Western Blot(步骤简略,但注意事项、经验总结、基本原理很全面)
WesternBlot（步骤简略,但注意事项经验总结基本原理很全面）
Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面）1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL 调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用T ris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH 太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gT ris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
Westernblot实验步骤及注意事项_WesternBlotting_易生物
Westernblot实验步骤及注意事项_WesternBlotting_易⽣物Western blot实验步骤及注意事项2009-05-25 23:46:38来源：易⽣物浏览次数：0 ⽹友评论 0条关键词：Westernblot⼀.实验步骤1. 组织块称重2. 利⽤液氮、研钵粉碎组织块3. 加⼊RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30µl，10 mg/ml PMSF），利⽤Polytron进⼀步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加⼊PMSF（每克组织30µl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移⼊离⼼管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进⾏Bradford⽐⾊法测定蛋⽩质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋⽩质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸⽔浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜⽤丽春红染⾊，胶⽤考马斯亮蓝染⾊14. Westernblot 试剂盒显⾊15. 分析⽐较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋⽩质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，⽤5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的⽓泡。
2）在凝胶/滤膜外再包⼀张3mm滤纸（预先⽤转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有⽓泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照⼚家建议⽅法放⼊电泳装置中，凝胶⾯向阴极。
4）将上述装置放⼊缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照⼚家所⽰接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基⿊中快速染⾊，直⾄分⼦量标准显现时取出，记录下标准位置。
Western blot 实验步骤及其注意事项
Western blot 实验步骤及其注意事项注意事项：western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。
这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。
实验中取胶和膜需带手套。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP 细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE 的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
westernblot原理及过程
westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。
当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。
通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。
这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。
2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。
蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。
SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。
电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。
封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。
抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。
蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。
WesternBlot基本原理过程及注意事项
W e s t e r n B l o t基本原理过程及注意事项The latest revision on November 22, 2020W e s t e r n B l o t基本原理、过程及注意事项原理是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
主要有三个过程：蛋白质电泳、转膜、检测。
样品的准备样品种类主要有培养的细胞、组织（需磨碎）、特殊细胞（切割下来的肿瘤细胞）等。
1、裂解液主要有RIPA和三去污两种，RIPA适用于细胞质中蛋白检测，而三去污适用于总蛋白。
三去污又分为离子型和非离子型。
离子型的裂解能力较强如SDS等，非离子型的包括NP-40、Tritonx-100。
2、裂解液的成分，3、样品缓冲液samplebuffer备注：1、样品应保持低温，且实验过程应低温操作，此举为了抑制酶的活性。
裂解完后样品液会显得粘稠是长结构DNA所致，故需要匀浆，打断DNA。
一般不用超声，因为容易引起蛋白不可逆的变性。
2、用2X样品缓冲液与样品1：1混匀。
4度保存。
3、样品混合液加样前需要100℃或沸水浴加热3-5分钟并迅速插入冰中，以充分变性蛋白。
配胶：胶的主要成分为丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
4、分离胶的配方：以20ml的8﹪分离胶为例：5、浓缩胶配方：6ml为例备注：1、制胶是避免产生气泡，空气会影响胶的聚合，在蛋白质表观分子量分析时影响大。
2、因为有SDS，每次混匀时不应剧烈以免产生过多气泡。
3、蛋白容易与SDS脱离而失去负电荷,因此胶中加入SDS为了给蛋白持续的负电荷。
4、垫条清洗干净，与制胶板压紧，避免漏胶。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
Westernblot实验步骤及注意事项
Westernblot实验步骤及注意事项Westernblot 实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
Western Blot 实验步骤及注意事项
Western Blot 实验步骤及注意事项western blot的实验步骤及注意事项一、实验步骤1.缓冲液配制(1) Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS（可不加）, 200ml Methanol（临用前加）,ddH2O to 1L(2)10×TBS: 1 M Tris・HCl（pH 7.5）100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L (3)TBST: 1×TBS中加入1/1000的Tween (4)封闭液：脱脂奶粉5%(w/v),用TBST配制 2. SDS-PAGE电泳电压：积层胶电泳电压80V左右，分离胶电泳电压110V~120V 3.免疫印迹(1) SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后，将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in，切6张Whatman 3mm滤纸和1张PVDF膜，与凝胶大小相符合。
将PVDF膜事先用甲醇浸泡，再用转移缓冲液浸泡。
(2) 将凝胶及PVDF膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸)逐层铺于转印仪上，凝胶一面连接阴极，100 V转移40 min（根据转移蛋白的分子量确定转移时间）。
(3) 将膜放入小盒中，加入5 mL封闭液，摇床上温育1 h。
(4) 以1/1000的比例，加入5 μL第一抗体，4 ℃温育过夜。
(5) TBST溶液洗膜10 min，轻倒，重复3次。
(6)加入 5 mL TBST溶液，以1/2000的比例，加入2.5 μL第二抗体，温育1 h。
(7) TBST溶液洗膜5min，轻倒，重复3次。
(8)加入2 mL显色底物温育3 min，将薄膜封入保鲜袋中，压平，尽可能不留空气，滤纸吸干显色底物。
放入夹板中。
(9)配制显影液和定影液。
暗室操作：将X光片放入夹板中，曝光5 s（根据荧光强度确定），然后放入显影液中，至出现明显的条带取出，水洗后放入定影液中，定影一段时间，取出用水冲洗干净。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。
同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。
同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。
Western blot步骤与经验总结
Western bloting经验总结1.试剂准备详细参考试剂配方2.制胶2.1 准备好制胶器，玻璃板务必要干净，否则容易产生气泡或使胶不平；玻璃板需卡紧，先用1ml H2O试探，以防漏胶。
将水倒去后用滤纸把残留在玻璃板上的水吸去（轻轻的，不要使卡紧的玻璃板松动）。
2.2 配胶：按需要配制适当浓度的胶，如上表及SDS-PAGE分离胶配方表。
充分混匀，尽量不要弄出气泡（可以轻轻快速旋转配胶用的烧杯30 s到1min，切莫太快以免液体溅出，如图所示[不是自转]；若用枪反复吹打，不要太快以免产生大量气泡）2.3 将胶慢慢加入到玻璃空隙中。
枪头可残留部分液体，以免把气泡打进玻璃板间，胶约7 ml（1.5mm厚，六一24D型）。
2.4 压胶：用无水乙醇或水轻轻地沿板加入，每块胶上加600 ul-1000 ul。
放于室温或37℃，务必放平，不平则胶歪，导致显出的蛋白条带歪曲。
2.4 20 min后倒去无水乙醇或水，用滤纸吸干。
（若胶不凝，可放30 min，再不凝的话就要考虑，10%AP溶液是否过期（有效一周）或浓度是否配错，是否忘记加促凝剂TEMED）。
2.5 配制浓缩胶(5%)并混匀，插好梳子，轻轻从梳子两端缝隙加入浓缩胶，直到胶快溢出梳子（溢出也无妨），检查是否有气泡，若有，将梳子轻轻拔出，重新插好。
放于室温或37℃，30分钟（浓缩胶较稀，时间要长些）3.冲洗加样孔：小心拔出梳子，若加样孔扭曲变形，可用针头将其扶正（勿将针头插到胶中）,先加部分1×SDS-PAGE 电泳缓冲液到内槽,用枪头吸电泳液轻轻冲洗加样孔，以排除气泡。
4.排除槽底的气泡：将内置电泳槽放在外槽中，加入1×SDS-PAGE 电泳缓冲液（外槽液，可以是内槽回收液）溢过底部胶（液面离底部3-4cm即可），倾斜整个电泳槽，反复提起放下内电泳槽，直至完全排除内槽底的气泡。
5.上样：蛋白样本与一定比例的上样buffer（5×）4:1混匀，沸煮3-5分钟。
WesternBlot操作步骤
WesternBlot操作步骤1.样品处理：-收集样品：从细胞培养物中收集细胞或从组织中收集组织样品。
-破碎细胞：使用合适的细胞破碎缓冲液将细胞破碎并释放蛋白质。
-甲醇沉淀：向破碎细胞中加入冷甲醇，以沉淀蛋白质，并将混合液冷冻在-20℃或-80℃下，使形成沉淀物。
-洗涤：使用冷丙酮洗涤蛋白质沉淀物，去除甲醇等杂质。
-干燥：在室温下或低真空下干燥蛋白质沉淀物，以去除水分。
2.SDS-：-制备凝胶：根据待分离蛋白的大小范围选择合适的凝胶浓度，如8%-12%聚丙烯酰胺凝胶。
- 制备样品：将样品加入样品缓冲液，如Laemmli缓冲液，并将其煮沸，以使蛋白质样品被变性和解聚。
-样品加载：将样品以适当的体积加载到凝胶孔中。
-电泳：将凝胶浸泡在预冷的电泳缓冲液中，并进行电泳（通常为100-200V），直到样品达到所需的分离程度。
-目视观察：在电泳结束后，可以通过染色或蛋白质染色来可视化分离的蛋白质带。
3.电转印：-制备膜和垫纸：将两张蛋白质转移膜和一片垫纸切割成与分离凝胶相同大小的形状。
-准备电转印池：将电转印池中的电转印缓冲液注满，并将蛋白质转移膜、垫纸和凝胶按顺序放入电转印池中，保持它们之间的紧密接触。
-转印：应用恒定的电流（通常为300mA）进行电转印，以将蛋白质从凝胶转移到膜上，通常需要1-2小时。
-验证电转印的效果：将凝胶和膜进行一致性染色或蛋白质染色，以判断蛋白质是否转移到膜上，是否均匀。
4.膜上抗体反应：-阻断：将膜放在牛血清蛋白（如5%脱脂奶粉）或胶原蛋白（如2%BSA）的阻断缓冲液中，以阻止非特异性的抗体结合。
-一次抗体：加入适当稀释的一次抗体，针对待检测蛋白的抗体。
将膜和一次抗体一起在冰箱中孵育，使二者结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗涤膜，以去除非特异性结合的抗体。
-二次抗体：添加适当稀释的二次抗体，该抗体与一次抗体结合，并标记有辅助酶或荧光标记物。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗涤膜，以去除未结合的二次抗体。
Western-blot的原理、操作及注意事项
Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。
在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。
硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。
双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。
双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。
干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。
可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
我的western-blot实验经验总结
我的western-blot实验经验总结
Western-blot实验是一种常用的免疫学分析方法，用于检测蛋白质的存在、定量和分子量。
在进行这项实验时，需要经过以下几个步骤：
1. 样品制备：首先需要从细胞或组织中提取蛋白质，并将其分离成不同的组分。
这可以通过各种方法来完成，例如细胞裂解、电泳分离等。
2. 凝胶制备：将分离的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，通过电泳分离蛋白质，使其根据分子大小以不同的速度移动。
3. 转移：将凝胶中分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺或聚偏氟乙烯膜上，以便进行进一步的免疫学分析。
4. 免疫学反应：使用特定的抗体识别目标蛋白质，并进行免疫学检测。
这包括将蛋白质与一种或多种特定抗体反应，再使用荧光标记或酶标记的二抗进行检测。
5. 成像和数据分析：使用特定的成像方法，例如荧光显微镜或化学发光成像，来可视化免疫学反应结果。
然后进行数据分析，例如测量蛋白质的强度、定量分析等。
在进行Western-blot实验时，需要注意一些常见问题，例如蛋白质分离不完全、
抗体不充分、背景噪音等。
为了获得准确和可重复的结果，需要仔细控制实验条件、进行质量控制和标准化操作。
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Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面）1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL 调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH 太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
10、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。
使用后应予以废弃。
11、脱脂奶粉5%(w/v)。
12、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
4.2.4 22. 聚丙烯酰胺凝胶溶液：分离胶12.5% ,PH8.8 5ml 10ml 15ml超纯水1.5ml 3.0 ml 4.5 ml30%丙烯酰胺溶液2.1 ml 4.2 ml 6.4 mlpH8.8、1.5mol/LTris溶液1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 mlTEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml10%过硫酸铵0.05ml 0.1 ml 0.15 ml浓缩胶：5% ，pH6.8 2 ml 4 ml 6 ml超纯水 1.4 ml 2.8 ml 4.1 ml30%丙烯酰胺溶液0.3 ml 0.6 ml 1.0 mlpH6.8、1.0mol/LTris溶液0.25 ml 0.5 ml 0.75 ml10%SDS 0.02 ml 0.04 ml 0.06 mlTEMED 0.002 ml 0.004 ml 0.006 ml10%过硫酸铵0.02ml 0.04ml 0.06ml一．配胶1．注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
2．分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可3．封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。
封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。
4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。
若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次**梳孔后加水拔出。
30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
二．样品处理1．培养的细胞（定性）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。
⑶100℃，1min。
⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。
⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP 管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。
若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
⑹待样品恢复到室温后上样。
2．培养的细胞（定量）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
三．电泳1．上样前将胶板下的气泡赶走。
2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。
2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。
3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。
四．转膜1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g，M-OH 200ml，加去离子水至1,000ml。
干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。
PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。
将滤纸也浸入转移液中。
2．取胶：将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。
注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）3．转膜：湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。
将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。
降温，将电泳槽置于冰水混合物中。
恒流100mA过夜，或400mA，4h。
注意不同蛋白的要求不同。
干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。
负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。
五．封闭及杂交1．封闭：将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。
必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。
2．结合一抗：一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。
反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。
在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。
3．洗涤：一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4．结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。
5．洗涤：二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
六．发光鉴定一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。
1．HRP-ECL发光法：将A、B发光液按比例稀释混合。
膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。
取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
2．AP-NBT/BICP显色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。
将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s 观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。
七．增强敏感性若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：1．用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。