第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆,400042【正文语种】中文【中图分类】Q343【相关文献】1.p75真核表达载体的构建及其在PC-3细胞中的表达 [J], 陈昌杰;汪华侨;徐杰;何蕴韶2.SK2和 JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在 HEK293细胞中的表达 [J], 罗天霞;樊红琨;芮丹丹;孙佳翕;马小芳;章茜3.人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立 [J], 袁成福4.人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达 [J], 李轩岸;黄玉梅;姚芳玲;范洁琳;雷光华;黎明5.pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的表达 [J], 徐婧;侯赋园;王德彬;李竣;胡鑫;杨光忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
moFcγRⅢ、γ链真核表达载体的构建及其共转染稳定细胞系的建立
moFcγRⅢ、γ链真核表达载体的构建及其共转染稳定细胞系的建立席俊;唐志鹏;张利娜;宋爱宾;王少兵;张改平【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2011(040)008【摘要】将moFeγRⅢ、γ链编码区eDNA分别亚克隆到真核表达栽体pcDNA3的巨细胞病毒启动子下游,构建了重组表达质粒pe3moRⅢ、pe3moγ;用PvuⅠ线性化重组质粒,以线性化重组质粒其转染COS -7细胞,用玫瑰花环试验检测moFeγRⅢ在转染细胞表面的表达,通过G418抗性筛选和单细胞克隆,在转染细胞表面稳定表达了moFeγRⅢ受体分子.稳定转染细胞系的建立和moFeγRⅢ受体分子基因的表达,为进一步研究moFeγRⅢ的功能提供了基础.【总页数】4页(P190-193)【作者】席俊;唐志鹏;张利娜;宋爱宾;王少兵;张改平【作者单位】河南工业大学粮油食品学院,河南郑州450052;福山区畜牧局,山东福山265500;招远市畜牧局,山东招远265400;招远市畜牧局,山东招远265400;招远市畜牧局,山东招远265400;河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放实验室,河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.人透明质酸酶真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立 [J], 刘霞;刘飞;刘少英;朱希强;凌沛学2.SARI基因真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立 [J], 郑德柱3.甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立 [J], 孟越;谢苗苗;林振;袁亮;李威;郝松;杨德鸿4.MIIP真核表达载体的构建及其稳定过表达MDA-MB-231细胞系的建立 [J], 徐荣荣;裴秀英;吕叶;马锐;苏芹;金彦国;陈捷珲;高玉婧5.DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染HeLa细胞系的建立 [J], 王欣;詹媛;王琰;周恩民;丁铲;谭磊;陆凤;徐乐乐;仇旭升;宋翠萍;孙英杰;廖瑛;茅翔因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立
tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立帅丽芳;赵勇;张若霜;银涛;唐博恒【摘要】为了构建tTS真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系,采用PCR方法,以质粒pTet-tTS为模板扩增tTS基因的编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pApoE-rtTA-Neo,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用RT-PCR、Western blot法检年测tTS的表达,成功构建了pApoE-rtTA-tTS-Neo真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的基因.真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究tTS 的功能奠定良好的实验基础.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(030)004【总页数】4页(P336-339)【关键词】tTS;基因表达;真核表达载体;HepG2细胞系【作者】帅丽芳;赵勇;张若霜;银涛;唐博恒【作者单位】广州军区疾病预防控制中心,广东,广州,510507;中山大学,实验动物中心,广东,广州,510080;中山大学,实验动物中心,广东,广州,510080;广州军区疾病预防控制中心,广东,广州,510507;广州军区疾病预防控制中心,广东,广州,510507【正文语种】中文【中图分类】Q785动物模型研究是疾病研究中的重要手段,合适的动物模型对于人类疾病的研究意义尤其重大。
但是由于转基因技术是一种基因全表达或不表达的技术,基因表达常不局限在一个器官,一个组织,简单的转基因技术无法回答基因功能的细节问题。
此外,转基因动物转入的外源基因常常由于某些基因表达产物使细胞或胚胎不耐受,从而妨碍了转基因动物的建立。
故目的基因表达在时序和水平上的有效调控,将有益于基因功能的研究、动物模型发育期间基因表达的分析以及基因治疗过程中基因的运载。
人黑色素浓集激素1型受体真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立
人黑色素浓集激素1型受体真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立袁成福;杨俊霞;魏丽丽;石华;陈济;易发平;马永平;宋方洲【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2007(32)1【摘要】目的构建人黑色素浓集激素1型受体(MCHR1)真核表达载体,转染CHO 细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO 细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR1的表达.结果成功构建了pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因.结论真核表达载体的构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR1功能奠定了良好的实验基础.【总页数】4页(P5-8)【作者】袁成福;杨俊霞;魏丽丽;石华;陈济;易发平;马永平;宋方洲【作者单位】445000,湖北恩施,湖北民族学院医学院生物化学教研室;重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室;重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室;重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室;重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室;重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室;教育部临床检验诊断学重点实验室;重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室;重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室;教育部临床检验诊断学重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.人透明质酸酶真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立 [J], 刘霞;刘飞;刘少英;朱希强;凌沛学2.甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立 [J], 孟越;谢苗苗;林振;袁亮;李威;郝松;杨德鸿3.Tumstatin-EGFP真核表达载体构建及稳定转染CHO细胞系的建立 [J], 姚丽娟;罗以勤;孔建新;赵亮;常珍;濮跃晨;马筱玲4.汉滩病毒受体与细胞因子TNFR Ⅰ真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立[J], 叶伟;白露;于蒙蒙;于澜;张亮;吴兴安;张芳琳;徐志凯;白文涛5.人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立 [J], 袁成福;杨俊霞;魏丽丽;石华;陈济;宋方洲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人核心蛋白聚糖真核载体构建及其体内外抑瘤作用研究的开题报告
人核心蛋白聚糖真核载体构建及其体内外抑瘤作用研究的开题报告一、研究背景及意义人核心蛋白聚糖是一种重要的细胞外基质组分，参与了细胞的黏附、迁移、增殖、分化等生命活动。
研究表明，人核心蛋白聚糖在肿瘤的侵袭、转移、疏通等方面也发挥了重要作用。
因此，通过利用人核心蛋白聚糖作为载体，可以实现基因转移和药物传递，为肿瘤治疗提供新的方法。
二、研究内容和目的本研究将构建一种新型的真核载体，利用人核心蛋白聚糖作为载体，通过基因工程技术将抑制肿瘤生长的基因或药物载入其中。
同时，研究该载体在体外和体内抑瘤作用，为探索肿瘤治疗的新途径提供基础数据。
具体研究内容如下：1.构建人核心蛋白聚糖真核表达载体。
2.将基因或药物载入人核心蛋白聚糖真核载体。
3.体外研究：利用细胞实验以及体外小鼠肿瘤模型，探究载体的抑瘤效应。
4.体内研究：利用小鼠肿瘤模型，观察载体的抑瘤效应和毒副作用。
三、研究方法和技术路线1.构建人核心蛋白聚糖真核表达载体通过PCR扩增基因克隆至真核表达载体（如pEGFP-N1），构建人核心蛋白聚糖真核表达载体。
其中pEGFP-N1质粒顶端接头加入核心蛋白聚糖信号肽，留下未定位的EGFP蛋白部分。
2.将基因或药物载入人核心蛋白聚糖真核载体将siRNA及化疗药物通过化学结合法载入人核心蛋白聚糖真核载体。
通过电泳、冻干法等方法验证载体包裹效果。
通过细胞实验证明载体在细胞内具有稳定性和可靠性。
3.体外研究采用MTT法和流式细胞术以及荧光式活体成像法观察细胞的增殖情况、凋亡率、移动能力。
以裸小鼠模型验证载体的抑瘤效应；同时对载体对细胞、组织毒性进行评价。
4.体内研究使用小鼠体内肿瘤模型，通过尾静脉注射载体进行治疗，观察其对肿瘤生长的抑制作用，并考察其毒副作用。
四、预期成果及应用价值本研究将构建一种新型的真核载体，利用人核心蛋白聚糖作为载体，实现基因转移和药物传递。
同时，研究该载体在体外和体内抑瘤作用，为探索肿瘤治疗的新途径提供基础数据。
人Hepsin基因表达型载体的构建及鉴定
人Hepsin基因表达型载体的构建及鉴定
范志强;徐勇;王春雨;关勇;孙建涛
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2006(46)15
【摘要】应用RT-PCR方法从人前列腺癌细胞系LNcap中克隆Hepsin基因全编码序列,并将其克隆入pIRES2-EGFP表达型质粒,应用酶切和测序方法对重组质粒进行鉴定.结果成功克隆人Hepsin基因cDNA序列并构建了重组表达载体.认为含人Hepsin基因表达型载体的构建为Hepsin基因在前列腺癌中的功能研究提供了实验基础.
【总页数】2页(P22-23)
【作者】范志强;徐勇;王春雨;关勇;孙建涛
【作者单位】天津市泌尿外科研究所,天津,300211;天津市泌尿外科研究所,天津,300211;南开大学分子生物学研究所;天津市泌尿外科研究所,天津,300211;天津市泌尿外科研究所,天津,300211
【正文语种】中文
【中图分类】Q3
【相关文献】
1.复制缺陷型人泡沫逆转录病毒载体构建和外源基因表达 [J], 李治;杨频;刘辉;李文鑫
2.Hsv-tk、重组人 IL-2、 TNF-α融合基因表达载体的构建与鉴定 [J], 鱼兵;成诗
银;张惠中
3.野生型与突变型ATP6V1B2基因表达载体的构建及功能鉴定 [J], 辛凤;袁永一;郭维维;韩东一;戴朴
4.人GJB6基因表达载体的构建及鉴定 [J], 李丽娜;张延平;孙玉蕊;张宗林;王戈;张晓强;冯冲;潘登科
5.人B7-2和增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建 [J], 路静;杨洪艳;赵军;黄幼田;赵国强;董子明
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经 酶切 鉴定 ， 功 构建 ｈ ｐ ｉ ｎ真 核 表 达 载 体 ｐ Ｄ 成 ｅｃ ｉ ｄ ｃ ＮＡ３ｈ ｐ ｉｉ ； 组 质 粒 转 染 Ｈｅ Ｇ ， Ｇ １ 一ｅｃ ｎ 重 ｄ ｐ ２ 经 ４ ８筛 选 ３周 获 得 抗 性 细 胞
第３ ９卷第 ４期第 ５ ４页 ２ ２ｉ ０ ０年 ８月
华 中科 技 大 学 学 报 （ 医学 版 ）
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物 奠定 了实 验 基 础 。
关键 词 ： ｈ ｐ ｉ ｎ 真核 表达 ； 全 ｝ 结构 基 因 ； 稳 定 转 染 人 ｅ ｃ ｉ； ｄ 乏
中 图 分 类 号 ： ４ ． Ｒ３ ９ ５ ＤＯ１ １ ． ８ ｏ ｊｉｓ ． ７ — ７ １ ２ １ ． ４ ０ ２ ：０ ３ ７ ／．ｓｎ １ ２０ ４ ． ０ ０ ０ ． ２ ６
克 隆 ， ｈ ｐｉｉ 白 表 达 量 为普 通 ＨｅＧ２细 胞 表 达 的 ３倍 。结 论 成 功 构 建 了 稳 定 高 表 达 ｈｐｉｉ 其 ｅｃ ｎ蛋 ｄ ｐ ｅ ｃ ｎ的 ＨｅＧ ｄ ｐ ２细 胞 ， 稳 定转 染 细胞 系 的建 立 为 进 一 步 研 究 ｈｐ ｉ ｎ降低 肠 道 铁 吸 收 的 分 子 机 制 以 及 筛 选 拮 抗 ｈ ｐｉｉ 用 的 活 性 药 该 ｅｃ ｉ ｄ ｅｃ ｎ作 ｄ
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人 ｈ ｐ ｉｉ ｅ ｃ ｎ真核 表达 载 体 的构 建 及稳 定 ｄ 转 染 细胞 系 的建立 ＊ 曾 卢 银 平 王 凯 平 ， ，
华 中科 技 大 学 同济 医学 院 药 学 院 药 剂学 系 ， 汉 武 ４ ０ ３ ３００ ４ ０ ２ ３０ ２
。 中科 技 大 学 同济 医学 院 附 属 协 和 医 院病 毒 室 ， 华 武汉
摘要 ： 目的 构 建人 ｈ ｐ ｉｉ ｅ ｃ ｎ全长 结 构 基 因真 核 表 达 载体 ， 立稳 定 高 表 达 ｈ ｐ ｉｉ ｄ 建 ｅ ｃ ｎ的 Ｈｅ Ｇ２细 胞 系 ， ｄ ｐ 以应 用 于 拮 抗 ｈ ｐ ｉｉ 而 增 强铁 吸 收 的活 性 药 物 筛 选 。 方 法 化 学 合 成 结 合 Ｐ Ｒ拼 接 ｈ ｐ ｉｉ 长 结 构 基 因 ， 入 原 核 表 达 载 ｅ ｃ ｎ从 ｄ Ｃ ｅ ｃ ｎ全 ｄ 插 体 ｐ １ 中 ， 序 正 确 后 再 经 Ｈｉｄ １ Ｅ ｏ 酶切 ， 向 插 人 真 核 表 达 载 体 ｐ Ｄ ＭＤ ８Ｔ 测 ｎ １ 与 ｃ ＲＩ双 Ｉ 定 ｃ ＮＡ３ ０内 ， 切 鉴 定 后 ， 用 脂 ． 酶 采
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Ｌａ ｆ Ｖｉｏｏ ｙ， ｉｎ Ｈｏｐｉ ｌ Ｔ ｎ ｊ ｅ ｃ ｌＣ ｌ ｇ Ｈｕ ｚ ｏ ｇ Ｕｎ ｖ ｒｉ Ｊ Ｓ ｉｎ ｅａ ｄ ｂｏ ｒｌｇ Ｕｎｏ ｓ ｔ ， ｏ ｇ ｉ ｄｉａ ｏｌ ｅ， ａ ｈ ｎ ｉｅ ｓｔ ｏ 、 ｃｅ ｃ ｎ ａ Ｍ ｅ ｙ