植物悬浮细胞系的建立共22页
2018年细胞工程-第三节 植物细胞悬浮培养-医学文档
起始悬浮液的制备
转速30-150rpm 2-3cm冲程 防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡 悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
二 、培养方法
植物细胞悬浮培养通常深层培养可分为： 分批式．流加式．半连续式．连续 式．和灌注式五种。
1、分批培养/成批培养（Batch culture）
一、细胞悬浮培养原理
植物离体培养可产生愈伤组织, 将疏松型的愈伤组织悬浮在液体培养基 中并在振荡条件下培养一段时间后，可 形成分散悬浮培养物。
细胞的悬浮培养示意图
（一）悬浮培养Suspension culture
特点 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。
（2）流加工艺中的营养成分主 要分为三大类
① 葡萄糖：葡萄糖是细胞的供能物质和 主要的碳源物质。 ② 谷氨酰胺：谷氨酰胺是细胞的供能物 质和主要的氮源物质。 ③ 氨基酸．维生素及其他：主要包括营 养必需氨基酸．营养非必需氨基酸．一 些特殊的氨基酸如羟脯氨酸．羧基谷氨 酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养 成分如胆碱．生长刺激因子。
流加式培养是在批式培养的基础上，采 用机械搅拌式生物反应器系统，细胞初 始接种的培养基体积一般为终体积的 1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营 养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的 营养物或培养基，从而使细胞持续生长 至较高的密度。 整个培养过程没有流出或回收，通常在 细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回 收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，
（1）流加培养特点：
植物细胞悬浮培养技术
植物组织培养技术的过程：
离体的 脱分化 植物组 织、器 官、细 胞 愈伤 组织 再分化 丛芽、根 试 管 苗 小 植 株
鉴别培养基
微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发 生特定的化学反应，产生明显的特征变化
胚状体
细胞的全能性
生物体的细胞具有使后代细胞发育成完整 1、定义：
个体的潜能的特性。
2、原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特
有的全套遗传物质，都有发育成为完整个 体所必需的全部基因，从理论上讲，生物 体的每一个活细胞都应该具有全能性。
3、差异： 受精卵 ＞ 生殖细胞 ＞ 体细胞
植物细胞＞动物细胞
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生 物的基础理论和应用方面的研究
含有 途 不 同 划 分
基础培养基 加富培养基 选择培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养 物质制成的一类营养丰富的培养基 如血液、血清、酵母浸膏、动植物 组织液等 用来将某种或某类微生物从混杂的 微生物群体中分离出来 用于鉴别不同类型微生物的培养基
机械法(研或刮） 酶解法
机械法和酶解法比较 机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。 1. 细胞受到酶的伤害； 2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高； 4. 细胞不易破。
酶解法
2
由培养组织（愈伤组织）分离单细胞
材料：胡萝卜肉质根
步骤：
悬浮细胞培养操作规程
悬浮细胞培养操作规程
1.实验用具：悬浮细胞，PBS溶液，髂性培养皿，手术刀，培养盘，细胞培养组合体，细胞分悬液，生长因子挥发液。
2.悬浮细胞培养操作步骤：
（1）将悬浮细胞加入髂性培养皿中，加入适量标准溶液（PBS）搅拌均匀。
（2）取适量悬浮细胞用手术刀切丝状至细胞培养组合体内，加入生长因子挥发液再搅拌均匀。
（3）取适量细胞分悬液滴入培养盘，将制备好的悬浮细胞液滴入培养盘，放入27℃培养箱进行培养。
（4）定时观察并根据细胞生长状况应用液体调节培养
（5）使用适当的处理手段完成细胞培养。
植物细胞的悬浮培养技术
植物细胞的悬浮培养技术将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术，称为植物细胞悬浮培养。
它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术。
从50年代起，米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究，得到了万寿菊，烟草单细胞和细胞团的悬浮液。
1958年斯图尔德（F.C.Steward）等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养，并得到了完整的再生植株。
三十多年来，从试管的悬浮培养发展到大空量的发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培养。
80年代以来，作为生物技术中的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的产业体系。
悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料，也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础。
此外，还在育种、快速繁殖、原生质体培养，体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用。
由于植物细胞具有聚集在一起的特性，因此，在分裂后，往往不能像细菌细胞那样各自分开，而是大多以细胞团的形式存在，至今还不能培养完全是单细胞的县浮液。
要进行单细胞培养或选择细胞无性纱，需要进行平板培养，微室培养和看护培养。
本实验仅介绍最常用的县浮培养技术。
一.实验原理：植物离体培养可产生愈伤组织。
将疏松型的愈伤组织县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可形成分散县浮培养物。
良好的县浮培养物应具备以下特征：（1）主要有单细胞和小细胞团组成；（2）细胞具有量盛的生长和分裂能力，增殖速度快；（3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征，它们多呈等径形，核一质比率大，胞质浓厚，无液胞化程度较低。
要建成这样的县浮培养体系，首先需要有良好的起始培养物——迅速增殖的疏松型愈组织。
然后经过培养基成分和培养条件的选择，并经多次断代培养才能达到。
县浮培养细胞经长期继代培养后，染色体常有变异现象，细胞的再生能力也有逐渐降低的趋势，然而对于以上生产有用代谢特质为目的的大量培养，这种再生能力的降低不一定有不良影响。
悬浮细胞培养技术课件
悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。
进一步掌握细胞培养的操作技术。
实验原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。
为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架（四）其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪（五）试剂1640培养液、PBS操作步骤：1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。
从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。
2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。
3.首先观察培养板孔中培养液量。
用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。
再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。
4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。
5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。
吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。
6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。
7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。
8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。
9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。
二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。
一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。
紫茉莉悬浮细胞培养体系的建立
紫茉莉悬浮细胞培养体系的建立摘要：为建立紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)悬浮细胞培养体系，以紫茉莉无菌苗叶片诱导的愈伤组织为材料，筛选紫茉莉悬浮细胞的适宜培养体系。
结果表明，紫茉莉愈伤组织在MS + 2,4-D 1 mg L–1+ KT 0.5 mg L–1的液体培养基中悬浮继代培养3 ~ 4次，能得到稳定的悬浮细胞系。
培养基的pH 值为5.5 ~ 5.9，蔗糖浓度为30 g L–1更适合悬浮细胞的生长。
紫茉莉悬浮细胞的生长曲线大致呈S 型。
最佳继代培养时间是10 d，培养液的体积为40 mL 时，接种量为7.5 mL，可以较好地保持悬浮细胞系。
1 L培养液中可提取分泌蛋白(0.42 0.15) g。
这些有助于对悬浮细胞提取分泌蛋白的研究。
关键词：紫茉莉；悬浮细胞；悬浮培养；分泌蛋白1 材料和方法1.1材料供试紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)种子采自沈阳农业大学植物园。
按照白玉等的方法诱导培养紫茉莉愈伤组织。
取紫茉莉种子若干，冲洗剥皮后，用75% 乙醇浸泡8 min，0.1% 升汞消毒10 min，无菌水冲洗 4 次、浸泡1 h，剥掉内层种皮，接种于MS + NAA 0.1 mg L–1培养基中，在25℃，光照强度为12.5 ~ 25 mol m–2s–1的条件下培养，获得无菌苗。
将无菌苗叶片切成约0.5 cm x 0.5 cm 的小块，接种于MS + 2,4-D 1 mg L–1+ NAA 1 mg L–1+ KT1.5 mg L–1培养基上，在25℃，光照强度为12.5 ~25 mol m–2s–1条件下培养。
以上试验培养基的蔗糖浓度均为30 g L–1，琼脂为7 g L–1，pH 调至5.8。
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立一、概述烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，是植物组织培养领域中的一项重要研究。
烟草作为一种重要的经济作物，其组织培养技术的研究对于提高其生产效率、优化品质具有重要意义。
愈伤组织的诱导是植物组织培养的第一步，也是后续细胞悬浮培养、基因工程操作等的基础。
烟草愈伤组织的诱导，通常通过无菌操作，利用激素等生长因子刺激烟草叶片等外植体细胞脱分化形成。
这一过程不仅受到激素种类和浓度的影响，还受到光照、温度、湿度等培养条件的影响。
优化诱导条件，降低褐化等不利因素的影响，是烟草愈伤组织诱导研究的关键。
细胞悬浮培养体系的建立，则是进一步将愈伤组织转化为可用于大规模生产和基因操作的细胞悬浮液。
通过选择适当的培养基、调节生长条件、优化细胞悬浮密度等手段，可以实现烟草细胞的稳定增殖和高效表达。
本文旨在探索烟草愈伤组织的诱导条件以及细胞悬浮培养体系的建立方法，通过系统的实验设计和优化，为烟草组织培养技术的发展和应用提供理论基础和实践指导。
这一研究也将为其他植物的组织培养提供有益的参考和借鉴。
1. 烟草愈伤组织诱导与细胞悬浮培养体系的重要性烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，在植物组织培养、基因工程以及植物快繁等多个领域都具有重要的科学意义和实践价值。
愈伤组织的诱导是植物组织培养中的关键环节。
通过特定的培养基和培养条件，可以诱导烟草叶片等外植体脱分化形成愈伤组织。
这一过程不仅验证了植物细胞的全能性，而且为后续的细胞悬浮培养提供了适宜的起始材料。
细胞悬浮培养体系的建立为植物细胞的大规模培养和遗传转化提供了平台。
通过优化悬浮培养条件，可以获得大量生长状态良好的细胞，进而用于后续的基因转化、次生代谢产物生产等研究。
悬浮培养体系还可以用于筛选具有优良性状或抗性的细胞株系，为烟草育种提供新的途径。
烟草愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系在植物快繁方面也具有潜在的应用价值。
通过诱导愈伤组织再分化形成不定芽或胚状体，可以在短时间内获得大量的植株，从而实现烟草的快速繁殖。
盐生植物盐穗木悬浮细胞系的建立
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文献 ４ ３ ３ ０ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ９— １ ７ １ ８— ０ ６
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盐 生植 物 盐穗 木 悬浮细 胞 系的建 立
张霞， 张 富春
（ 新疆大学生命科学与技术学院／ 新 疆生物资源基 因工程重点实验室， 鸟鲁未齐 ８ ３ ０ ０ ４ ６ ）
摘
要： 【 目的】 组织和细胞培养能够为研究盐穗木的耐盐机制提供实验材料， 建立盐穗木悬浮细胞系， 从细
胞水平上揭示盐生植物盐穗 木的耐盐机制。【 方法 】 以成熟胚 为外植体 ， 探讨不 同培养基和激素 配 比对愈伤
植物悬浮细胞系的建立
青竹 生命学院 植物学2ห้องสมุดไป่ตู้10级
定义：植物细胞或小的细胞聚集体 在液体培养基上，于摇床上进行悬 浮培养。 意义 1 细胞可以不断增殖，形成高密度 的细胞群体，适于大规模的培养; 2 能够提供大量较为均匀的细胞， 为研究细胞的生长、分化创造方法 和条件。
研究中的应用：
1 高羊茅作为冷季型坪草，是极具开发潜力的 草坪品种。但存在叶片粗糙、夏季生长缓慢、 易遭杂草侵害。尝试利用遗传转化手段改良其 品质性状。胚性悬浮细胞系生长迅速、重复性 好、易于控制等，以此为受体获得转基因高羊 茅，可在短期内在细胞水平筛选预期突变体 2 水稻悬浮系具有繁殖速度快、颗粒均一、操 作方便等优点，成为水稻转基因的理想受体之 一，也是水稻原生质体高效分离、体细胞融合 和高效再生的关键。
植物细胞悬浮培养操作过程
悬浮培养特点
除气体和挥发性代谢物外， 其他都是密闭的 细胞生长呈S形曲线 需要不断继代
影响悬浮培养的因素
初始接种量 培养基种类及不同激素的浓度 蔗糖浓度 培养条件（温度、摇床转速） 继代周期
生理参数的测定确定继代时期
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ ㈤ 细胞鲜重 细胞干重 细胞分裂指数测定 细胞密度测定 细胞活力测定
细胞活力的测定方法
• • • • 相差显微术法 伊凡蓝法 FDA法 TTC法
继代方法
• 用注射器或移液管吸取一定量的含单细胞 和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新 鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。
操作注意事项： 对悬浮细胞继代时，进液口的孔径要小， 只能通过单细胞或小细胞团。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞团 沉降，再吸取上层悬浮液。 依次，多次，可建立良好的细胞悬浮液
3 野生甘草资源濒危与甘草需求量日益增加的 供求矛盾，悬浮细胞培养具有繁殖速度快、能 进行大规模培养和可提供较大量均一一致的植 物培养物、并进行植物次生代谢物的生产的优 点。 总之，建成的悬浮系细胞增殖速度快、重复性 好、在基因遗传转化、原生质体的分离、培养 和杂交、突变体筛选以及人工种子等方面有着 广泛的应用，成为现代植物新品种培育的有效 工具之一。
植物细胞悬浮培养
现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。
比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。
基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。
正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。
总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
●组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。
●细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
●器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化1.差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2.分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。