寄生前夜3DNA合成
[笔记]PSP寄生前夜第三次生日DNA合成详解与技能列表
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DNA合成详解与技能列表：DNA芯片的来源:从设定上讲，A Y A在使用OD时,可随机性的获得对象的DNA片段为己用（大致上是这个意思）。
不过OverKill也算是对敌人的OD行为，换句话说我们在做出Overdive或OverKill 这两个行动时均有一定几率获得DNA芯片。
不过从一个目标身上似乎只能获得一个DNA，对它多次Overdive或OverKill是没有用的。
DNA芯片最多只能保存30个，多出来的似乎会把之前的盖掉。
有不用的DNA可以用方块键削除掉，美其名曰“用作分析”。
每削除到100个DNA（具体扔了多少可以看屏幕下方的计量表）时都会获得一个技能比较稀有且比较高级的DNA。
另外这个DNA是可以通关S/L大法改变其技能和质量的，不过其形状永远是最稀有的单个。
削除DNA可能获得技能一览：IMPACT WA VEHASTEKILL BOOSTRAPID LINKBOOST FIREENERGY SHOTINFERNOBARRIERENERGY DEFENSE关于技能：本作中每个技能最高等级25（官方说明），每格DNA的技能最高也是25.......但是合出这样的DNA有点讲究。
首先我们看一下DNA芯片的特征：形状：DNA的形状有以下几种：横两格（以下简称横2，竖2、横3等均依此类推）、横三格、竖二格、竖三格与单格五种。
其实以单格最为稀有。
种类：分为NORMAL DNA、RARE DNA与EVOLVED DNA三种，表示DNA包含技能的的稀有度，与合成其实没多大关系。
等级：以CHIP LV X表示的芯片等级，这一项越高越好。
芯片的最高等级是LV5(据说有更高等级的.....大概小五没刷出来)。
接下来我们看看放置DNA芯片的场所，这是一个3×3的正方形格子，称为“DNA盘”。
为了方便讲解，下面把DNA盘的每格都标上数字。
当我们把一个DNA芯片放入盘中时，它所附带的技能会立即生效。
但盘中存在两个一样的技能时，其等级的加成会依照以下规律来算：1.当两个技能相邻时，技能等级相加，但最大值超过LV25的话会自动降到25。
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达第一节基因操作概述 (2)一、聚合酶链式反应(PCR) (2)二、质粒概述 (4)三、凝胶电泳 (5)四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6)五、重组质粒的连接 (6)六、限制性内切酶消化 (7)七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7)第二节材料、设备及试剂 (7)一、材料 (7)二、设备 (8)三、试剂： (8)第三节操作步骤 (9)一、目的基因的获得： (9)二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11)三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12)四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定 (12)五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE电泳。
(13)六、融合蛋白的毒力测定 (15)第四节本实验的实验报告 (15)第一节基因操作概述一、聚合酶链式反应(PCR)PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA 的方法。
它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。
由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。
（一）、PCR反应中的主要成份1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。
引物的好坏往往是PCR 成败的关键。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。
寄生前夜终极研究
——《寄生前夜》研究一、武器·防具解说及改造心得注：本章所指的武器·防具及改造心得都只相对于正篇游戏而言。
克来斯勒大厦里可以获得的武器及防具将在第四章《克来斯勒大厦攻略篇》里解说。
1、武器游戏中共可以获得以下几种武器：警棍、手枪、机枪、来复枪、榴弹枪、火箭炮、散弹枪。
如果以数字（最快为10、最慢为1）来表示他们的开火速度和ACT槽的增长速度，那么具体情况如下表：警棍：开火速度2/ACT槽10/数值总和12手枪：开火速度7/ACT槽8/数值总和15机枪：开火速度10/ACT槽7/数值总和17来复枪：开火速度5/ACT槽4/数值总和9榴弹枪：开火速度3/ACT槽4/数值总和7火箭炮：开火速度1/ACT槽1/数值总和2散弹枪：开火速度4/ACT槽3/数值总和7从这个表格里可以清楚看出：手枪和机枪的数字总和是最好的，所以应该作为游戏的主力武器；警棍虽然ACT槽的增长速度最快，但是因为开火速度过慢，所以若非要偷取敌人身上的道具，平时都不需要用；来复枪、榴弹枪、散弹枪都有比较大的缺陷，所以不需要使用；而火箭炮虽然具有攻击敌人全体的效果，但因为过慢的速度和只有一发的装弹数（火箭炮是唯一不能改造的装备），所以完全可以弃置不用。
选定了手枪和机枪作为主力武器后就可以开始最终武器的收集了。
本人经过了一番比较，最后选定了手枪DE50AE2作为最终武器。
这把手枪攻击力83、射程55、装弹数15、可用接口10、特效为2连发（均指基础数值！注意：以后拿到新的武器或防具后，要比较它们的基础数值，奖励数值不需要理会），正好是做最终武器的好材料。
如果有喜欢机枪的朋友，也可以考虑机枪P90（攻击力82、射程51、装弹数200、改造后可用接口7、特效为10连发＋乱射）。
本人之所以选择了手枪，主要还是因为机枪10连发和乱射的特效问题。
因为在游戏设定中，假设只有单发子弹的A枪和3连发子弹的B枪攻击力相同，那么B枪每一发子弹的攻击力都只有A枪一发子弹的1/3，也就是说枪的攻击力是平均分配给各发子弹的，子弹的连发数越高则每一发子弹的攻击力就越弱。
绣球‘杜丽’AP3基因克隆与基因编辑载体构建
㊀Ｇｕｉｈａｉａ㊀Ｆｅｂ.２０２４ꎬ４４(２):２５７－２６６ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍＤＯＩ:１０.１１９３１/ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０２２０４００２李童ꎬ王月莹ꎬ赵惠恩ꎬ２０２４.绣球 杜丽 ＡＰ３基因克隆与基因编辑载体构建[Ｊ].广西植物ꎬ４４(２):２５７－２６６.ＬＩＴꎬＷＡＮＧＹＹꎬＺＨＡＯＨＥꎬ２０２４.ＡＰ３ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｄｏｏｌｅｙ [Ｊ].Ｇｕｉｈａｉａꎬ４４(２):２５７－２６６.绣球 杜丽 ＡＰ３基因克隆与基因编辑载体构建李㊀童ꎬ王月莹ꎬ赵惠恩∗(花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室ꎬ林木花卉遗传育种教育部重点实验室ꎬ国家花卉工程技术研究中心ꎬ城乡生态环境北京实验室ꎬ北京林业大学园林学院ꎬ北京１０００８３)摘㊀要:绣球(Ｈｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ)是以花序为主要观赏部位的园林植物ꎬ多用作切花装饰和景观营造ꎬ在亚洲㊁美洲㊁欧洲广泛栽培ꎮ为探究ＡＰ３基因在绣球花萼形成过程中的功能ꎬ加快重瓣绣球新品种培育进程ꎬ该研究以绣球 杜丽 为材料ꎬ克隆其ＭＡＤＳ￣ｂｏｘＢ类基因ＨｍＡＰ３ꎬ并结合生物信息学方法预测基因功能ꎻ根据ＨｍＡＰ３序列信息ꎬ筛选出高特异性编辑靶点并构建ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑载体ꎬ通过农杆菌转化法将载体整合到绣球基因组中ꎮ结果表明:(１)克隆到１段ＨｍＡＰ３基因的ｃＤＮＡ序列ꎬ其序列全长５４６ｂｐꎬ共编码１８１个氨基酸ꎬ测序结果表明其氨基酸序列与参考序列一致性为１００％ꎬ与拟南芥ＡｔＡＰ３相似度为５８.８％ꎮ(２)不同属植物ＡＰ３氨基酸序列差异较大ꎬ在同属不同物种中ꎬＡＰ３蛋白主要结构较为保守ꎬ仅在少数基序上存在差异ꎮ(３)在ＨｍＡＰ３中共鉴定到２个高特异性靶点ꎬ并成功构建２个单靶点ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑载体ꎮ(４)该研究共获得５株基因组内含有Ｃａｓ９序列的抗性芽ꎬ但其靶点均未突变ꎬ在抗性芽中没有检测到Ｃａｓ９表达ꎮ该研究探讨了ＡＰ３基因在重瓣绣球育种中的价值ꎬ对绣球的ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑技术进行了初探ꎬ为绣球优良品种繁育工作奠定了基础ꎮ关键词:绣球ꎬＭＡＤＳ￣ｂｏｘ家族ꎬＡＰ３ꎬＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ꎬ载体构建中图分类号:Ｑ９４３㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀文章编号:１０００￣３１４２(２０２４)０２￣０２５７￣１０ＡＰ３ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ＤｏｏｌｅｙＬＩＴｏｎｇꎬＷＡＮＧＹｕｅｙｉｎｇꎬＺＨＡＯＨｕｉｅｎ∗(ＢｅｉｊｉｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＯｒｎａｍｅｎｔａｌＰｌａｎｔｓＧｅｒｍｐｌａｓｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ＆ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇꎬＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇｉｎＦｏｒｅｓｔＴｒｅｅｓａｎｄＯｒｎａｍｅｎｔａｌＰｌａｎｔｓｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎꎬＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＦｌｏｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＢｅｉｊｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＵｒｂａｎａｎｄＲｕｒａｌＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔꎬＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬａｎｄｓｃａｐｅＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅꎬＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８３ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａｉｓａｇａｒｄｅｎｐｌａｎｔｗｉｄｅｌｙｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｉｎＡｓｉａꎬＡｍｅｒｉｃａꎬａｎｄＥｕｒｏｐｅｗｉｔｈｉｔｓｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｍａｉｎｏｒｎａｍｅｎｔａｌｆｅａｔｕｒｅ.Ｉｔｉｓｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｉｎｉｎｔｅｒｉｏｒｄｅｃｏｒａｔｉｏｎａｎｄｌａｎｄｓｃａｐｅｃｒｅａｔｉｏｎ.Ｔｏ收稿日期:２０２２－０５－２０基金项目:国家林业和草原局引进国际先进林业科学技术项目(２０１５－４－１５)ꎮ第一作者:李童(１９９７－)ꎬ硕士ꎬ主要从事花卉物种质资源创新与育种研究ꎬ(E￣mail)130****5858＠ꎮ∗通信作者:赵惠恩ꎬ博士ꎬ教授ꎬ研究方向为花卉种质资源创新与育种ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｏｈｕｉｅｎ＠ｂｊｆｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆＡＰ３ｇｅｎｅｉｎｈｙｄｒａｎｇｅａｄｕｒｉｎｇｃａｌｙｘｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬＨ.ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｄｏｏｌｅｙ ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｍａｔｅｒｉａｌ.ＴｈｅＭＡＤＳ￣ｂｏｘＣｌａｓｓＢｇｅｎｅＨｍＡＰ３ｗａｓｃｌｏｎｅｄꎬａｎｄｉｔｓｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｗａｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓ.Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｑｕｉｃｋｅｒｂｒｅｅｄｉｎｇｎｅｗｖａｒｉｅｔｉｅｓꎬｈｉｇｈｌｙ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｄｉｔｉｎｇｔａｒｇｅｔｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄａｎｄＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ.ＴｈｅｖｅｃｔｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅＨ.ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａｇｅｎｏｍｅｂｙａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:(１)ＴｈｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｏｆＨｍＡＰ３ｗａｓ５４６ｂｐꎬｅｎｃｏｄｉｎｇ１８１ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ.Ｉｔｓａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ１００％ｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄ５８.８％ｓｉｍｉｌａｒｔｏＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ.(２)ＡＰ３ｄｉｆｆｅｒｅｄｇｒｅａｔｌｙｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｎｅｒａ.ＷｉｔｈｉｎｔｈｅｓａｍｅｇｅｎｕｓꎬｔｈｅｍａｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＡＰ３ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｄｏｎｌｙｉｎａｆｅｗｍｏｔｉｆｓ.(３)ＴｈｅｒｅｗｅｒｅｔｗｏｈｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｔａｒｇｅｔｓｉｎＨｍＡＰ３.Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｗｏｓｉｎｇｌｅ￣ｔａｒｇｅｔＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ.(４)ＴｈｅｒｅｗｅｒｅｆｉｖｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｗｉｔｈＣａｓ９ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅｉｒｇｅｎｏｍｅｓ.ＨｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅｉｒｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓｄｉｄｎｏｔｃｈａｎｇｅｄｕｅｔｏｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆＣａｓ９ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＡＰ３ｇｅｎｅｉｎｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｗｏｒｋｏｆｄｏｕｂｌｅｆｌｏｗｅｒｐｈｅｎｏｔｙｐｅｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄꎬａｎｄａｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｏｆＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄ.ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏｖｉｄｅａｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆＨ.ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａꎬＭＡＤＳ￣ｂｏｘｆａｍｉｌｙꎬＡＰ３ꎬＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ꎬｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ㊀㊀绣球(Ｈｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ)ꎬ虎耳草科绣球属ꎬ又名八仙花ꎬ在庭院景观中的应用历史悠久ꎬ是一种具有较高观赏价值的园林植物ꎬ作为世界流行的切花深受大众喜爱ꎮ目前绣球主要有蕾丝帽形和圆球形两类花序ꎬ其花序中的不育花具有大而艳丽的花瓣状萼片ꎬ是绣球的主要观赏组织ꎮ绣球不育花有单瓣和重瓣之分ꎬ其中单瓣类只有一轮观赏性萼片ꎬ重瓣类则具有多轮观赏性萼片ꎮ相比之下ꎬ重瓣绣球具有更高的观赏和经济价值ꎬ是绣球新品种培育的重要方向(Ｓｕｙａｍａｅｔａｌ.ꎬ２０１５)ꎮ目前ꎬ国内外的绣球育种方式以杂交育种为主ꎬ其育种效率低㊁周期长ꎬ难以适应日益增长的市场需求(Ｗｕｅｔａｌ.ꎬ２０２１)ꎬ需要探索更快捷㊁高效的育种方式ꎮＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术是一种新兴的基因编辑技术ꎬ能够定向改变植物的观赏性状ꎬ如改造花型和花色ꎬ延长观赏周期等ꎬ在园林植物新品种繁育工作中具有极大的发展潜力和经济价值(Ｋａｕｒｅｔａｌ.ꎬ２０２１)ꎮＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑系统由Ｃａｓ９核酸酶和单引导ＲＮＡ(ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡꎬｓｇＲＮＡ)构成(Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ.ꎬ２０１２)ꎬ二者在植物细胞内转录后形成复合体ꎬ识别植物基因组中的间区序列邻近基序(ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆꎬＰＡＭ)前端约２０ｎｔ核苷酸序列并结合ꎬＣａｓ９核酸酶切割该序列形成ＤＮＡ双链缺口(ＤＮＡｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓꎬＤＳＢｓ)ꎬ引发植物自身损伤修复机制ꎬ产生随机的碱基缺失(Ｈｓｕｅｔａｌ.ꎬ２０１３)ꎮ与其他园艺作物相比ꎬＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术在园林植物中的应用较少ꎬ仅应用于毛白杨(Ｆａｎｅｔａｌ.ꎬ２０１５)㊁矮牵牛(Ｚｈａｎｇｅｔａｌ.ꎬ２０１６ꎻＳｕｎ＆Ｋａｏꎬ２０１８ꎻＸｕｅｔａｌ.ꎬ２０２０ꎻＹｕｅｔａｌ.ꎬ２０２１)㊁菊花(Ｋｉｓｈｉ￣Ｋａｂｏｓｈｉｅｔａｌ.ꎬ２０１７)㊁铁皮石斛(Ｋｕｉｅｔａｌ.ꎬ２０１７)㊁百合(Ｙａｎｅｔａｌ.ꎬ２０１９)㊁牵牛花(Ｓｈｉｂｕｙａｅｔａｌ.ꎬ２０１８ꎻＷａｔａｎａｂｅｅｔａｌ.ꎬ２０１８)㊁蓝猪耳(Ｎｉｓｈｉｈａｒａｅｔａｌ.ꎬ２０１８)与蝴蝶兰(Ｔｏｎｇｅｔａｌ.ꎬ２０２０ꎻＳｅｍｉａｒｔｉｅｔａｌ.ꎬ２０２０)ꎮ花器官由花瓣㊁花萼㊁雄蕊和心皮４个部分组成ꎬ其基因表达调控机制可以用ＡＢＣＤＥ模型来解释ꎮ在ＡＢＣＤＥ模型中ꎬＢ类基因主要负责与Ａ类基因共同调控花瓣的形成ꎬ以及与Ｃ类基因共同调控雄蕊的形成(Ｃｏｅｎ＆Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚꎬ１９９１)ꎻ除Ａ类基因中的ＡＰ２属于ＡＰ２/ＥＲＦ家族外ꎬ该模型中的其余基因均属于ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ基因家族(王莹等ꎬ２０２１)ꎮＭＡＤＳ￣ｂｏｘＢ类基因亚家族成员广泛存在于现存植物的基因组中ꎬ在裸子植物小孢子叶球与被子植物花瓣和雄蕊中均有表达ꎬ在植物发育过程中具有重要地位(Ａｌｂｅｒｔｅｔａｌ.ꎬ１９９８)ꎮＢ类基因包含ＡＰＥＴＡＬＡ３(ＡＰ３)和ＰＩＴＩＬＬＡＴＡ(ＰＩ)两个谱系ꎬ其中ＡＰ３谱系主要调控花瓣和花萼的形成(Ｊａｒａｍｉｌｌｏ＆Ｋｒａｍｅｒꎬ２００４)ꎮＡＰ３蛋白中含有保守的Ｋ￣ＢＯＸ结构域ꎬ该结构域能够引导ＡＰ３蛋白与ＰＩ㊁ＳＥＰ３㊁ＡＰ１蛋白形成四聚体ꎬ诱导花瓣原基形成(Ｍｅｌｚｅｒ＆Ｔｈｅｉßｅｎꎬ２００９ꎻＴｈｅｉßｅｎｅｔａｌ.ꎬ２０１６)ꎮ在观赏植物中ꎬ已经发现ＡＰ３基因沉默能够导致矮牵牛(ｖａｎｄｅｒＫｒｏｌꎬ１９９３)㊁兰花(Ｍｏｎｄｒａｇóｎ￣Ｐａｌｏｍｉｎｏ＆Ｔｈｅｉßｅｎꎬ２００９)与耧斗菜(Ｚｈａｎｇｅｔａｌ.ꎬ８５２广㊀西㊀植㊀物４４卷２０１３)等发生从花瓣向花萼的同源异型转变ꎮ因此ꎬ本研究对绣球 杜丽 的ＭＡＤＳ￣ｂｏｘＢ类基因ＨｍＡＰ３进行了克隆和生物信息学分析ꎻ同时结合组内前期绣球 杜丽 再生体系建立基础ꎬ借助ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑系统ꎬ构建了２个ＨｍＡＰ３单靶点载体ꎬ转化获得抗性芽ꎬ拟探讨以下问题:(１)ＨｍＡＰ３氨基酸序列保守结构域特征与蛋白结构分析ꎻ(２)ＨｍＡＰ３系统进化关系及其生物学功能预测ꎻ(３)探究影响绣球ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑工作成功率的因素ꎮ以期为绣球的性状改良和新品种繁育工作提供实践参考和技术支撑ꎮ１㊀材料与方法１.１试验材料和试剂绣球 杜丽 种植于北京植物园(１１６ʎ２８ᶄＥ㊁４０ʎ００ᶄＮ)ꎮ于４月选取翠绿㊁无病虫害的叶片作为试验材料ꎬ将叶片与叶柄一并剪下ꎬ放入干净的蒸馏水中转移至实验室ꎮ试验所用的试剂盒包括植物总ＲＮＡ提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司ꎬＤＰ４３２]ꎬｃＤＮＡ反转录试剂盒(ＴａＫａＲａꎬＲＲ０４７Ａ)ꎬＤＮＡ凝胶回收试剂盒(北京擎科生物科技股份有限公司ꎬＧＥ０１０１)ꎬＯｎｅｓｔｅｐＺＴＯＰＯ￣Ｂｌｕｎｔ/ＴＡ零背景快速克隆试剂盒(北京庄盟生物科技有限公司ꎬＺＣ２０６)ꎬＳＥ无缝克隆和组装试剂盒(北京庄盟生物科技有限公司ꎬＺＣ２３１)ꎬ限制性内切酶ＢｓａＩ[纽英伦生物技术(北京)有限公司]ꎮ１.２绣球 杜丽 ＨｍＡＰ３基因克隆依据在ＮＣＢＩ上查找到的绣球 ＢｌｕｅＳｋｙ (Ｈ.ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ＢｌｕｅＳｋｙ )ＡＰ３基因(ＧｅｎＢａｎｋ:ＡＦ２３０７０２.１)的ＣＤＳ序列进行引物设计(表１)并合成高特异性引物ꎮ按照试剂盒说明书提取试验材料ＲＮＡꎬ并将ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡꎮ以ｃＤＮＡ为模板ꎬ用ＫＯＤＯｎｅ高保真ＤＮＡ聚合酶(ＴＯＹＯＢＯꎬＫＭＭ￣１０１)ꎬ以ＨｍＡＰ３￣Ｆ１/Ｒ１为引物(表１)进行ＰＣＲ扩增ꎮ扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行纯化ꎬ将目的片段所处区域凝胶切割下来ꎬ按照ＤＮＡ凝胶回收试剂盒说明书回收ꎮ纯化后的ＰＣＲ产物连接Ｔ载体后转入ＤＨ５α大肠杆菌感受态涂布平板培养１２ｈꎬ选取单菌落送至测序公司(北京擎科生物科技股份有限公司)进行质粒提取和测序工作ꎬ获得ＨｍＡＰ３基因的ＣＤＳ序列ꎮ１.３绣球 杜丽 ＨｍＡＰ３基因生物信息学分析使用Ｃｅｌｌ￣ＰＬｏｃ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｓｂｉｏ.ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/ｂｉｏｉｎｆ/Ｃｅｌｌ￣ＰＬｏｃ￣２/)对ＨｍＡＰ３进行亚细胞定位预测(Ｃｈｏｕ＆Ｓｈｅｎꎬ２０１０)ꎮ利用ＮＣＢＩ￣ＢＬＡＳＴ(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)比对ＨｍＡＰ３氨基酸序列相似性ꎬ下载比对结果中排名在前列的其他植物ＡＰ３氨基酸序列ꎬ同时下载拟南芥ＡｔＡＰ３氨基酸序列ꎬ通过ＭＥＧＡ￣Ｘ软件的邻接法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄꎬＮＪ)构建系统进化树(Ｚｈａｎｇｅｔａｌ.ꎬ２０１９)ꎮ利用ＭＥＭＥ(ｈｔｔｐ://ｍｅｍｅ￣ｓｕｉｔｅ.ｏｒｇ/ｔｏｏｌｓ/ｍｅｍｅ/)预测ＨｍＡＰ３氨基酸序列保守基序ꎮ通过ＰｒｏｒＰａｒａｍ(ｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/)分析ＨｍＡＰ３蛋白的理化性质(Ｌｉｅｔａｌ.ꎬ２０２０)ꎮ分别使用蛋白二级结构预测工具ＳＯＰＭＡ(ｈｔｔｐｓ://ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ?ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ/)和蛋白三级结构预测工具Ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ(ｈｔｔｐｓ://ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/)对ＨｍＡＰ３氨基酸序列进行分析ꎮ１.４ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑载体构建和转化使用ＣＲＩＳＰＲ靶点设计网站ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ(ｈｔｔｐ://ｃｒｉｓｐｒ.ｄｂｃｌｓ.ｊｐ/)根据ＨｍＡＰ３基因的ＣＤＳ序列ꎬ选择ＰＡＭ位点和ＧＣ含量在４０％~６０％之间的高特异性靶点ꎮ以ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｓｇＲＮＡ/Ｃａｓ９载体质粒为模板ꎬ以ＨｍＡＰ３￣Ｆ２/Ｒ２㊁ＨｍＡＰ３￣Ｆ３/Ｒ３为引物(表１)ꎬ进行ＰＣＲ扩增获得带有黏性末端的目的片段ꎮ使用内切酶ＢｓａⅠ酶切获得ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｓｇＲＮＡ/Ｃａｓ９线性载体ꎬ用无缝克隆试剂盒(北京庄盟生物科技有限公司ꎬＺＣ２３１)连接载体和目的片段ꎬ获得重组质粒ꎮ构建好的质粒转入ＤＨ５α大肠杆菌感受态涂布平板培养１２ｈꎬ选取单菌落送至测序公司(北京擎科生物科技股份有限公司)进行质粒提取和测序工作ꎬ回收构建成功的载体质粒ꎮ将构建好的载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００::ＨｍＡＰ３利用冻融法转入ＧＶ３１０１农杆菌感受态中ꎬ在２抗ＬＢ培养基(５０ｍｇ Ｌ￣１卡那霉素＋５０ｍｇ Ｌ￣１利福平)中２８ħ培养２ｄꎬ挑取单菌落在ＬＢ液体培养基扩繁ꎮ离心收集扩繁的农杆菌菌体ꎬ加入适量侵染液(ＭＳ＋３０ｇ Ｌ￣１蔗糖＋２００μｍｏｌ Ｌ￣１乙酰丁香酮)调至ＯＤ６００＝０.４ꎮ将绣球 杜丽 叶片剪切成１ｃｍˑ１ｃｍ的小块ꎬ在叶背划３~４刀ꎬ放入上述配制好的侵染液中９５２２期李童等:绣球 杜丽 ＡＰ３基因克隆与基因编辑载体构建浸泡侵染１０ｍｉｎꎬ转接到共培养培养基(ＭＳ＋２.０ｍｇ Ｌ￣１６￣ＢＡ＋０.１ｍｇ Ｌ￣１ＩＢＡ)上暗培养２ｄꎬ再转移到筛选培养基(ＭＳ＋２.０ｍｇ Ｌ￣１６￣ＢＡ＋０.１ｍｇ Ｌ￣１ＩＢＡ＋２ｍｇ Ｌ￣１潮霉素＋２００ｍｇ Ｌ￣１头孢霉素)中至获得抗性再生芽ꎮ１.５抗性芽检测和鉴定取抗性芽叶片ꎬ使用基因组提取试剂盒获取叶片ＤＮＡꎬ再依次使用总ＲＮＡ提取试剂盒㊁ｃＤＮＡ反转录试剂盒获取叶片ｃＤＮＡꎮ分别以叶片ＤＮＡ和ｃＤＮＡ为模板ꎬ以Ｃａｓ９￣Ｆ/Ｒ为引物扩增Ｃａｓ９序列ꎬ扩增片段长度为７６４ｂｐꎮ以叶片ＤＮＡ为模板ꎬ以ＨｍＡＰ３￣Ｆ１/Ｒ１为引物扩增抗性芽ＨｍＡＰ３序列ꎬ扩增产物送至测序公司(北京擎科生物科技股份有限公司)测序ꎮ使用ＤＮＡＭＡＮ比对测序结果与野生型序列差异ꎮ２㊀结果与分析２.１绣球 杜丽 ＡＰ３基因克隆与序列分析参考绣球 ＢｌｕｅＳｋｙ ＡＰ３基因ＣＤＳ序列ꎬ利用ＨｍＡＰ３￣Ｆ１/ＨｍＡＰ３￣Ｒ１引物(表１)ꎬ在绣球 杜丽 ｃＤＮＡ文库中克隆到了一段完全一致的核苷酸序列ꎮ克隆到的基因序列全长５４６ｂｐꎬ共编码１８１个氨基酸ꎬ利用ＮＣＢＩ分析其氨基酸序列ꎬ发现在３０~１２３ｂｐ处包含１个Ｋ￣ＢＯＸ保守结构域(图１)ꎮ该氨基酸序列Ｃ端含有ＰＩ基序和ｅｕＡＰ３基序ꎬ符合ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ家族特征ꎬ命名为ＨｍＡＰ３ꎮ将ＨｍＡＰ３与拟南芥ＡｔＡＰ３氨基酸序列比对ꎬ其相似度为５８.８％ꎻＨｍＡＰ３与绣球 ＢｌｕｅＳｋｙ ＡＰ３的ＤＮＡ序列相似度为１００％ꎮ因此ꎬ推测该基因为绣球 杜丽 ＡＰ３基因ꎮ亚细胞定位预测结果显示ＨｍＡＰ３在细胞核中表达ꎮ２.２绣球 杜丽 ＡＰ３蛋白理化性质与结构分析以拟南芥ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ类蛋白三级结构为模型ꎬ预测ＨｍＡＰ３蛋白三级结构ꎬ可见该结构中含有２条长α￣螺旋ꎬ螺旋间纽结为９０ʎꎻ其预测结果ＧＭＱＥ(全球模型质量估计)值为０.３２ꎬＱＭＥＡＮ得分为０.７４ʃ０.０５ꎬ模型可信度和质量较高(图２)ꎮ绣球 杜丽 的ＨｍＡＰ３蛋白分子式为Ｃ９２７Ｈ１４６２Ｎ２６８Ｏ２８７Ｓ７ꎬ分子量为２１１７７.８５Ｄꎮ该蛋白共包含１８１个氨基酸ꎬ不稳定系数为３８.７９ꎬ属稳定蛋白ꎮ蛋白带负电荷残基总数(Ａｓｐ＋Ｇｌｕ)为２８ꎬ带正电荷残基总数(Ａｒｇ＋Ｌｙｓ)为２５ꎬ理论等电点为６.１７ꎮ蛋白脂肪指数为７９.１２ꎬ亲水性(ＧＲＡＶＹ)为－０.７９１ꎬ为亲水性蛋白ꎮＨｍＡＰ３蛋白二级结构中α￣螺旋占比最高ꎬ为６４.０９％ꎻ其他结构占比由高到低依次为无规则卷曲(２２.６５％)㊁延伸链(８.８４％)㊁β￣折叠(４.４２％)(图３)ꎮ２.３绣球 杜丽 ＡＰ３蛋白系统进化与ｍｏｔｉｆ分析将ＨｍＡＰ３氨基酸序列提交到ＮＣＢＩ进行ＢＬＡＳＴ比对ꎬ在比对结果中选取下载与该序列相似度较高的其他植物ＡＰ３氨基酸序列ꎬ在ＭＥＧＡ￣Ｘ软件上用邻接法构建系统进化树(图４)ꎮ从整体上来看ꎬ绣球等蔷薇亚纲菊超目植物被聚为同一大支ꎬ说明ＡＰ３蛋白在系统进化过程中具有一定保守性ꎮ从各小分支来看ꎬ不同物种间的ＡＰ３序列存在一定差异ꎬ而同物种间的序列相似度则较高ꎮ相对而言ꎬ绣球与神秘果(Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ)㊁洒金桃叶珊瑚(Ａｕｃｕｂａｊａｐｏｎｉｃａｖａｒ.ｂｏｒｅａｌｉｓ)和欧洲枸骨(Ｉｌｅｘａｑｕｉｆｏｌｉｕｍ)亲缘关系最近ꎮ在模式植物中ꎬ绣球与烟草(Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ)的亲缘关系比拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)更近ꎮ因此ꎬ使用烟草基因组作为预测绣球基因编辑靶点的参考基因组更为适宜ꎮ在ＭＥＭＥ￣ｍｏｔｉｆｓｕｉｔｅ工具上对上述氨基酸序列进行分析后ꎬ获得了１５个ｍｏｔｉｆ及其在序列中的相对位置(图４)ꎮ大部分植物ＡＰ３序列包含７个ｍｏｔｉｆꎬ其中有８个ＡＰ３序列包含８个ｍｏｔｉｆꎬ１个ＡＰ３序列包含９个ｍｏｔｉｆꎮ所有ＡＰ３序列Ｃ端较为保守ꎬ均含有ｍｏｔｉｆ２㊁ｍｏｔｉｆ４㊁ｍｏｔｉｆ５㊁ｍｏｔｉｆ６和ｍｏｔｉｆ７ꎬ而Ｎ端多含ｍｏｔｉｆ３ꎮ与其他植物相比ꎬ绣球ＡＰ３序列中含有特有的ｍｏｔｉｆ１２ꎬ此外仅洒金桃叶珊瑚ＡＰ３序列中含有这一基序ꎬ说明ＨｍＡＰ３相对其他植物ＡＰ３蛋白可能会有更多功能ꎮ对同源基因来说ꎬ其序列的ｍｏｔｉｆ大体相似ꎬ然而在不同物种间仍存在一定的差异ꎬ这些差异导致了不同物种间同源基因的功能差异ꎮ２.４ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑载体构建利用ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ在ＨｍＡＰ３上共选取到２个特异性强的靶点ꎬ分别命名为ＨｍＡＰ３￣Ｔａｇｅｔ１(５ᶄ￣ＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＴ＋ＧＧＧ￣３ᶄ)和ＨｍＡＰ３￣Ｔａｇｅｔ２(５ᶄ￣ＴＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＡＴＣＧＡＧＴＡＣ＋ＣＧＧ￣３ᶄ)ꎬ其ＧＣ含量分别为４５％和４０％ꎬ其与ＰＡＭ位点相邻的１２ｂｐ在参考基因组(烟草)中均仅比对到１个位点ꎬ证明该靶点具有较强特异性ꎮ用引物ＨｍＡＰ３￣Ｆ２/Ｒ２㊁ＨｍＡＰ３￣Ｆ３/Ｒ３在质粒上扩增含有０６２广㊀西㊀植㊀物４４卷表１㊀本研究中所使用的引物序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ序列(５ᶄң３ᶄ)Ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５ᶄң３ᶄ)退火温度Ａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ(ħ)用途ＰｕｒｐｏｓｅＨｍＡＰ３￣Ｆ１ＨｍＡＰ３￣Ｒ１５ᶄ￣ＡＴＧＴＴＣＴＣＣＡＣＴＡＣＣＡＡＣＡＡＡＣＴ￣３ᶄ５ᶄ￣ＣＴＡＡＴＣＧＡＧＣＡＡＴＧＣＡＴＡＣＧＴＡＧ￣３ᶄ５６ＨｍＡＰ３全长扩增ＨｍＡＰ３ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＨｍＡＰ３￣Ｆ２ＨｍＡＰ３￣Ｒ２５ᶄ￣ＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣ￣３ᶄ５ᶄ￣ＴＴＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＴＴＣＧＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＣＴ￣３ᶄ５８ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９载体构建￣靶点１ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ￣Ｔａｒｇｅｔ１ＨｍＡＰ３￣Ｆ３ＨｍＡＰ３￣Ｒ３５ᶄ￣ＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＴＴＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＡＣＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣ￣３ᶄ５ᶄ￣ＴＴＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＴＴＣＧＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＣＴ￣３ᶄ５８ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９载体构建￣靶点２ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ￣Ｔａｒｇｅｔ２Ｃａｓ９￣ＦＣａｓ９￣Ｒ５ᶄ￣ＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＣＡＴＣＣ￣３ᶄ５ᶄ￣ＧＴＣＣＴＣＧＴＴＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＴＣ￣３ᶄ５２抗性芽Ｃａｓ９序列检测Ｃａｓ９ｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓ∗表示终止子ꎮ∗ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ.图１㊀ＨｍＡＰ３的序列及其结构域分析Ｆｉｇ.１㊀ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｏｍａｉｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｍＡＰ３黏性末端的目的片段ꎬ与线性载体连接ꎬ用大肠杆菌转化后挑取单菌落测序ꎬ测序结果表明目的片段已成功插入载体ꎬ插入片段与载体结构如图５所示ꎮ绣球对潮霉素敏感性很高ꎬ经２ｍｇ Ｌ￣１潮霉素筛选后ꎬ在侵染约２０００枚叶片后仅培育出９株抗性芽(图６:Ａ)ꎮ以抗性芽叶片ＤＮＡ为模板ꎬ１６２２期李童等:绣球 杜丽 ＡＰ３基因克隆与基因编辑载体构建图２㊀ＨｍＡＰ３蛋白三级结构Ｆｉｇ.２㊀ＴｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＨｍＡＰ３ｐｒｏｔｅｉｎ分别使用靶基因序列扩增引物ＨｍＡＰ３￣Ｆ１/ＨｍＡＰ３￣Ｒ１和Ｃａｓ９序列扩增引物Ｃａｓ９￣Ｆ/Ｃａｓ９￣Ｒ对抗性芽进行鉴定ꎮ扩增和测序结果表明ꎬ９株抗性芽叶片基因组中有５株可克隆到Ｃａｓ９序列ꎬ但其靶点序列均未发生突变(图６:Ｂ)ꎮ提取抗性芽叶片总ＲＮＡ后反转录获得ｃＤＮＡꎬ再次克隆Ｃａｓ９序列ꎬ发现所有样品均无法扩增出条带ꎮ该现象说明虽然载体序列已成功整合到载体基因组上ꎬ但是Ｃａｓ９蛋白并未成功转录和表达ꎬ因此ꎬ编辑靶点的序列没有改变ꎮ３㊀讨论与结论本研究克隆了绣球 杜丽 的ＨｍＡＰ３基因ꎬ并对其核苷酸序列与氨基酸序列进行了生物信息学分析ꎮ研究发现ＨｍＡＰ３与模式植物拟南芥(Ｙａｎｇｅｔａｌ.ꎬ２００３)及园艺作物绿竹(朱龙飞ꎬ２０１３)㊁葡萄(胡晓燕等ꎬ２０２１)㊁菠萝(郑雪文等ꎬ２０２１)在特有的Ｋ￣ＢＯＸ结构域上长度相近㊁结构相似ꎬ表明此结构域在不同物种的ＡＰ３中高度保守ꎮ理化性质分析结果表明ＨｍＡＰ３是稳定的亲水性蛋白ꎬ与郑雪文等(２０２１)的研究结果一致ꎮ在ＨｍＡＰ３蛋白三级结构模型中ꎬＫ￣ＢＯＸ形成长α￣螺旋结构ꎬ与植物ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ家族中Ｋ￣ＢＯＸ结构域特征一致ꎬ该结构在ＡＰ３与其他蛋白结合形成四聚体的过程中发挥关键作用(Ｙａｎｇ＆Ｊａｃｋꎬ２００４)ꎮＨｍＡＰ３蛋白系统进化树表明ＡＰ３基因在植物系统进化过程中的保守性ꎬ其中绣球与金鱼草㊁烟草和番茄ＡＰ３基因聚类在同一大分支ꎬ亲缘关系较近ꎬ与Ｖｉａｅｎｅ等(２００９)研究结果相似ꎮＭａｒｔｉｎｏ等(２００６)和Ｌｉｕ等(２００４)研究发现ꎬ番茄ＳｌＡＰ３与烟草ＮｔＡＰ３基因沉默后代表现出花萼轮数增多㊁花瓣消失的性状ꎮ通过同源比对ꎬ推测绣球 杜丽 ＨｍＡＰ３基因与其同源基因ＳｌＡＰ３㊁ＮｔＡＰ３功能相似ꎬ可能负责调控绣球花器官中花萼和花瓣的形成ꎮ本研究构建了２个绣球ＨｍＡＰ３单靶点载体ꎬ并在转化获得的抗性芽基因组中检测到载体序列ꎬ但在抗性芽中未检测到Ｃａｓ９序列的表达和编辑位点序列突变ꎮ本研究与Ｒｅｎ等(２０１３)的研究结果相似ꎬ他推测基因编辑效率与启动子活性有关ꎬ当ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑载体中的启动子从ｎｏｓ￣ｍｉｎｉ变为Ｕ６ｂ启动子时ꎬ遗传突变率可从０提高至３.２％ꎮ在观赏植物中ꎬＫｉｓｈｉ￣Ｋａｂｏｓｈｉ等(２０１９)的研究也佐证了这一观点ꎬ系统性比较了Ｕｂｉｑｕｔｉｎ㊁ＣａＭＶ３５Ｓ和ＣｍＡｃｔｉｎ２启动子的表达活性差异后ꎬ发现ＣａＭＶ３５Ｓ和Ｕｂｉｑｕｔｉｎ启动子在菊花愈伤组织中活性均低于菊花ＣｍＡｃｔｉｎ２启动子ꎮ本研究使用的Ｃａｓ９序列启动子为Ｕｂｉｑｕｔｉｎ启动子ꎬ猜想其在绣球组织中的表达活性极低ꎬ导致Ｃａｓ９序列在抗性芽中未表达ꎮ在下一步绣球基因编辑工作中ꎬ可将载体中启动子更换为绣球本源启动子ꎬ进一步探究启动子活性对基因编辑成功率的影响ꎮ本研究发现绣球对潮霉素的高敏感性也是影响ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑效率的重要因素ꎮ本研究使用２ｍｇ Ｌ￣１潮霉素浓度对绣球抗性芽进行筛选ꎬ再生率仅为０.４５％ꎬ与苹果(贾东杰等ꎬ２０１３)等在潮霉素筛选下的再生情况相符ꎬ推测绣球野生型基因组内不含有潮霉素抗性基因ꎮ甘煌灿等(２０１８)提出可通过在再生筛选过程中逐渐增加潮霉素浓度的方法ꎬ提高抗性芽的成活率ꎮ后续的绣球抗性芽的筛选条件可通过调整不同再生阶２６２广㊀西㊀植㊀物４４卷蓝色表示α￣螺旋ꎬ紫色表示无规则卷曲ꎬ绿色表示β￣折叠ꎬ红色表示延伸链ꎮＢｌｕｅｉｎｄｉｃａｔｅｓα￣ｈｅｌｉｘꎬｐｕｒｐｌｅｉｎｄｉｃａｔｅｓｒａｎｄｏｍｃｏｉｌꎬｇｒｅｅｎｉｎｄｉｃａｔｅｓβ￣ａｎｇｌｅꎬａｎｄｒｅｄｉｎｄｉｃａｔｅｓｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ.图３㊀ＨｍＡＰ３蛋白二级结构Ｆｉｇ.３㊀ＳｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＨｍＡＰ３ｐｒｏｔｅｉｎ图４㊀ＨｍＡＰ３蛋白系统进化和ｍｏｔｉｆ分析Ｆｉｇ.４㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｍｏｔｉｆａｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｍＡＰ３ｐｒｏｔｅｉｎ３６２２期李童等:绣球 杜丽 ＡＰ３基因克隆与基因编辑载体构建Ａ.ｐＣＡＭＢＩＡ１３００::ＨｍＡＰ３载体结构ꎻＢ.载体中目的片段测序结果ꎮＡ.ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｐＣＡＭＢＩＡ１３００::ＨｍＡＰ３ｖｅｃｔｏｒꎻＢ.Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｔｈｅｖｅｃｔｏｒ.图５㊀ｐＣＡＭＢＩＡ１３００::ＨｍＡＰ３载体图谱及目的片段插入情况Ｆｉｇ.５㊀ｐＣＡＭＢＩＡ１３００::ＨｍＡＰ３ｖｅｃｔｏｒｍａｐｐｉｎｇａｎｄｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｓｅｒｔｉｏｎＡ.绣球 杜丽 抗性芽的生长状况ꎻＢ.抗性芽基因组中Ｃａｓ９序列扩增(Ｍ.ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻＷＴ.野生型ꎻ１~９.绣球 杜丽 抗性芽)ꎮＡ.ＲｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｇｒｏｗｔｈｏｆＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｄｏｏｌｅｙ ꎻＢ.Ｃａｓ９ｓｅｑｕｅｎｃｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓ(Ｍ.ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻＷＴ.Ｗｉｌｄｔｙｐｅꎻ１－９.ＲｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｏｆＨ.ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｄｏｏｌｅｙ ).图６㊀绣球 杜丽 抗性芽检测Ｆｉｇ.６㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｏｆＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｄｏｏｌｅｙ４６２广㊀西㊀植㊀物４４卷段潮霉素浓度的方式来进一步优化ꎬ以提高基因编辑效率ꎮ本研究在绣球 杜丽 中克隆到１个ＨｍＡＰ３基因ꎬｃＤＮＡ序列全长５４６ｂｐꎬ共编码１８１个氨基酸ꎬ为稳定的亲水性蛋白ꎬ氨基酸序列结构分析证明其具有ＭＡＤＳ￣ｂｏｘＢ类基因亚家族特征ꎬ系统进化分析表明ＨｍＡＰ３与烟草㊁番茄㊁金鱼草亲缘关系较近ꎬ基序组成结构保守ꎻ以ＨｍＡＰ３为靶点ꎬ成功构建２个以Ｃａｓ９基因㊁ｓｇＲＮＡ㊁潮霉素抗性基因为骨架的ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑载体ꎬ并将载体序列整合到绣球基因组中ꎮ上述研究结果为进一步研究ＨｍＡＰ３基因功能奠定了理论基础ꎬ为重瓣绣球基因编辑辅助育种工作提供技术支撑ꎮ参考文献:ＡＬＢＥＲＴＶＡꎬＧＵＳＴＡＦＳＳＯＮＭＨＧꎬＬＡＵＲＥＮＺＩＯＬＤꎬ１９９８.Ｏｎｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓꎬｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｇｅｎｅｔｉｃｓꎬａｎｄｔｈｅａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｐｅｔａｌ[Ｍ]//ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍａｔｉｃｓｏｆｐｌａｎｔｓⅡ.Ｂｏｓｔｏｎ:Ｓｐｒｉｎｇｅｒ:３４９－３７４.ＣＨＯＵＫＣꎬＳＨＥＮＨＢꎬ２０１０.Ｃｅｌｌ￣ＰＬｏｃ２.０:ａｎｉｍｐｒｏｖｅｄｐａｃｋａｇｅｏｆｗｅｂ￣ｓｅｒｖｅｒｓｆｏｒｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｖａｒｉｏｕｓｏｒｇａｎｉｓｍｓ[Ｊ].ＮａｔＳｃｉꎬ２(１０):１０９０.ＣＯＥＮＥＳꎬＭＥＹＥＲＯＷＩＴＺＥＭꎬ１９９１.Ｔｈｅｗａｒｏｆｔｈｅｗｈｏｒｌｓ:ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｆｌｏｗｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ３５３(６３３９):３１－３７.ＦＡＮＤꎬＬＩＵＴＴꎬＬＩＣＦꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１５.ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔａｒｇｅｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎＰｏｐｕｌｕｓｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＳｃｉＲｅｐꎬ５(１):１－７.ＧＡＮＨＣꎬＬＡＩＣＣꎬＰＡＮＨꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１８.Ｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｊａｓｍｉｎｅ[Ｊａｓｍｉｎｕｍｓａｍｂａｃ(Ｌｉｎｎ.)Ａｉｔｏｎ]ｃａｌｌｕｓｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＤＦＲｇｅｎｅｆｒｏｍｓｐｉｎｅｇｒａｐｅ(ＶｉｔｉｓｄａｖｉｄｉｉＦｏëｘ.)[Ｊ].ＣｈｉｎＪＴｒｏｐＣｒｏｐꎬ３９(６):１１２８－１１３６.[甘煌灿ꎬ赖呈纯ꎬ潘红ꎬ等ꎬ２０１８.刺葡萄ＤＦＲ基因植物表达载体构建及转化茉莉花愈伤组织的研究[Ｊ].热带作物学报ꎬ３９(６):１１２８－１１３６.]ＨＳＵＰＤꎬＳＣＯＴＴＤＡꎬＷＥＩＮＳＴＥＩＮＪＡꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１３.ＤＮＡｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆＲＮＡ￣ｇｕｉｄｅｄＣａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅｓ[Ｊ].ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌꎬ３１(９):８２７－８３２.ＨＵＸＹꎬＧＵＯＣＬꎬＷＡＮＧＬꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２１.ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＶｖＭＡＤＳ４６ｉｎｒｅｄｇｌｏｂｅａｎｄｔｈｏｍｐｓｏｎｓｅｅｄｌｅｓｓｆｏｒｓｅｅｄｌｅｓｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪＦｒｕｉｔＳｃｉꎬ３８(８):１２３１－１２３９.[胡晓燕ꎬ郭春磊ꎬ王莉ꎬ等ꎬ２０２１.无核白及红地球葡萄ＶｖＭＡＤＳ４６基因的克隆及其无核调控功能分析[Ｊ].果树学报ꎬ３８(８):１２３１－１２３９.]ＪＡＲＡＭＩＬＬＯＭＡꎬＫＲＡＭＥＲＥＭꎬ２００４.ＡＰＥＴＡＬＡ３ａｎｄＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡｈｏｍｏｌｏｇｓｅｘｈｉｂｉｔｎｏｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｉｎｔｈｅｕｎｉｑｕｅｐｅｒｉａｎｔｈｏｆＡｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａ(Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａｃｅａｅ) 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ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｓａｍｏｄｅｆｏｒｆｌｏｒａｌｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎ(Ｂａｓａｌ)ａｓｔｅｒｉｄｓ[Ｊ].ＭｏｌＢｉｏｌＥｖｏｌꎬ２６(１１):２６２７－２６４５.ＷＡＮＧＹꎬＭＵＹＸꎬＷＡＮＧＪꎬ２０２１.ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｆｌｏｒａｌｏｒｇａｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｙｔｈｅＭＡＤＳ￣ｂｏｘｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ[Ｊ].ＡｃｔａＡｇｒｉｃＺｈｅｊｉａｎｇꎬ３３(６):１１４９－１１５８.[王莹ꎬ穆艳霞ꎬ王锦ꎬ２０２１.ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ基因家族调控植物花器官发育研究进展[Ｊ].浙江农业学报ꎬ３３(６):１１４９－１１５８.]ＷＡＴＡＮＡＢＥＫꎬＯＤＡ￣ＹＡＭＡＭＩＺＯＣꎬＳＡＧＥ￣ＯＮＯＫꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１８.ＡｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｆｌｏｗｅｒｃｏｌｏｕｒｉｎＩｐｏｍｏｅａｎｉｌｔｈｒｏｕｇｈＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｃｌｅａｖａｇｅｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ４[Ｊ].ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓꎬ２７(１):２５－３８.ＷＵＸＢꎬＨＵＬＳＥ￣ＫＥＭＰＡＭꎬＷＡＤＬＰＡꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２１.Ｇｅｎｏｍｉｃｒｅｓｏｕｒｃｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｆｏｒｈｙｄｒａｎｇｅａ[Ｈｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ(Ｔｈｕｎｂ.)Ｓｅｒ.] Ａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄａｈｉｇｈ￣ｄｅｎｓｉｔｙｇｅｎｅｔｉｃｌｉｎｋａｇｅｍａｐ[Ｊ].Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅꎬ７(２５):１－１３.ＸＵＪＰꎬＫＡＮＧＢＣꎬＮＡＩＮＧＡＨꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２０.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｅｄｉｔｉｎｇｏｆ１￣ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ￣１￣ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｏｘｉｄａｓｅ１ｅｎｈａｎｃｅｓＰｅｔｕｎｉａｆｌｏｗｅｒｌｏｎｇｅｖｉｔｙ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＪꎬ１８(１):２８７－２９７.ＹＡＮＲꎬＷＡＮＧＺＰꎬＲＥＮＹＭꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１９.ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｅｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＬｉｌｉｕｍｐｕｍｉｌｕｍＤＣ.Ｆｉｓｃｈ.ａｎｄＬｉｌｉｕｍｌｏｎｇｉｆｌｏｒｕｍＷｈｉｔｅＨｅａｖｅｎ[Ｊ].ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉꎬ２０(１２):２９２０ＹＡＮＧＹＺꎬＦＡＮＮＩＮＧＬꎬＪＡＣＫＴꎬ２００３.ＴｈｅＫｄｏｍａｉｎｍｅｄｉａｔｅｓｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｆｌｏｒａｌｏｒｇａｎｉｄｅｎｔｉｔｙｐｒｏｔｅｉｎｓꎬＡＰＥＴＡＬＡ３ａｎｄＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪꎬ３３(１):４７－５９.ＹＡＮＧＹＺꎬＪＡＣＫＴꎬ２００４.ＤｅｆｉｎｉｎｇｓｕｂｄｏｍａｉｎｓｏｆｔｈｅＫｄｏｍａｉｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎ￣ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｐｌａｎｔＭＡＤＳｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔｌＢｉｏｌꎬ５５(１):４５－５９.ＹＵＪꎬＴＵＬＨꎬＳＵＢＢＵＲＡＪＳꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２１.ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｔａｒｇｅｔｉｎｇｏｆｄｕｐｌｉｃａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎＰｅｔｕｎｉａｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｆｏｒｆｌｏｗｅｒｃｏｌｏｒｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｖｉａＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐꎬ４０(６):１０３７－１０４５.ＺＨＡＮＧＢꎬＹＡＮＧＸꎬＹＡＮＧＣＰꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１６.ＥｘｐｌｏｉｔｉｎｇｔｈｅＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍｆｏｒｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｏｍｅｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎＰｅｔｕｎｉａ[Ｊ].ＳｃｉＲｅｐꎬ６(１):１－８.ＺＨＡＮＧＪＪꎬＹＡＮＧＥＤꎬＨＥＱꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１９.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＷＲＫＹｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｄｒｕｍｓｔｉｃｋ(ＭｏｒｉｎｇａｏｌｅｉｆｅｒａＬａｍ.)[Ｊ].ＰｅｅｒＪꎬ７(７０９３):１－２０.ＺＨＡＮＧＲꎬＧＵＯＣＣꎬＺＨＡＮＧＷＥꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１３.ＤｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｅｔａｌｉｄｅｎｔｉｔｙｇｅｎｅＡＰＥＴＡＬＡ３￣３ｉｓｈｉｇｈｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｌｏｓｓｏｆｐｅｔａｌｓｗｉｔｈｉｎｔｈｅｂｕｔｔｅｒｃｕｐｆａｍｉｌｙ(Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ) [Ｊ].ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉꎬ１１０(１３):５０７４－５０７９.ＺＨＥＮＧＸＷꎬＯＵＹＡＮＧＹＷꎬＰＡＮＸＬꎬｅｔａｌ.ꎬ２０２２.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｎｃｌｏｎｉｎｇｏｆＡｃＭＡＤＳ１４ｇｅｎｅａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｆｌｏｗｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｉｎｅａｐｐｌｅ[Ｊ].ＧｕａｎｇｄｏｎｇＡｇｒｉｃＳｃｉꎬ４９(１):４２－５０.[郑雪文ꎬ欧阳嫣惟ꎬ潘晓璐ꎬ等ꎬ２０２２.菠萝ＡｃＭＡＤＳ１４基因的克隆及其在花发育中的表达分析[Ｊ].广东农业科学ꎬ４９(１):４２－５０.]ＺＨＵＬＦꎬ２０１３.ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢｃｌａｓｓｇｅｎｅｓｉｎＢａｍｂｕｓａｏｌｄｈａｍｉｉ[Ｄ].Ｈａｎｇｚｈｏｕ:ＺｈｅｊｉａｎｇＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ.[朱龙飞ꎬ２０１３.绿竹Ｂ类基因克隆与功能初步分析[Ｄ].杭州:浙江农林大学.](责任编辑㊀周翠鸣)６６２广㊀西㊀植㊀物４４卷。
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psp 寄生前夜 第三次生日搜查实绩列表
快速通过CHAPTER3最后一个场景（有铁架桥和高台的那个场景）。
第三章
CHAPTER1
ローバーとの戦闘回避
在Detector出现的三个场景中不被它捕捉到而引出Roh。
全物資の回収
回收所有物品。
CHAPTER2
スナッチ被害の低減
有舞台的场景里，进门直接消灭高台附近的Slacker且不弄坏台子（顺便把旁边的Orb也打掉）。
CHAPTER3
リーパーからの無傷生還
被Reaper追杀的两个场景均无伤逃脱。
リーパー初戦からの迅速な撤退
被Reaper追杀的第一个场景中，走上方捷径逃出（这条路会被收割老贼开血墙隔断，觉得时间紧的话可以开三红冲过去）。
ローラー殲滅
在最深处的山谷防卫战中消灭全部的Roller。
CHAPTER4
突入部隊の生還
对Reaper决战尽量少损失队员。
ノースシャローズタワーへの迅速な突入
快速击倒巨大Worm。
CHAPTER2
突入部隊の生還
在塔顶上对战两只Worm时不损失队员。注意第一只打到一半时第二只会在我方初始地点出现，应该及早把人员移开。
制空権確保
驾驶直升机的场景击破一定数量以上(20个)的炮台。
撤退援護
驾驶直升机的场景开始不久，击破追赶一群士兵的一只Worm。
完成流程：
1.OD遇到的第一个一般人（在有舞台的那个场景），控制他一直走到补给所。
2.出门后将OD区里两个一般人，回头把他们送回去。
3.在过一个区，OD这个区里的一般人，会被一扇蓝色的门挡住，用雷把它炸开。送这个人回去。
4.在有3个ORB的舞厅里,找到最后一个一般人,送回去之后任务完成。
psp寄生前夜第三次生日搜查实绩列表
第一章第二章第三章第四章第五章文案编辑词条B 添加义项?文案，原指放书的桌子，后来指在桌子上写字的人。
现在指的是公司或企业中从事文字工作的职位，就是以文字来表现已经制定的创意策略。
文案它不同于设计师用画面或其他手段的表现手法，它是一个与广告创意先后相继的表现的过程、发展的过程、深化的过程，多存在于广告公司，企业宣传，新闻策划等。
基本信息中文名称文案外文名称Copy目录1发展历程2主要工作3分类构成4基本要求5工作范围6文案写法7实际应用折叠编辑本段发展历程汉字"文案"(wén àn)是指古代官衙中掌管档案、负责起草文书的幕友,亦指官署中的公文、书信等;在现代，文案的称呼主要用在商业领域，其意义与中国古代所说的文案是有区别的。
在中国古代，文案亦作" 文按"。
公文案卷。
《北堂书钞》卷六八引《汉杂事》:"先是公府掾多不视事，但以文案为务。
"《晋书·桓温传》:"机务不可停废，常行文按宜为限日。
" 唐戴叔伦《答崔载华》诗:"文案日成堆，愁眉拽不开。
"《资治通鉴·晋孝武帝太元十四年》:"诸曹皆得良吏以掌文按。
"《花月痕》第五一回:" 荷生觉得自己是替他掌文案。
"旧时衙门里草拟文牍、掌管档案的幕僚，其地位比一般属吏高。
《老残游记》第四回:"像你老这样抚台央出文案老爷来请进去谈谈，这面子有多大!"夏衍《秋瑾传》序幕:"将这阮财富带回衙门去，要文案给他补一份状子。
"文案音译文案英文:copywriter、copy、copywriting文案拼音:wén àn现代文案的概念:文案来源于广告行业，是"广告文案"的简称，由copy writer翻译而来。
多指以语辞进行广告信息内容表现的形式，有广义和狭义之分，广义的广告文案包括标题、正文、口号的撰写和对广告形象的选择搭配;狭义的广告文案包括标题、正文、口号的撰写。
线粒体
利用标记氨基酸培养细胞，用氯霉素和放线菌酮分别抑制线粒体和细胞质蛋白质合成的方法，发现人的线粒体DNA编码的多肽为细胞色素c氧化酶的3个亚基，F0的2个亚基，NADH脱氢酶的7个亚基和细胞色素b等13条多肽。此外线粒体DNA还能合成12S和16SrRNA及22种tRNA。 mtDNA分子为环状双链DNA分子，外环为重链（H），内环为轻链（L ）。基因排列非常紧凑，除与mtDNA复制及转录有关的一小段区域外，无内含子序列。每个线粒体含数个m tDNA，动物m tDNA 约16-20kb，大多数基因由H链转录，包括2个rRNA ，14个tRNA 和12个编码多肽的mRNA ，L链编码另外8个tRNA和一条多肽链。mtDNA上的基因相互连接或仅间隔几个核苷酸序列，一些多肽基因相互重叠，几乎所有阅读框都缺少非翻译区域。很多基因没有完整的终止密码，而仅以T或TA 结尾，mRNA的终止信号是在转录后加工时加上去的。 线粒体在形态，染色反应、化学组成、物理性质、活动状态、遗传体系等方面，都很像细菌，所以人们推测线粒体起源于内共生。按照这种观点，需氧细菌被原始真核细胞吞噬以后，有可能在长期互利共生中演化形成了现在的线粒体。在进化过程中好氧细菌逐步丧失了独立性，并将大量遗传信息转移到了宿主细胞中，形成了线粒体的半自主性。 线粒体遗传体系确实具有许多和细菌相似的特征，如：①DNA为环形分子，无内含子；②核糖体为70S型；③RNA聚合酶被溴化乙锭抑制不被放线菌素D所抑制；④tRNA、氨酰基-tRNA合成酶不同于细胞质中的；⑤蛋白质合成的起始氨酰基tRNA是N-甲酰甲硫氨酰tRNA，对细菌蛋白质合成抑制剂氯霉素敏感对细胞质蛋白合成抑制剂放线菌酮不敏感。 此外哺乳动物mtDNA的遗传密码与通用遗传密码有以下区别：①UGA不是终止信号，而是色氨酸的密码；②多肽内部的甲硫氨酸由AUG和AUA两个密码子编码，起始甲硫氨酸由AUG，AUA，AUU和AUC四个密码子编码；③AGA，AGG不是精氨酸的密码子，而是终止密码子，线粒体密码系统中有4个终止密码子（UAA，UAG，AGA，AGG）。 mtDNA表现为母系遗传。其突变率高于核DNA，并且缺乏修复能力。有些遗传病，如Leber遗传性视神经病，肌阵挛性癫痫等均与线粒体基因突变有关。 在各种细胞器中，线粒体具有特殊性，因其含有核糖体且自身带有遗传物质。线粒体DNA是环状的，且有一些和标准真核生物遗传密码不同的变化。 这些特性导致了内共生学说——线粒体起源于内共生体。这种被广泛接受的学说认为，原先独立生活的细菌在真核生物的共同祖先中繁殖，形成今天的线粒体。 这种说法还被应用与科幻小说当中，其中小说《寄生前夜》说的是，在亿万年间，生物都在不停的进化。在生物的体内，直接提供能量的线粒体进化速率快于生物本身，以致现在线粒体已经有了意识，并且拥有强大的力量，甚至可以幻化出人形。于是在某个时刻，线粒体终于爆发了，它们要消灭人类，主宰这个世界。 事实上，在科幻领域中，线粒体是十分广泛而流行的题材，不仅小说，在电视剧集《太空堡垒-卡拉狄加》中，人型赛昂人的基因最终进入人类的细胞，成为线粒体。片中那个"关系着人类与人形赛昂人生死存亡"的混血小女孩赫拉，正是生活在15万年前的，当今人类的"线粒体夏娃"。
寄生前夜第三次生日最全金手指
寄生前夜第三次生日最全金手指_S ULJM-05798_G The 3rd birthday_C0 錢 99999_L 0x014AAF04 0x0001869F _C0 武器全48個開放_L 0x817FDC00 0x00050004 _L 0x00000001 0x00000000 _L 0x817FDC280x002B0004 _L 0x00000001 0x00000000 _C0 全服装8_L 0x114AB75C 0x000007FF _C0 現在弾数,999_L 0x814A1538 0x00040044 _L 0x000000E7 0x00000000 _L 0x814A15390x00040044 _L 0x00000003 0x00000000 _C0 最大弾数,999 MAX _L 0x814A153C 0x00040044 _L 0x000000E7 0x00000000 _L 0x814A153D0x00040044 _L 0x00000003 0x00000000 _L 0x814A1570 0x00030044 _L0x000000E7 0x00000000 _L 0x814A1571 0x00030044 _L 0x00000003 0x00000000 _C0 ??XO子弹不减_L 0x014A1538 0x00000063 _L 0x014A157C 0x00000063 _L 0x014A15C00x00000063 _L 0x014A1604 0x00000063 _C0 ?键子彈不減_L 0x014A1538 0x00000063 _C0 口键子彈不減_L 0x014A157C 0x00000063 _C0 X键子彈不減_L 0x014A1604 0x00000063 _C0 92M限定_L 0x21499364 0x43000000 _L 0x21499368 0x43000000 _C0 riba MAX_L 0x214AA10C 0x447A0000 _C0 DNA数99_L 0x014AAED4 0x00000063 _C0 全DNALV2554_L 0x814A153C 0x0009001C _L 0x00000019 0x00000000 _C0 92M Remodeling_L 0x201705B4 0xAC900000 _L 0x01499422 0x000000FA _L 0x214993640x47000000 _L 0x21499368 0x49000000 _L 0x214993D4 0x47000000 _C0 CR15 C.限定_L 0x201705B4 0xAC900000 _L 0x2149A36C 0x47000000 _L 0x2149A3700x49000000 _L 0x2149A3DC 0x47000000_L 0x0149A42A 0x000000FA _C0 解放槽滿状态_L 0xC02C2EBC 0x00000000 _C0 連鎖槽快速蓄滿_L 0xC01958E4 0x00000000 _C0 手榴弾,9_L 0x014A16BC 0x00000009 _C0 HP不减_L 0x214A16CC 0x45084000 _L 0x21445DF4 0x45084000 _L 0x214450B40x45084000 _L 0x213B6BDC 0x45084000 _C0 BP满_L 0x214AAF04 0x05F5E0FF _C0 TAMA MUGEN !_L 0x014A1604 0x00000018 _L 0x114A15F8 0x000003E7 _C0 獲得經驗値512倍_L 0xC00E94CC 0x00132A40 _C0 獲得武器經驗値9984倍_L 0xC02C4144 0x0A200400 _L 0x20001000 0x3C10461C _L 0x200010040x4490A000 _L 0x20001008 0x0A2B1053 _L 0x2000100C 0x460CA502 _C0 武器购买完毕标志开_L 0x814A1E68 0x00320114 _L 0x00000001 0X00000000 _C0 武器出现标志ON _L 0x814A1E69 0x00320114 _L 0x00000001 0X00000000_C0 两标志ON_L 0x814A1E68 0x0032008A _L 0x10000101 0X00000000 _C0 WEAPON(所有武器)_L 0x814AAF08 0x00060004 _L 0x00000009 0x00000000 _C0 OE技术水平满_L 0x814A0348 0x0009001C _L 0x000000FF 0X00000000 _C0 PAD追加 (押下L即停止 )_L 0x214AA10C 0x447F0000 _L 0xD0000000 0x10000100 _L 0x214AA10C0x00000000 _C0 服装破损状态(邪恶人士最爱)_L 0x014AAF40 0x00000002 _L 0x014AAF48 0x00000002 _C0 難易度EASY _L 0x017FDA74 0x00000000 _C0 難易度NORMAL_L 0x017FDA74 0x00000001 _C0 難易度HARD_L 0x017FDA74 0x00000002 _C0 難易度_L 0x017FDA74 0x00000003 _C0 EPSODE EP6_L 0x017FDA78 0x00000006 _C0 EXP x2_L 0x214AAF00 0x00022040 _C0 EXP x4_L 0x214AAF00 0x00022080 _C0 EXP x8_L 0x214AAF00 0x000220CO _C0 sikaku tama_L 0x014A1B7C 0x00000063 _C0 batu tama_L 0x014A1C04 0x00000063 _C0 sankaku tama_L 0x014A1B38 0x00000063 _L 0x114AB504 0x0000FDE8 _C0 aya死亡数_L 0x01488BA0 0x00000000 _C0 士兵死亡数_L 0x01488BA4 0x00000000 _C0 被下降数_L 0x01488BA8 0x00000000_C0 overkill的敌人讨伐回数_L 0x01488BB4 0x00000032_C0 手枪使用讨伐数_L 0x01488BC4 0x00000063_C0 霰弹枪使用讨伐数_L 0x01488BC8 0x00000032_C0 sniper使用讨伐数_L 0x01488BCC 0x00000032_C0 发射器&gurenedo使用讨伐数_L 0x01488BD0 0x00000032文 - 汉语汉字编辑词条文，wen，从玄从爻。
三重融合PCR法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆
三重融合PCR 法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cD NA 克隆王力华,付士红,唐青,杨益良,梁国栋3(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,北京100052)摘要:利用三重融合PCR 法,即将3个DNA 片段放在同一个反应里进行长片段PCR 扩增法,融合得到了包含辛德毕斯病毒X J 2160株结构基因E3、E2、6K 、3′U TR 和辛德毕斯病毒YN87448株结构基因E1的融合DNA 片段E 3E 26KE 13′U TR 。
通过此融合片段两端引入的Xba I 和Xho I 酶切位点将其连接到X J 2160株的感染性全基因组cDNA 克隆骨架上,成功构建了辛德毕斯病毒株X J 2160与YN87448外膜糖蛋白基因E1相互替换的嵌合病毒cD 2NA 克隆,命名为pBR 2X J160YE1。
该克隆线性化后经体外转录,RNA 转录体脂质体法转染BHK 221细胞,36h 后细胞发生病变。
间接免疫荧光检测到病毒蛋白的表达。
提取5次传代后细胞上清中病毒RNA ,RT 2PCR 法检测证明病毒来源于嵌合病毒cDNA 克隆。
此感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA 克隆可以作为研究辛德毕斯病毒E1糖蛋白基因相关功能及X J 2160病毒和YN87448病毒存在单方向血清学反应的分子机理的分子生物学工具。
关键词:辛德毕斯病毒;融合PCR ;嵌合病毒;cDNA 克隆;E1糖蛋白中图分类号:R37313Q78 文献标识码:A 文章编号:1000-8721(2006)02-0107-07收稿日期:2005-08-09;修回日期:2005-09-22基金项目:国家自然科学基金(No 130470083)作者简介:王力华(1977-),男,河北保定籍,在读博士,研究方向为分子病毒学,Tel :86-10-83559924;E 2mail :wanglih9755@ya 2hoo 1com 1cn通讯作者:梁国栋,Tel :86-10-63510124;E 2mail :gdliang @hotmail 1com 目前重组DNA 片段的方法包括利用合适的限制性内切酶连接重组和通过加连接子连接重组。
第三次生日攻略
《寄生前夜3 第三次生日》游戏各系统详解大家好，好久不见了，黑崎首先在这里预祝大家圣诞快乐～～祝大家有妹子的感情更加牢固，没妹子的基友不计其数......咳咳，第三次生日的破解方法今日终于放出了，黑崎在这里就为大家做一个详细的系统介绍。
鉴于黑崎是头一次接触寄生前夜系列，加之自己能力有限，系统介绍方面难免有疏漏和不当之处，还请各位看官不吝赐教。
此外，希望大家在享受游戏的同时也不要忽略了和家人朋友的交流，毕竟游戏不是生活的全部。
操作简介：L键：ReLoad长按L键：呼出武器变更菜单R键：镜头重设长按R键：准备攻击(锁定)十字键：(锁定时)切换锁定位置(通常时)切换镜头摇杆：角色移动□键：手枪攻击R+□键：普通攻击×键：回避/各种动作○键：榴弹枪攻击△键：OverDive△+○键：发动特殊必杀技Liberation&交叉攻击系统：aya可以在Liberation槽满时按下△+○键发动“解放”，在解放模式中，aya的移动速度会变快，同时还可以自动回避敌人攻击，对一些普通攻击无效的怪物，利用这项技能便可对其造成大量伤害。
交叉攻击系统(Firecross)即连携攻击系统。
是通过在游戏中按R键待Firecross槽攒满而发动的与队友一同进行的强力攻击。
身边需要有可供连携的队友存在，不过技能的准备时间相对比较长。
而且队友的意识实在是水的一比，很多情况下这个系统并不能发挥其应有的威力。
DNA/OE改造系统：本作的成长系统。
大家在发动OverDive技能时有一定几率获得OE芯片，可以用来对aya的基因进行改造。
在进行改造时，将相同类型基因排列到一起，该基因所决定的能力会更容易升级。
将不同类型基因组合的话，则有可能会产生基因变异。
这些变异可能是正面的，也可能是负面的。
不过，正因为如此，游戏的自由度也大大提高了。
玩家可以根据自己喜好来强化组合自己的能力。
根据官方之前所透露的消息，在游戏初期，玩家可能会更依赖武器攻击，但游戏后期，玩家最终会以特殊能力去应战，大家多多尝试合成出更多牛X的能力吧!武器与换装系统：在游戏当中，长按L键+×，○，△，□键可以变换武器，除了初始的手枪外，其余枪的子弹都是有限的。
寄生前夜 第三次生日最全金手指
_S ULJM-05798 _G The 3rd birthday_C0錢99999_L 0x014AAF04 0x0001869F_C0武器全48個開放_L 0x817FDC00 0x00050004_L 0x00000001 0x00000000_L 0x817FDC28 0x002B0004_L 0x00000001 0x00000000_C0全服装8_L 0x114AB75C 0x000007FF_C0現在弾数ｘ999_L 0x814A1538 0x00040044_L 0x000000E7 0x00000000_L 0x814A1539 0x00040044_L 0x00000003 0x00000000_C0最大弾数ｘ999 MAX_L 0x814A153C 0x00040044_L 0x000000E7 0x00000000_L 0x814A153D 0x00040044_L 0x00000003 0x00000000_L 0x000000E7 0x00000000 _L 0x814A1571 0x00030044 _L 0x00000003 0x00000000 _C0△□XO子弹不减_L 0x014A1538 0x00000063 _L 0x014A157C 0x00000063 _L 0x014A15C0 0x00000063 _L 0x014A1604 0x00000063 _C0△键子彈不減_L 0x014A1538 0x00000063 _C0口键子彈不減_L 0x014A157C 0x00000063 _C0 X键子彈不減_L 0x014A1604 0x00000063 _C0 92M限定_L 0x21499364 0x43000000 _L 0x21499368 0x43000000 _C0 riba MAX_L 0x214AA10C 0x447A0000 _C0 DNA数99_C0全DNALV2554_L 0x814A153C 0x0009001C _L 0x00000019 0x00000000 _C0 92M Remodeling_L 0x201705B4 0xAC900000 _L 0x01499422 0x000000FA _L 0x21499364 0x47000000 _L 0x21499368 0x49000000 _L 0x214993D4 0x47000000 _C0 CR15 C.限定_L 0x201705B4 0xAC900000 _L 0x2149A36C 0x47000000 _L 0x2149A370 0x49000000 _L 0x2149A3DC 0x47000000 _L 0x0149A42A 0x000000FA _C0解放槽滿状态_L 0xC02C2EBC 0x00000000 _C0連鎖槽快速蓄滿_L 0xC01958E4 0x00000000 _C0手榴弾Ｘ9_C0 HP不减_L 0x214A16CC 0x45084000 _L 0x21445DF4 0x45084000 _L 0x214450B4 0x45084000 _L 0x213B6BDC 0x45084000 _C0 BP满_L 0x214AAF04 0x05F5E0FF _C0 TAMA MUGEN !_L 0x014A1604 0x00000018 _L 0x114A15F8 0x000003E7 _C0獲得經驗値512倍_L 0xC00E94CC 0x00132A40 _C0獲得武器經驗値9984倍_L 0xC02C4144 0x0A200400 _L 0x20001000 0x3C10461C _L 0x20001004 0x4490A000 _L 0x20001008 0x0A2B1053 _L 0x2000100C 0x460CA502 _C0武器购买完毕标志开_L 0x814A1E68 0x00320114_L 0x00000001 0X00000000_C0武器出现标志ON_L 0x814A1E69 0x00320114_L 0x00000001 0X00000000_C0两标志ON_L 0x814A1E68 0x0032008A_L 0x10000101 0X00000000_C0 WEAPON(所有武器)_L 0x814AAF08 0x00060004_L 0x00000009 0x00000000_C0 OE技术水平满_L 0x814A0348 0x0009001C_L 0x000000FF 0X00000000_C0 PAD追加(押下L即停止)_L 0x214AA10C 0x447F0000_L 0xD0000000 0x10000100_L 0x214AA10C 0x00000000_C0服装破损状态(邪恶人士最爱) _L 0x014AAF40 0x00000002_L 0x014AAF48 0x00000002_C0難易度EASY_L 0x017FDA74 0x00000000 _C0難易度NORMAL_L 0x017FDA74 0x00000001 _C0難易度HARD_L 0x017FDA74 0x00000002 _C0難易度_L 0x017FDA74 0x00000003 _C0 EPSODE EP6_L 0x017FDA78 0x00000006 _C0 EXP x2_L 0x214AAF00 0x00022040 _C0 EXP x4_L 0x214AAF00 0x00022080 _C0 EXP x8_L 0x214AAF00 0x000220CO _C0 sikaku tama_L 0x014A1B7C 0x00000063 _C0 batu tama_L 0x014A1C04 0x00000063 _C0 sankaku tama_L 0x014A1B38 0x00000063_L 0x114AB504 0x0000FDE8_C0 aya死亡数_L 0x01488BA0 0x00000000_C0士兵死亡数_L 0x01488BA4 0x00000000_C0被下降数_L 0x01488BA8 0x00000000_C0 overkill的敌人讨伐回数_L 0x01488BB4 0x00000032_C0手枪使用讨伐数_L 0x01488BC4 0x00000063_C0霰弹枪使用讨伐数_L 0x01488BC8 0x00000032_C0 sniper使用讨伐数_L 0x01488BCC 0x00000032_C0发射器&gurenedo使用讨伐数_L 0x01488BD0 0x00000032。
寄生前夜3场景13攻略
寄生前夜3场景13攻略
场景13：“克劳福德居所”
1.一开始，你需要调查房间里的各种物品，找到一些线索。
其中一个重要的物品是抽屉中的一封信，仔细阅读后你将获得新的线索。
2.在床边你能找到一些奇怪的符号，使用摄像机进行拍照留念，这个符号会对后面的进程有影响。
3.接下来，你需要探索客厅和楼下的餐厅，找到所有的线索。
记得还要打开餐厅里的一个小抽屉，里面会有一个锡质盒子。
然后，把锡质盒子带到客厅，放到一台小地方的桌子上，按照毒药的提示制作毒药。
4.接着回到2楼，使用毒药将门锁住，再次进入房间后，你会发现所有的物品被重新排列了。
使用摄像机进行拍照留念，这个符号会对后面的进程有影响。
5.进入阳台，使用望远镜观察周围。
你将会发现各种线索。
找到所有线索，包括阳台上的另一篇信。
6.最后一步是进入密室，找到地板上的小孔。
使用墨水涂抹察看隐藏文字，解开明信片密码。
7.经过以上步骤，你就能找到真相了。
胞嘧啶核苷三磷酸生物合成研究
胞嘧啶核苷三磷酸生物合成研究展细胞嘧啶核苷三磷酸（CTP）是一种重要的生物合成产物，参与细胞膜脂质的合成，以及蛋白质、核酸和糖苷的合成。
它的生物合成通过一系列的反应步骤完成，包括磷酸二酯酶（PEP）、磷酸腺苷脱氢酶（ATP）、磷酸腺苷羧化酶（ATP）和磷酸腺苷酸羧化酶（ATP）等。
近年来，研究人员已经研究出一系列关于CTP生物合成的新发现，包括研究了CTP生物合成反应机制、反应中的关键酶以及CTP生物合成中的调控因子等。
本文将综述近年来CTP生物合成研究的进展，以期对该领域的研究有所帮助。
CTP生物合成的研究始于20世纪50年代，当时研究人员发现CTP的生物合成反应可以分为三个步骤：磷酸二酯酶（PEP）、磷酸腺苷脱氢酶（ATP）和磷酸腺苷羧化酶（ATP）。
随后，人们发现了CTP生物合成反应中的关键酶，其中包括磷酸二酯酶（PEP）、磷酸腺苷脱氢酶（ATP）和磷酸腺苷羧化酶（ATP）。
此外，研究人员还发现了一系列调控CTP生物合成的因子，包括调控磷酸二酯酶（PEP）、磷酸腺苷脱氢酶（ATP）和磷酸腺苷羧化酶（ATP）的调控因子。
近年来，研究人员对CTP生物合成的研究取得了重大进展。
例如，研究人员发现了一种新的CTP生物合成反应，即磷酸腺苷酸羧化酶（ATP）介导的CTP生物合成。
此外，研究人员还发现了一系列新的调控CTP生物合成的因子，包括磷酸二酯酶（PEP）、磷酸腺苷脱氢酶（ATP）和磷酸腺苷羧化酶（ATP）的调控因子。
此外，研究人员还发现了CTP生物合成反应中的关键酶，如磷酸二酯酶（PEP）、磷酸腺苷脱氢酶（ATP）和磷酸腺苷羧化酶（ATP）等。
综上所述，近年来CTP生物合成的研究取得了重大进展，为进一步深入研究CTP生物合成反应提供了重要的理论基础。
未来，研究人员将继续深入研究CTP生物合成反应，以期发现更多有关CTP生物合成的新知识。
dna探针的合成方法
dna探针的合成方法一、DNA探针的重要性。
1.1 DNA探针就像是一把神奇的钥匙。
在基因检测、疾病诊断等众多生物科学领域，它起着至关重要的作用。
它能够特异性地识别目标DNA序列，就像一把钥匙开一把锁一样精准。
这对于我们了解生物的基因组成、探寻疾病的根源等，那可是不可或缺的。
1.2 打个比方，如果把基因世界看作是一个巨大而复杂的迷宫，DNA探针就是那指引方向的小箭头。
它能帮助我们在这个迷宫中找到我们想要研究的特定基因片段，这意义可太大了。
二、化学合成法。
2.1 化学合成法是合成DNA探针比较常用的一种方法。
这种方法就像是搭积木一样。
我们通过化学反应，一个一个地把核苷酸连接起来。
化学家们就像技艺精湛的工匠，按照预定的顺序，精心地构建着DNA探针的序列。
2.2 不过呢，这种方法也有它的局限性。
它合成的长度通常较短，如果要合成较长的DNA探针，就像要搭一个超级长的积木塔，难度可就大大增加了，很容易出现错误。
而且成本也会随着长度的增加而迅速上升，就像物价飞涨一样，让人有点吃不消。
三、酶促合成法。
3.1 酶促合成法那可就有点像借助生物自身的力量来办事了。
这里面最常用的酶就是DNA聚合酶。
这个酶就像是一个勤劳的小助手，以一段已知的DNA为模板，按照碱基互补配对的原则，把游离的核苷酸添加到新合成的DNA链上。
这就好比照着图纸盖房子，只要图纸准确，盖出来的房子（也就是合成的DNA探针）就错不了。
3.2 但是呢，这个方法也不是十全十美的。
它对模板DNA的要求比较高，如果模板DNA有一点小问题，就像盖房子的图纸有点瑕疵，那合成出来的DNA探针可能就会有偏差。
而且酶促反应的条件比较苛刻，就像伺候一个娇贵的小宠物，温度、pH值等环境因素稍微有点不对，反应就可能进行得不顺利。
四、从mRNA合成法。
4.1 从mRNA合成法也是一种不错的途径。
我们都知道mRNA是DNA转录的产物，就像DNA的一个信使。
我们可以利用逆转录酶，把mRNA这个信使的信息反转录成DNA，然后再经过一些后续的处理，就得到了我们想要的DNA探针。
寄生前夜3DNA合成
橙黄色（OD相关技能）：
金黄色（OverKill相关技能）：
突然变异获得技能简表：
绿色：
绿枪<--合战crossfire（交叉火力）威力提升
绿时钟<--合战准备时间减少
绿血<--合战一定几率参加者回血。
蓝色：
蓝枪<--杀死敌人或者OD攻击之后一定几率武器攻击变高蓝盾<--永久性的防御变高
蓝冲击<--装备使用手枪一定几率会心
复活<--复活一次，具体是一章一次还是一节一次我不清楚
无敌<--被攻击一定几率出现无敌护罩
三丸<--获得OE品质提高
橙色：
橙血<--OD之后一定几率恢复血量
橙盾<--OD后一定几率防御提高一段时间
橙圈<--OD后释放冲击波吹飞周围敌人
橙弹<--OD后一定几率恢复一定量弹药
ODK<--OD攻击威力提升
黄时钟<--OD攻击后一定几率出现子弹时间现象紫色：
紫枪<--LIBERATION解放攻击威力提升
紫血
紫圈。
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橙黄色（0D相关技能）：
HEALING OD时一定几率回复少量生命值
ANTIBODY O□时一定几率防御力上升
RESTOCK OD时一定几率补充弹药
IMPACT WAVE OD时一定几率产生弹开周围敌人的冲击波
金黄色（OverKill相关技能）
OverKill后，一定几率极大幅度降低AYA周围的时间流动速度，此时不仅敌人会变成龟速, HASTE
CrossFire槽和三红槽的消耗速度也会减慢。
KILL BOOST 提高OverKill 的威力
CROSS HEALING 参与Cross Fire 的全部人员一定几率生命值回复
RAPID LINK CrossFire发动速度加快
BOOST FIRE CrossFire威力提升
紫色（三红状态相关技能）
持有此技能时，三红状态下按圆圈键可发动PE2里的终极魔法..…呃终极线粒体能力地INFERNO 狱火。
使用后对大范围内敌人造成超大伤害,但自身直接死亡。
.死之前可以OD到其他人身上。
持有PR—RAISE这技能的话也可以原地复活。
ENERGY SHOT 提高三红状态中能量弹的伤害。
REGENERATION 三红状态下少量回复HP
红色?：
SLOW AYA行动速度下降
ESCAPE DOWN 紧急回避次数减少
ODDS DOWN 获得的DNA片段质量下降
SLOW RECHARGE 上弹耗时增加
ILLNESS HP回复速度减慢
DIEASE LIBERATION槽积蓄速度下降
绿色（Cross Fire 相关技能）
突然变异获得技能简表:
绿枪<--合战crossfire （交叉火力）威力提升
绿时钟合战准备时间减少
绿血<--合战一定几率参加者回血。
蓝色：
.rTTT. .
蓝枪<--杀死敌人或者0D攻击之后一定几率武器攻击变高蓝盾<--永久性的防御变高
蓝冲击＜-- 装备使用手枪一定几率会心
复活＜-- 复活一次，具体是一章一次还是一节一次我不清楚无敌＜-- 被攻击一定几率出现无敌护罩三丸＜--获得0E品质提高
橙色：
橙血＜--0D 之后一定几率恢复血量
橙盾＜--0D 后一定几率防御提高一段时间
橙圈＜--0D 后释放冲击波吹飞周围敌人
橙弹＜--0D 后一定几率恢复一定量弹药
ODK＜--OD攻击威力提升
黄时钟＜--0D攻击后一定几率出现子弹时间现象
紫色：
紫枪｛--LIBERATION解放攻击威力提升
紫血｛--LIBERATION解放时血量自动回复
紫圈｛--LIBERATION解放时按0键发动自爆范围攻击，威力巨大。